Adhésion et formation du biofilm
Nous avons étudié la cinétique d’adhésion et de formation du biofilm par 8 souches de
P. aeruginosa à l’aide de deux méthodes, la technique du BFRT® et la technique de coloration
par le CV.
Nos résultats indiquent que la technique du CV détecte le développement du biofilm des 8 souches mais à des temps différents. Quatre souches développent un biofilm après 6 h. Les 4 autres souches développent un biofilm après 24 h. Après cette phase initiale, l’absorbance du CV augmente avec le temps et après 48 h toutes les souches montrent une forte coloration par le CV. Ces observations sont cohérentes avec la vision actuelle que les bactéries en général, et P. aeruginosa en particulier, résident de manière prédominante sous la forme d’un biofilm (Costerton, 2001).
Nous n’avons pas observé de relation entre l’importance du biofilm après 48 h et la capacité des souches à former un biofilm après 6 h : la souche PYO2 qui a une absorbance faible après 6 h forme un des biofilms les plus importants après 48 h. A l’opposé, les souches ATCC 9027 et ATCC 15442 adhèrent fortement à la surface du puits après 6 h mais ne forment pas de biofilm important après 48 h. Ces résultats confirment également que le développement d’un biofilm procède par différentes étapes distinctes (O’Toole et al., 2000).
Après 6 h nous n’avons pas observé de relation entre le caractère mucoïde ou non mucoïde des souches et leur capacité à initier rapidement le développement d’un biofilm :
seule une des 4 souches mucoïdes (MC093-450507) est fortement colorée par le CV après 6
h. Ces résultats sont en accord avec Hay et ses collaborateurs qui ont montré que durant la phase initiale d’attachement, la souche non mucoïde PAO1 a une adhésion plus importante que toutes les souches mucoïdes testées (Hay et al., 2009). Après ce stade initial, la vitesse de formation du biofilm est significativement plus importante pour les souches mucoïdes que pour les souches non mucoïdes. Ce résultat confirme l’augmentation de la production d’exopolysaccharides par P. aeruginosa durant la formation du biofilm (Hoyle et al., 1993).
La cinétique d’adhésion des bactéries au fond du puits, étudiée par la technique du BFRT®, souligne également l’hétérogénéité au sein des 8 souches de P. aeruginosa. Quatre
Caractérisation phénotypique des souches
114 souches immobilisent complètement les billes en moins de 90 min. Les 4 autres souches n’adhèrent pas aux puits après 90 min. La souche ATCC PAO1 est la souche qui s’est attachée le plus rapidement au fond du puits et qui peut immobiliser les billes de manière significative après 45 min seulement. Le dénombrement des bactéries adhérentes de la souche ATCC PAO1 a révélé que 3 fois plus de bactéries sont attachées au fond du puits après 30
min en comparaison avec le nombre de bactéries attachéesaprès 10 min.
Macé et al. (2008) et Tré-Hardy et al. (2009) ont également suggéré que les cinétiques de formation du biofilm par P. aeruginosa varient parmi les souches mais que toutes les souches sont capables de former un biofilm après une incubation plus longue.
Dans ce travail, nous avons comparé la capacité de 8 souches de P. aeruginosa à adhérer à une surface et à former un biofilm par deux techniques basées sur la culture des bactéries en microplaque. La technique du CV est une méthode assez laborieuse et la procédure longue et non standardisée (nombre d’étapes de lavages, conditions de lavage, durée de coloration, concentration en CV, …). Par ailleurs cette technique ne mesure pas la viabilité cellulaire dans le biofilm mais la quantité de biomasse car aussi bien les cellules (vivantes ou non) que la matrice sont colorées par le CV (Pitts et al., 2003). Cette technique a été décrite pour la première fois par Christensen et al. (1985), améliorée par Stepanovic et al. (2000) et est actuellement la plus utilisée pour quantifier l’adhésion bactérienne et la
formation de la biomasse. D’après nos résultats, la méthode du BFRT® semble aussi efficace
que le dénombrement classique des bactéries pour étudier l’adhésion des bactéries et la formation rapide du biofilm. Les deux populations de souches (formant rapidement et lentement un biofilm) déterminées avec le BFRT® sont similaires au groupe caractérisé par la technique de coloration au CV après 6 h. La cohérence dans les résultats obtenus avec les deux méthodes confirme que toutes les deux mesurent la phase initiale réversible de l’adhésion. Une bonne corrélation entre le BFRT®
et le CV a également été avancée par Crémet et ses collaborateurs dans l’étude de la production du biofilm par différentes souches cliniques de E. coli (Crémet et al., 2013). La technique du BFRT® donne des résultats significatifs plus rapidement que la méthode basée sur la coloration des bactéries et de la matrice organique par le CV qui n’a pas montré de biofilm avant 4 h. Récemment, Liesse
Iyamba (2012) indique que la méthode du BFRT® est plus efficace et plus indiquée pour une
évaluation rapide de l’adhésion bactérienne par différentes souches de S. aureus en comparaison avec la technique de coloration au CV qui nécessite des temps d’incubation plus
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longs pour observer une augmentation significative de l’absorbance. La technique du BFRT®
nous semble dès lors plus sensible que la technique de coloration au CV pour la détection de l’adhésion des bactéries et des stades initiaux de la formation du biofilm. La différence de sensibilité des deux méthodes et la meilleure sensibilité du BFRT® peut être expliquée par l’absence des étapes de lavage dans cette procédure et par le fait que cette méthode requiert
peu de manipulation. Le BFRT® semble donc être une méthode simple et rapide spécialement
adaptée à la détermination de la capacité de P. aeruginosa à initier la formation du biofilm. Elle a été utilisée avec succès dans l’étude de la formation des biofilms par des bactéries (Chavant et al., 2007), des microalgues (Badel et al., 2011) et même pour étudier des polysaccharides (Badel et al., 2008).
Cependant, pour étudier des biofilms plus importants et à des stades plus avancés, la technique de coloration au CV est préférée. Malgré les avantages du BFRT®, cette méthode est rapidement saturée et ne peut donner une estimation précise de biofilms importants. Cette conclusion rejoint celle de Liesse Iyamba et al. (2011).
En outre, nous rencontrons certains inconvénients lors de l’utilisation de la technique
du BFRT®. L’étude de l’effet d’un composé antimicrobien sur la formation du biofilm par le
BFRT® nécessite un contrôle préalable de l’effet de cet agent sur les billes magnétiques. En absence d’effet sur la mobilité des billes, le BFRT® permet l’étude de l’activité de divers composés sur la formation du biofilm. Nous avons cependant mis en évidence une interaction entre les billes magnétiques chargées positivement et négativement et le CSA-13 ou les PAM dérivés du LL-37 rendant l’incorporation de ces composés dans l’étude sur la formation du biofilm impossible (données non montrées). Ces interactions entre les billes et les peptides ont été observées même à de très faibles concentrations en LL-37 (inférieures à 1 µM). Les forces électrostatiques entre les billes chargées et le composé (CSA-13 ou peptide LL-37) ne seraient pas responsables de cette interaction étant donné que des interférences similaires ont été notées avec les billes portant des charges opposées. Ces interactions inattendues entre un composant du milieu de culture et les billes ont été observées précédemment (Liesse Iyamba
et al., 2011). Les auteurs démontrent que l’ajout de la protéinase K dans le milieu du BFRT®
provoque une diminution importante de l’IFB suggérant que la suspension d’enzyme immobilise les billes ou interfère avec leur sensibilité à l’aimant. Badel et son équipe constatent que certains milieux de culture peuvent interférer avec la mobilité des billes et que l’addition d’une très faible concentration de Tween 20 au milieu (0,002 %) inhibe ces
Caractérisation phénotypique des souches
116 interférences (Badel et al., 2011). Badel et al. (2008) démontrent aussi que la pronase bloque la migration des billes et rend les analyses par le BFRT® difficiles.
Mobilité bactérienne et rhamnolipides
Le swarming est une mobilité de surface affectée non seulement par le flagelle mais également par les pili de type IV et les rhamnolipides (Köhler et al., 2000). La mobilité de type swarming et la production de rhamnolipides ne peuvent distinguer la population de bactéries s’attachant rapidement à la surface du fond du puits des populations adhérant lentement. La souche ATCC PAO1 a la plus grande mobilité de type swarming. Les autres
souches présentent une mobilité swarming beaucoup moins importante et leur mobilité n’est
pas liée à leur capacité à s’attacher rapidement à une surface ou à former un biofilm. Les rhamnolipides sont des molécules amphipatiques composées d’un lipide hydrophobe et d’un sucre hydrophile. Ils sont les constituants principaux des biosurfactants produits par P.
aeruginosa (Soberon-Chavez et al., 2005). Ils favorisent le swarming car ils agissent comme
agents mouillants qui réduisent la tension de surface (Caiazza et al., 2005). Trois souches (ATCC 9027, ATCC 15442 et MC099-450467) ne produisent pas de rhamnolipides et pour la souche PYO1 la production de rhamnolipides n’est pas significative. Parmi les 4 autres souches, la souche MC093-450507 est la productrice de rhamnolipides la plus importante. Cette séquence n’est pas corrélée avec la capacité des différentes souches à initier le
développement du biofilm. Le swimming est une autre forme de mobilité qui est dépendante
du flagelle (Murray et Kazmierczak, 2006). Excepté pour la souche ATCC PAO1 qui a une activité très importante, la différence au sein des autres souches est plus faible. Les 4 souches avec la mobilité de type swimming la plus importante sont les 4 souches avec un BFRT® positif ou qui forment rapidement un biofilm avec la méthode de CV. Ceci est cohérent avec la vision actuelle selon laquelle le flagelle est impliqué dans les étapes initiales du développement du biofilm (O’Toole et Kolter, 1998b). Nos résultats confirment donc l’importance du flagelle dans la phase d’attachement initial pour la formation du biofilm.
Sensibilité à la tobramycine
Les jeunes biofilms (24 h) formés par les souches non mucoïdes sont significativement plus affectés par la tobramycine que les biofilms mucoïdes. Après 24 h, la formation des biofilms par les souches mucoïdes versus non mucoïdes n’est pas significativement différente par la technique de coloration au CV. Cette différence devient significative après 48 h.
117 Aucune corrélation ne peut être établie entre la sensibilité des souches à la tobramycine et leur capacité à former un biofilm important après 24 h (CV) ou à adhérer à une surface (BFRT®).
Activité protéolytique et élastolytique
L’activité élastolytique diffère au sein des 8 souches étudiées. Les deux souches secrétant la plus grande quantité d’élastase sont les souches mucoïdes MC75-450457 et ATCC PAO1. En accord avec ces résultats, ces deux souches sont également parmi les 3 souches ayant la plus grande activité protéolytique. Pratiquement aucune activité élastolytique n’est détectée chez les autres souches. Les souches MC093-450507, ATCC 9027 et ATCC 15442 présentent une activité protéolytique importante probablement liée à d’autres protéases que l’élastase.
Production d’AHL
Las et rhl sont 2 systèmes autoinducteurs majeurs contribuant au QS et exprimés par
P. aeruginosa. LasI et RhlI sont les enzymes qui synthétisent 3-oxo-C12-HSL et C4-HSL respectivement. Après liaison à leur facteur de transcription respectif (LasR et RhlR), les AHL activent la transcription de nombreux gènes (plus de 6 % du génome entier pour LasR) (Schuster et al., 2003). Pour estimer la production de C4-HSL, nous avons utilisé une souche de P. aeruginosa incapable de produire des C4-HSL par absence de rhlI. Cette souche surexprime rhlR la rendant très sensible à des C4-HSL exogènes. En réponse à l’activation de RhlR, cette souche environnementale synthétise un pigment bleu facilement détectable. Quatre souches produisent des quantités importantes de C4-HSL. Il n’y a pas de différence
évidente entre les souches mucoïdes et non mucoïdes. La souche A. tumefaciens
NTL4(pZLR4) utilisée pour détecter Cn≥6-HSL a été conçue par Cha et ses collaborateurs (1998). Elle exprime TraR, un facteur de transcription qui, contrairement à LasR et RhlR, est plutôt non spécifique et répond à différentes AHL avec un groupement acyle plus long que 4 atomes de carbone (Cha et al., 1998). Ces résultats sont confirmés par CCM. L’analyse des AHL activant TraR révèle 3 bandes distinctes qui migrent avec 3-oxo-C8-HSL, 3-oxo-C10 -HSL et 3-oxo-C12-HSL. Ces 3 AHL sont synthétisées par LasI. Il est largement accepté que les 2 systèmes du QS de P. aeruginosa sont principalement sensibles à C4-HSL (RhlR) et à C10- et 3-oxo-C12-HSL (LasR). Le rôle de 3-oxo-C8-HSL ou 3-oxo-C10-HSL reste incertain. Il a été rapporté récemment que la sensibilité de P. aeruginosa à 3-oxo-C9- ou 3-oxo-C10-HSL est régulée par la pompe à efflux MexAB-OprM (Minagawa et al., 2012). Cette pompe permet l’efflux de 3-oxo-AHL avec un acide gras à longue chaîne. Des mutations de cette protéine
Caractérisation phénotypique des souches
118 peuvent contribuer à l’accumulation intracellulaire de 3-oxo-C10-HSL à des concentrations suffisantes pour activer LasR. Le 3-oxo-C8-HSL qui diffuse hors de la bactérie, pourrait interagir avec des protéines transcriptionnelles d’autres bactéries à Gram négatif pourvues
d’un régulateur de la transcription sensible à cette molécule et contribuer au développement
de biofilms multi-espèces (Riedel et al., 2001).
Séquençage
Considérant que des mutations spontanées des gènes du QS, particulièrement lasR, sont fréquentes (Sandoz et al., 2007), nous avons séquencé 4 gènes du système : les gènes
lasI, lasR, rhlI et rhlR. L’analyse des séquences des 4 gènesrévèle de fortes analogies avec la souche P. aeruginosa LESB58. La souche hypervirulente LESB58 a été identifiée pour la première fois en 1996 chez des patients atteints de mucoviscidose (Cheng et al., 1996). Nos résultats suggèrent que 7 souches étudiées dans ce travail sont probablement dérivées de la souche P. aeruginosa LESB58. Trois gènes de ces 7 souches (lasI, rhlI et rhlR) sont très similaires aux gènes de la souche LESB58. LasR est le seul gène avec des mutations affectant la structure de la protéine. Ces résultats sont cohérents avec des observations rapportant que les souches cliniques de P. aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose montrent un grand taux de mutations du gène lasR : après colonisation des poumons de ces patients, 60 % des isolats portent une mutation de lasR (Smith et al., 2006). Dans notre étude, 2 souches (PYO1 et MC099-450467) ont des mutations provoquant une altération majeure de la protéine (codon STOP prématuré et expression d’une protéine raccourcie ; décalage du cadre de lecture et changements dans la structure primaire de la protéine). Ces altérations majeures de LasR pourraient expliquer la faible quantité d’AHL produites par les souches PYO1 et MC099-450467 (plus d’amplification du système par auto-induction). Trois autres souches ont une mutation faux sens dans l’hélice-α impliquée dans la liaison de LasR à l’ADN (Bottomley et al., 2007). Une de ces mutations (V208M dans la souche MC093-450507) affecte un résidu conservé mais le rôle de cette valine n’a pas été défini (Bottomley et al., 2007). Sa substitution par un autre acide aminé hydrophobe ne devrait pas affecter l’activité de la protéine. Les deux autres mutations concernent la méthionine 212. Cet acide aminé appartient à une hélice-α interagissant avec l’ADN (Bottomley et al., 2007). Il est substitué soit par une valine, un autre acide aminé hydrophobe (ATCC 15442), soit par une thréonine, un résidu polaire (ATCC 9027). Cette mutation peut expliquer la faible quantité d’AHL observée avec cette souche. Deux gènes lasR sont amplifiés dans la souche de référence ATCC PAO1. Un de ces gènes a une délétion qui recouvre la majeure partie du fragment
119 amplifié. L’expérience est répétée avec une autre souche ATCC PAO1 obtenue par le Dr O. Vandeputte (Vandeputte et al., 2011). Seul un amplicon lasR est observé avec cette souche (données non montrées) confirmant qu’une mutation est apparue dans notre souche ATCC PAO1 pendant la conservation. Des mutations spontanées de la souche ATCC PAO1 apparaissant après plusieurs passages ont été décrites par Klockgether et al. (2010). Sandoz et al. (2007) suggèrent que ces mutations apparaissent sous des conditions dans lesquelles les nutriments sont en abondance et les signaux de QS absents. D’après ces auteurs, une souche compétente en QS et une souche déficiente en QS, souche « tricheuse », pourraient coexister dans une population hétérogène.
Corrélations AHL et phénotype
La présence d’AHL dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose et infectés par P. aeruginosa a été remarquée pour la première fois par Singh et al. (2000). Ces résultats ont été en partie confirmés par Middleton et ses collaborateurs qui ont détecté et testé dans les expectorations de certains patients atteints de mucoviscidose des AHL avec des groupements acyls de 4 à 12 carbones (Middleton et al., 2002). Erickson et ses collègues ont rapporté que P. aeruginosa synthétise 3-oxo-C12-HSL dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose (Erickson et al., 2002). A partir de tels résultats il a été suggéré que la formation d’un biofilm par P. aeruginosa, et donc sa pathogénicité, est corrélée avec sa capacité à libérer des AHL (Høiby et al., 2010b).
Nous avons donc comparé certaines caractéristiques phénotypiques des 8 souches avec leur capacité à produire des AHL. Nos résultats n’ont pas illustré de corrélation entre la production de Cn≥6-HSL et l’adhésion des bactéries (BFRT®), leur production de biofilm (CV), leur sensibilité à la tobramycine, leur sécrétion de protéases ou leur production de rhamnolipides. Des résultats similaires ont été démontrés par Perez et al. (2013) qui n’ont pas détecté de lien dans la capacité de souches cliniques et non cliniques de P. aeruginosa à former un biofilm et à produire des AHL. Nous avons cependant mis en évidence une corrélation entre la production de C4-HSL et la production de rhamnolipides. Cette corrélation est secondaire à la régulation de l’opéron rhlAB par le complexe RhlR-C4-HSL (Ochsner et Reiser, 1995). La production de C4-HSL est aussi corrélée avec la formation d’un biofilm (CV) mais pas avec l’attachement initial des bactéries sur une surface abiotique (BFRT®), la sensibilité à la tobramycine ou la sécrétion de protéases.
Caractérisation phénotypique des souches
120 Nos résultats suggèrent dès lors que l’essai de la production des C4-HSL a une certaine valeur prédictive sur la tendance d’une souche à former un biofilm. En outre, ils illustrent la variabilité de la production d’AHL et la difficulté de prédiction du comportement des souches.
Conclusion
Dans la première partie de ce travail, nous soulignons la diversité phénotypique et génotypique des 8 souches de P. aeruginosa et dès lors la complexité pour l’étude de traitements potentiels sur ces souches. La capacité d’une souche à adhérer rapidement à une surface ou à former un biofilm important ne semble pas prédire sa sensibilité à un antibiotique. Etant donné la difficulté de prédiction du comportement de la souche en fonction de son phénotype, l’étude de l’activité d’un agent antimicrobien sur une large collection de souches permettra de s’approcher au mieux de l’effet réel attendu chez le patient.
La suite du travail consistera à évaluer le potentiel de nouveaux agents antimicrobiens dans le traitement d’infections à P. aeruginosa liées à la formation d’un biofilm, pour contourner l’émergence de la résistance développée avec les antibiotiques conventionnels.
L’étude de l’activité d’un nouvel antibiotique potentiel (CSA-13) sera réalisée sur les biofilms formés par les 8 souches de P. aeruginosa afin d’élargir le panel des phénotypes et génotypes des souches étudiées.
Un screening de l’effet antibactérien et antibiofilm de peptides cationiques dérivés du LL-37 sera réalisé sur la souche la plus documentée dans la littérature sur la mucoviscidose, la souche ATCC PAO1. Etant donné ses propriétés d’adhésion très rapide et importante au fond du puits en comparaison aux autres souches (BFRT®), ainsi que sa capacité à former un biofilm important (CV), la souche ATCC PAO1 semble être un bon modèle pour l’étude d’un screening de l’activité d’agents antimicrobiens. Cette souche est également celle dont les mobilités swimming et swarming sont les plus importantes et qui produit une grande quantité de rhamnolipides, de protéases (dont l’élastase) et d’AHL, autant de facteurs susceptibles de contribuer à la virulence du pathogène.
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