ETUDE SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES

II.9.1 Détermination de la CMI et de la CMB

La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est effectuée dans des microplaques par la technique de microdilution de 2 en 2 en bouillon Mueller Hinton Broth ajusté en ions Ca²⁺ et Mg²⁺ (CAMHB), conformément au protocole du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003). Les puits contiennent 100 µL de chaque concentration de produit à tester par dilution de 2 en 2 à partir du puits initial. Les puits de la microplaque sont inoculés par 100 µL de la SBI. Deux puits contenant le bouillon de culture sont inclus dans le test. L’un des puits est inoculé avec le microorganisme testé (témoin positif) et l’autre contient uniquement 200 µL de CAMHB et sert de témoin négatif afin de valider la stérilité du milieu. Les résultats sont lus, après une incubation de la microplaque à l’étuve à 35 °C pendant 24 h, par observation visuelle de l’absence de turbidité en comparaison avec le contrôle négatif. Afin de déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB), les puits clairs de cette même microplaque sont repiqués à l’aide d’anses stériles de 10 µL, ensuite étalés sur milieu MH solide et incubés 24 h à 35 °C avant la lecture des résultats.

II.9.2 Essai de viabilité par perméabilisation au 1-N-phénylnaphtylamine

(NPN)

Principe

La molécule de NPN émet une fluorescence importante lorsqu’elle passe d’un environnement polaire, par exemple le milieu de culture, vers un compartiment hydrophobe, par exemple la membrane externe de la bactérie. La mesure d’une augmentation de la fluorescence reflète ainsi la perturbation de la membrane liée à l’insertion du composé dans la membrane.

Protocole expérimental

L’étude de la perméabilisation membranaire de P. aeruginosa au NPN est basée sur une technique décrite précédemment (Loh et al., 1984) et est étudiée sur les souches ATCC PAO1, MC093-450507 et PYO1. Les SBI sont centrifugées à 3000 tpm pendant 10 min et les

82 cellules sont suspendues dans un tampon HEPES 5 mM (pH 7,35) contenant 10 mM d’azide de sodium afin d’atteindre une DO 600 nm de 0,5. Cette nouvelle suspension cellulaire est laissée au repos pendant 30 à 60 min à température ambiante avant l’ajout des réactifs. Une solution stock de NPN est préparée par solubilisation du réactif dans de l’acétone. Une microplaque à fond noir (96F Nunclon Delta Black Microwell SI) est inoculée avec la suspension de cellules et le NPN est ajouté à une concentration finale de 10 µM. Différentes concentrations de CSA-13 sont ajoutées aux puits et l’augmentation de l’intensité de la fluorescence émise par le NPN est suivie pendant 10 min à 30 °C. Les échantillons sont soumis à une lumière d’excitation dont la longueur d’onde est de 310 nm et la lumière émise est lue à une longueur d’onde de 460 nm à des intervalles de temps de 15 sec. A la fin de la mesure, une solution de Triton X-100 à 1 % (V/V) est ajoutée afin d’estimer l’insertion maximale du NPN dans la membrane bactérienne et les résultats sont calculés en prenant cette valeur comme référence. Les résultats sont exprimés comme variation de la fluorescence ± SEM après 10 min d’exposition au CSA-13. Les résultats sont ajustés à l’aide de l’équation d’une hyperbole à une composante.

II.9.3 Interaction du CSA-119 avec P. aeruginosa

L’interaction membranaire du CSA-13 avec les différentes souches de P. aeruginosa

est étudiée à l’aide du CSA-119, un analogue fluorescent du CSA-13 ou le dérivé dansyl-CSA-13. Les spectres d’émission et d’excitation du CSA-119 dans un tampon phosphate salin (PBS) sont enregistrés à l’aide d’un fluorimètre (Photon Technology International, Birmingham, NJ, Etats-Unis). Un spectre d’émission de la molécule en présence et en absence de la souche de référence ATCC PAO1 est également réalisé afin de mettre en évidence la spécificité de l’interaction. L’étude de la sensibilité des 8 souches au CSA-119 est effectuée par mesure de l’augmentation de la fluorescence liée à l’interaction du CSA-119 avec la

membrane bactérienne.Deux cents µL de la SBI dans un tampon PBS sont transférés dans les

puits d’une plaque 96-puits. La lumière émise à 495 nm après excitation des puits à 345 nm est mesurée toutes les 40 sec à l’aide de notre lecteur de microplaques. Trois min après le début de l’essai, 1 à 5 µL de CSA-119 (concentrations finales 1 ; 2 ; 5 et 6 mg/L) sont ajoutés aux puits et la fluorescence est lue pendant 15 min. La microplaque est agitée avant chaque mesure. La photodégradation du fluorophore au cours du dosage est estimée à l’aide de puits

Matériel et Méthodes

83 contrôles (puits contenant uniquement la sonde fluorescente et du tampon PBS sans bactéries).

II.9.4 Essai de viabilité par dénombrement

Cent µL de la SBI de la souche ATCC PAO1 sont déposés dans les puits d’une microplaque. A chaque puits, 100 µL du produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 5% ou LL-37) sont ajoutés afin d’atteindre un volume final de 200 µL/puits. Un contrôle négatif, contenant uniquement du milieu de culture, ainsi qu’un contrôle positif, contenant la suspension bactérienne sans le produit à tester, sont inclus dans l’essai. La plaque est incubée à 37 °C pendant 3 et 24 h (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 5 %) ou 1 h (LL-37). Un dénombrement bactérien est ensuite réalisé : 10 µL de chaque puits sont prélevés et dilués. Chaque dilution est étalée sur gélose TSA et incubée pendant 48 h à 32-34 °C. Les colonies sont comptées et les résultats exprimés en ufc/mL.

II.9.5 Essai de viabilité par perméabilisation à l’iodure de propidium (IP)

Principe

L’IP est un agent fluorescent imperméable aux membranes et donc exclu des cellules vivantes. Le fluorophore est utilisé pour détecter les cellules mortes. Il s’intercale dans les deux brins de l’ADN et de l’ARN des cellules mortes. Lorsqu’il est lié aux acides nucléiques sa fluorescence augmente de 20 à 30 fois.

Protocole expérimental

Différentes concentrations des produits à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique ou peptides) sont ajoutées aux puits d’une microplaque à fond noir. On ajoute dans chaque puits 100 µL de la SBI contenant l’IP (concentration finale 10 µM) afin d’atteindre un volume final de 200 µL par puits (milieu de culture pour l’étude du CSA-13 et de l’acide pluronique F-127 : tampon de phosphate de potassium 1 mM pH 7 ; milieu de culture pour l’étude des peptides : BBM complémenté de 0,5 % de casaminoacides). L’intensité de la fluorescence est lue pendant 1 h à l’aide d’un lecteur à microplaque à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 540 nm et 590 nm.

Figure 35 : Etude de l’effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm par la technique de coloration au CV

Matériel et Méthodes

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