II. METHODES
II.12 TOXICITE SUR CELLULES EUCARYOTES (HUVEC)
II.12.1 Evaluation de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH)
Principe
La LDH est une enzyme cytoplasmique d’environ 135 kDa qui catalyse l’oxydation du
lactate en pyruvate. La réaction s’accompagne de la réduction du NAD+
(accepteur d’électrons) en NADH et est réversible. L’enzyme intracellulaire est présente dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes. Le pH optimal de la réaction d’oxydation du lactate en pyruvate est de 8,8 à 9,8 ; celui de la réaction inverse est de 7,4 à 7,8. La température optimale est comprise entre 30 et 37 °C.
La cytotoxicité d’une molécule peut être évaluée par dosage de l'activité enzymatique de la LDH dans le surnageant cellulaire d'une suspension de cellules exposées à la molécule. La présence de la LDH dans le milieu extracellulaire témoigne de la destruction des membranes plasmiques et donc d’une perturbation de l’intégrité cellulaire. L’essai de la libération de la LDH s’inspire de la méthode développée par la Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology (1974). L'activité enzymatique est mesurée par suivi de la cinétique d’absorbance à 340 nm, pH 7,4 et 30 °C, après ajout dans le milieu extracellulaire de NADH et de pyruvate. Dans ces conditions l’enzyme réduit le pyruvate en
lactate et la réaction est accompagnée de l’oxydation du NADH en NAD+
. Une diminution d'absorbance au cours du temps indique la consommation de NADH (le NADH absorbe la lumière à 340 nm) et donc une souffrance cellulaire.
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Protocole expérimental
Les cellules Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées dans une plaque 96-puits à une
concentration de 1.106 cellules/mL en présence de 100 µL de milieu Endothelial
Growth Medium (EGM) pendant minimum 12 h. Le lendemain, le milieu est aspiré et 90 µL
de milieu E-Total (NaCl 147 mM ; KCl 2 mM ; HEPES 10 mM ; glucose 12 mM ; MgCl2 1
mM ; CaCl2 2 mM ; pH 7,4) sont ajoutés aux puits. Dix µL de différentes concentrations du
produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 3 % ou peptides) sont ajoutés aux puits. Après 10 min d’incubation à 37 °C, la plaque est centrifugée pendant 10 min à 1200 tpm et 30 µL de surnageant sont collectés et transférés dans une nouvelle microplaque. Le contenu en LDH du surnageant est dosé selon Métioui et al. (1994). Une solution de NADH (TRIS 56 mM ; EGTA 5,6 mM ; β-NADH 170 µM) est ajoutée aux puits de la seconde plaque. Juste avant le début du dosage, une solution de pyruvate à 1,22 mM (concentration finale) est ajoutée aux puits. L’activité de la LDH est mesurée à 30 °C pendant 20 min en suivant l’absorbance à 340 nm. Les témoins négatifs sont obtenus par utilisation du surnageant de cellules non traitées (après centrifugation). L’activité maximale de la LDH est mesurée de la même manière, après cytolyse des HUVEC par sonication. Pour chaque essai, les résultats sont obtenus par calcul du taux de diminution de l’absorbance provoquée par l’oxydation du NADH (partie linéaire de la courbe). Chaque valeur est ensuite corrigée par la soustraction des valeurs du témoin négatif et la libération de la LDH est exprimée comme pourcentage du contenu cellulaire total.
II.12.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium
Principe
Le bromure d’éthidium est une molécule de 394 Da incapable de traverser la membrane des cellules eucaryotes saines. Lors d’une perturbation de la membrane plasmique, le dérivé fluorescent entre dans la cellule. Au sein de la cellule, la molécule se lie aux acides nucléiques doubles brins où, lorsqu’elle est exposéeà des rayons de lumière visible, elle émet un signal fluorescent pouvant être détecté et mesuré. Ainsi, la perméabilisation de la membrane cellulaire est mise en évidence par mesure de l’augmentation de la fluorescence.
Figure 38 : Réduction du MTT en formazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale
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Protocole expérimental
Les résultats de la toxicité cellulaire du CSA-13 sont affinés par un essai de la perméabilité de la membrane au bromure d’éthidium (Di Virgilio et al., 1989). Les cellules HUVEC sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de
CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées à une concentration
de 1.106 cellules/mL dans une plaque 96-puits à fond noir dans leur milieu de culture pendant minimum 12 h. Dix min avant le début de la lecture, le milieu est aspiré et une solution de bromure d’éthidium est ajoutée aux puits à une concentration finale de 10 mg/L. L’intensité de la lumière émise à 590 nm, après excitation à 540 nm, est mesurée à 37 °C et à intervalles de temps de 15 sec. Cinq min après le début de l’essai, les cellules sont exposées à des concentrations croissantes en produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 3 % ou peptides). L’augmentation de l’intensité de la fluorescence est lue pendant 50 min. Les cellules sont ensuite perméabilisées par une solution de Triton X-100 à 0,5 % et la lecture poursuivie afin de mesurer la captation maximale de bromure d’éhidium.
II.12.3 Evaluation de l’activité mitochondriale (test MTT)
Principe
L’ajout d’un sel de tétrazolium, le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium (MTT), dans le milieu de culture permet de quantifier l’activité mitochondriale des cellules et donc d’estimer la viabilité cellulaire. Lors d’une activité mitochondriale efficace, l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase réduit le MTT soluble en cristaux de formazan insolubles en milieu aqueux. La quantification de cristaux de formazan, par mesure de l’absorbance, est proportionnelle au nombre de cellules métaboliquement actives.
Protocole expérimental
La toxicité mitochondriale des produits à tester (CSA-13, seul ou en présence d’acide pluronique F-127 6 % et peptides) est évaluée par un test colorimétrique MTT. Les cellules HUVEC sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées une nuit à une concentration de 1.106 cellules/mL dans une plaque 96-puits dans leur milieu de culture. Le lendemain, le milieu est écarté et les cellules sont exposées à différentes concentrations de
Matériel et Méthodes
93 produit à tester. Les cellules sont incubées pendant 20 min à 37 °C. Après incubation, le milieu est écarté et les puits sont remplis par 100 µL d’une solution de MTT à 1 mg/mL. La plaque est incubée à 37 °C pendant 3 h 30. Les cristaux de formazan formés par les cellules sont solubilisés à l’aide de DMSO et l’absorbance est lue dans notre lecteur de microplaques à 540 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’absorbance mesurée dans les conditions contrôles (absence des produits à tester).
II.12.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial
Principe
Le tétraméthylrhodamine éthyl ester (TMRE) est un agent fluorescent s’accumulant au sein des mitochondries intactes selon le potentiel électrique de la membrane mitochondriale interne. Le potentiel de membrane mitochondrial est un composant important de la force promotrice responsable de la synthèse d’ATP par la mitochondrie. Les cellules possédant un potentiel de membrane mitochondrial négatif et incubées en présence de TMRE accumulent ce dernier dans leurs mitochondries intactes (Scaduto et Grotyohann, 1999) et une augmentation de la fluorescence est détectée. En cas de dissipation du potentiel de membrane mitochondrial, l’accumulation de TMRE dans la mitochondrie est entravée et on observe une diminution de la fluorescence cellulaire.
Protocole expérimental
La mesure du potentiel de membrane mitochondrial après traitement par le CSA-13, seul ou en présence du dérivé pluronique F-127, est évaluée sur les cellules HUVEC selon le protocole décrit par Date et al. (2005). Les cellules HUVEC sont cultivées dans des flasques
T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont détachées par 10
% de trypsine-EDTA et incubées une nuit dans une plaque 24-puits à une confluence de 50 à 60 %. Le lendemain, le milieu de culture est aspiré et les cellules adhérentes sont mises en présence de 1 mL des différentes concentrations en CSA-13, seul ou en association avec le dérivé pluronique F-127 à 5 %, pendant 1 h à 37 °C. Le CSA-13 et l’acide pluronique F-127 sont dilués dans un tampon PBS à différents pH (pH 6, 7 et 8) afin d’étudier l’influence du pH sur l’effet du CSA-13. A la fin de l’incubation, le milieu est aspiré et les cellules sont exposées à 200 nM de TMRE pendant 1 h à 37 °C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec un tampon PBS. Un mL de Triton X-100 1 % (V/V) est ajouté aux puits afin de lyser les
94 cellules. Deux cent µL sont prélevés et mis en plaque 96-puits à fond noir. La fluorescence est lue à l’aide de notre lecteur de microplaques aux longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de 544 nm et 590 nm respectivement.