Etude par MCBL sur un biofilm préformé

II.11.2.1 Expression de la GFP

Pour visualiser les souches cliniques de P. aeruginosa à l’aide de la MCBL, un plasmide (pMF230) exprimant de manière constitutive la GFP est introduit dans chaque souche de P. aeruginosa par croisement triparental. Le plasmide pMF230 contient le gène

GFPmut2 (Cormack et al., 1996) et un marqueur de résistance à la carbénicilline.

L’appariement triparental est une forme de conjugaison bactérienne où un plasmide conjugatif présent dans une souche bactérienne aide à transférer un plasmide mobilisable présent dans une deuxième souche bactérienne vers une troisième.

Matériel et Méthodes

87 Dans notre cas, la conjugaison triparentale fait intervenir les 3 souches bactériennes suivantes: - une souche receveuse de P. aeruginosa (souche clinique) dans laquelle on souhaite introduire le plasmide mobilisable (pMF230),

- une souche donneuse de E. coli portant le plasmide mobilisable pMF230 et qui peut

utiliser les fonctions de transfert du plasmide conjugatif (Nivens et al., 2001),

- une souche mobilisatrice de E. coli (helper strain) portant le plasmide conjugatif pRK2013 codant pour les gènes requis dans la conjugaison et le transfert de l’ADN (Figurski et Helinski, 1979).

Les cultures bactériennes de E. coli pMF230 et E. coli pRK2013 sont obtenues après

une nuit d’incubation à 37 °C sous agitation dans un milieu LB contenant 300 mg/L de kanamycine. Deux cent cinquante µL d’une culture bactérienne de la souche clinique de P.

aeruginosa incubée une nuit sont ajoutés dans 25 mL de Tryptic Soy Broth (TSB) et cultivés

pendant 5 h à 42 °C et 150 tpm. Après incubation, une strie de cette suspension bactérienne est ensemencée sur une boîte de gélose LB. La souche clinique est mise en contact avec une

strie d’une culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pMF230 et une strie d’une

culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pRK2013. Les 3 stries se croisent en un même point sur la gélose. Après une nuit d’incubation de la gélose à 37 °C, quelques colonies au niveau du croisement des 3 stries sont prélevées et incubées sur une gélose Pseudomonas agar contenant 150 mg/L de carbénicilline afin de sélectionner les clones de P. aeruginosa

contenant le plasmide pMF230.

II.11.2.2 Etude sur un biofilm préformé dans une microplaque

Les biofilms sont formés dans une plaque 96-puits en polystyrène avec une base µclear (Greiner Bio-One, France).

CSA-13 : Deux cent cinquante µL de la SBI préparée dans un bouillon TSB sont ajoutés dans les puits de la microplaque et incubés à 37 ºC et 30 tpm. Après 1 h d’adhésion, le milieu est renouvelé afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après 24 h de formation du biofilm, les puits sont rincés et exposés à différentes concentrations de CSA-13 (0, 20, 50 et 100 mg/L) pendant 1 h. Les puits sont ensuite rincés et marqués par 200 µL du kit de

coloration BacLight™ Live/Dead^® (concentration finale en Syto9 et en IP : 30 µM et 120 µM

88 Peptides : L’effet de 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31, LL-19) sur les biofilms préformés par 6 souches de P. aeruginosa (les souches ATCC PAO1, MC099-450467, MC093-450507, PYO1, PYO2 et MC75-450457) est également étudié par MCBL. Dans cette expérimentation, les bactéries utilisées expriment la GFP et sont mises en culture dans un milieu TSB contenant 150 mg/L de carbénicilline pour maintenir le plasmide pMF230. La SBI est obtenue par dilution de la suspension bactérienne dans un milieu BBM supplémenté de casaminoacides 0,5 % (m/V). Deux cent cinquante µL de la SBI sont ajoutés dans les puits de la microplaque et incubés à 37 ºC et 30 tpm. Après 1 h d’adhésion, le milieu est renouvelé afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après 24 h de formation du biofilm, les puits sont rincés et traités par différentes concentrations des peptides (0, 20, 50 ou 100 µM) en présence de 10 µM d’IP, pendant 25 min.

Les biofilms sont rincés et observés par MCBL à l’aide d’un Leica SP5 (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Les biofilms sont scannés à une fréquence de 600 Hz à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau (63 X/ouverture numérique 1,2). Un faisceau de laser à Argon à 488 nm et un faisceau laser à diode 561 nm sont utilisés pour l’excitation. La fluorescence émise est collectée entre 500 nm et 550 nm et entre 570 et 700 nm. Les séries d’images collectées à l’aide du MCBL sont analysées par le logiciel Imaris software (Bitplane, Zurich, Switzerland).

De plus, une étude cinétique de l’effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une microplaque est réalisée sur la souche ATCC PAO1 exprimant la GFP. Après 24 h de formation du biofilm, 100 µL d’une solution de CSA-13 (concentration finale 100 mg/L) sont ajoutés aux puits en présence d’IP (concentration finale 60 µM). Des séries d’images sont scannées pendant 30 min à intervalle de 5 min à l’aide du microscope confocal. Un contrôle est réalisé sans ajout de CSA-13.

II.11.2.3 Etude sur un un biofilm préformé dans un réacteur CDC

Principe

Les réacteurs CDC (Biosurface Technologies Inc., Bozeman, MT) sont développés par

le Center for Disease Control and Prevention et acceptés comme méthode standard par The

Figure 37 : Réacteur CDC

A B C

Figures A et B : Photographies du montage du réacteur CDC. Le bidon contenant le milieu

nutritif stérile est relié au bécher par un tube en silicone. Une pompe péristaltique permet l’apport du milieu à un flux constant. Un agitateur magnétique entraîne l’application de forces de frottement à la surface du biofilm formé sur les coupons en verre. L’excès de milieu est déversé via la goulotte dans le bidon de vidange. Figure C : Représentation schématique d’un réacteur CDC. Les biofilms se développent à la surface interne des coupons exposés aux forces de frottement du milieu par agitation magnétique (Williams et al., 2011).

89 biofilms de P. aeruginosa (ASTM, 2012). Il s’agit d’une méthode utilisée en routine pour étudier la formation de biofilms exposés aux frottements et à un apport continu de milieu, pouvant être adaptée à l’étude de différents microorganismes (Goeres et al., 2005). Les réacteurs comportent 8 porteurs de coupons en polypropylène suspendus à partir d’un couvercle. Les supports en polypropylène sont capables de porter 3 coupons chacun d’un diamètre de 0,9 cm sur lequel le biofilm peut se développer. Le couvercle avec les détenteurs de coupons est monté dans un récipient en verre d’une capacité de 1 L et muni d’une goulotte

de vidange de façon à ce que le volume final du contenant soit maintenu à environ 350 mL.

Le milieu de culture stérile, maintenu dans un récipient de 20 L, est apporté par un tube en silicone vers le bécher à l’aide d’une pompe péristaltique. La rotation d’une palette dans le bécher, par agitation magnétique, permet le mélange constant du milieu et l’application d’une force de frottement uniforme à la surface du coupon. Le biofilm se développe sur la face intérieure du coupon exposée aux forces de frottement. L’excès de milieu est déversé par la goulotte dans un bidon de vidange.

Protocole expérimental

Quelques colonies isolées sont prélevées d’une culture solide et incorporées dans 100 mL de milieu TSB dilué 100 fois (300 mg/L). Pour les souches exprimant la GFP ou la RFP, 150 mg/L de carbénicilline sont ajoutés. La culture est incubée une nuit à 37 ºC et 120 tpm. Le lendemain, 1 mL de la culture est prélevé et transvasé stérilement dans le réacteur contenant 500 mL de milieu TSB (300 mg/L) et 150 mg/L de carbénicilline pour les souches GFP ou RFP. Le réacteur est incubé pendant 24 h à température ambiante et à 120 tpm. Après 24 h, le bidon contenant 20 L de milieu TSB à une concentration finale de 100 mg /L est relié au réacteur afin de permettre l’apport en débit continu des nutriments. La pompe est enclenchée pour atteindre un taux de flux de 12 mL/min. Le réacteur est également connecté à un bidon de vidange permettant d’éviter le débordement et ainsi de maintenir dans le réacteur un volume constant de 350 mL de bouillon. Après 24 h de formation du biofilm, les coupons de verre sont soigneusement détachés de leur support et traités.

Biofilm ATCC PAO1-GFP : Les biofilms formés sur la face interne du coupon sont rincés à l’aide d’eau distillée et exposés à 100 µL du produit à tester (CSA-13 ou peptides) et 100 µL d’IP (concentration finale 60 µM) pendant 25 min.

Biofilm ATCC 15442 : Les biofilms sont exposés à 100 µL du produit à tester (CSA-13 ou peptides) pendant 25 min. A la fin du traitement, les coupons sont rincés et

Matériel et Méthodes

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marqués par 100 µL du kit de coloration BacLight™ Live/Dead^® (concentration finale

en Syto9 et IP : 15 µM et 60 µM respectivement) pendant 25 min.

Biofilm ATCC PAO1-RFP : Les biofilms sont exposés pendant 25 min à 150 µL d’un analogue fluorescent du CSA-13, le CSA-13 marqué avec 1 % de Bodipy.

Après traitement, les coupons sont rincés et observés à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau (63x/ouverture numérique 0,9).