Production des C n≥6 -HSL

II.7.1.2 Etude sur boîte de Petri

Principe

La souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4) conçue par Cha et al. (1998) est utilisée comme souche biorapporteur pour détecter Cn≥6-HSL. Il s’agit d’une souche mutante de A. tumefaciens dépourvue du plasmide Ti habituellement hébergé par A. tumefaciens et sur lequel est localisé le gène codant pour TraR, homologue de LuxR et récepteur des HSL. Cette souche est incapable de synthétiser des HSL car son gène traI a été inactivé. Par contre le plasmide pZLR4 a été inséré dans la souche. Ce plasmide confère à la bactérie une résistance à la gentamicine. D’autres gènes sur pZLR4 incluent la fusion traG::lacZ et traR. Le gène

traG a été muté (interrompu) par l’insertion d’un gène lacZ (codant pour la β-galactosidase). Ce gène (traG::lacZ) requiert l’activateur de transcription TraR et une AHL pour son expression. Des AHL exogènes peuvent dès lors induire l’expression du gène rapporteur

traG::lacZ et l’activité de la β-galactosidase peut être utilisée comme indicateur de la présence d’AHL (Szenthe et Page, 2003). La β-galactosidase hydrolyse le dérivé 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) incolore introduit dans le milieu provoquant la formation d’un halot d’une coloration bleue visible à l'oeil nu (précipité bleu du dérivé 5,5’-dibromo-4,4’-dichloroindigo). TraR répond à différentes AHL avec un groupement acyle plus long que 4 carbones (Cha et al., 1998).

Matériel et Méthodes

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Protocole expérimental

L’étude de la production des AHL par les différentes souches de P. aeruginosa est réalisée selon le protocole détaillé de Szenthe et Page (2003). La souche biorapporteur A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) est cultivée dans un milieu Agrobacterium (AB) contenant 30

mg/L de gentamicine, pendant une nuit à 28 °C et 150 tpm. Après incubation, la suspension bactérienne est ajustée à une DO 600 nm finale de 0,240 ± 0,005. Dix mL de milieu AB contenant 40 mg/L du dérivé X-Gal et 1,5 % d’agar sont coulés dans des boîtes de Petri

laissées au repos jusqu’à solidification. Cinq mL de la souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4)

incubée une nuit sont ajoutés à 5 mL de milieu AB contenant 1,5 % d’agar. Le mélange est homogénéisé prudemment (concentration finale en agar 0,75 %). Ce mélange est immédiatement versé dans la boîte de Petri préalablement préparée et contenant le substrat X-Gal. Lorsque la couche d’agar est solidifiée, 10 µL de la SBI des différentes cultures de P.

aeruginosa sont piquées dans l’agar. Les boîtes sont ensuite incubées à 28 °C pendant 48 h.

L’activité de la β-galactosidase est détectée par la formation d’un spot de couleur bleue. Ceci indique une réaction positive avec hydrolyse du substrat X-Gal. La surface du spot est

mesurée par le ChemDoc XRS⁺ et le software Image Lab™ 3.0.

II.7.1.3 Etude sur microplaque

Principe

L’expérimentation repose sur un principe semblable au précédent. La souche A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) permet la détection des AHL produites par P. aeruginosa par

mesure de l’activité de la β-galactosidase. L’activité de l’enzyme est évaluée par simple ajout d’un substrat fluorogène : le 4-méthy-lumbelliféryl β-D-galactopyranoside (MUG). L’hydrolyse du substrat par la β-galactosidase produit un dérivé fluorescent, le 4-méthylumbelliférone (MU).

Protocole expérimental

La production de Cn≥6-HSL est quantifiée selon la technique décrite par Vidal-Aroca et al. (2006) après extraction des HSL selon le protocole modifié de Nakagami et al. (2011). Les

HSL extraites et concentrées sont mises en présence de la souche biorapporteur A.

tumefaciens NTL4(pZLR4) et l’activité de la β-galactosidase induite par les HSL est dosée. Les SBI de P. aeruginosa sont centrifugées et 700 µL de surnageant sont prélevés. Dans un

77 tube Eppendorf, 700 µL d’acétate d’éthyle sont ajoutés aux 700 µL de surnageant. Les tubes sont agités pendant 10 min. La phase supérieure est prélevée et une deuxième extraction est effectuée. Les extraits sont alors réunis et 300 µL de la phase organique sont évaporés à l’aide

du Speedvac. Le résidu est mis en suspensiondans 10 µL d’HCl 10 mM. Dans une plaque

96-puits, 2 µL de chaque échantillon sont mis en présence de 100 µL d’une culture de A. tumefaciens NTL4(pZLR4) dans du milieu AB pour la quantification des HSL. Un contrôle est réalisé contenant uniquement la culture de A. tumefaciens NTL4(pZLR4). La plaque est incubée 18 h à 28 °C. Après incubation, 20 µL de chaque culture sont transférés dans une

nouvelle plaque 96-puits contenant 80 µL de tampon Z (Na2HPO4.7H2O 0,06 M ;

NaH2PO4.H2O 0,04 M ; KCl 0,01 M ; MgSO4 0,001 M ; β-mercaptoéthanol 0,05M ; pH 7,0). Vingt-cinq µL de 4-méthy-lumbelliféryl β-D-galactopyranoside (MUG) à 1 mg/mL dans du diméthylsulfoxide (DMSO) sont ajoutés à chaque puits et la fluorescence générée par l’hydrolyse de MUG (suite à l’action de la β-galactosidase) est quantifiée dans un fluorimètre à microplaques. Une cinétique de l’augmentation de la fluorescence après ajout du MUG est réalisée pendant 30 min (λ excitation = 360 nm, λ émission = 460 nm). Les résultats sont exprimés en vitesse de l’augmentation de la fluorescence.

II.7.1.4 Etude par chromatographie sur couche mince (CCM)

Une CCM permettant de caractériser les Cn≥6-HSL produits par les différentes souches

est réalisée comme décrit par Shaw et al. (1997). La souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4) est

cultivée à 28 °C dans un milieu AB minimal liquide contenant 0,4 % de mannitol. Cinq mL des SBI de P. aeruginosa sont centrifugés et les surnageants extraits deux fois à l’aide de volumes égaux en acétate d’éthyle HPLC-grade. Les extraits sont rassemblés, séchés sur du sulfate de magnésium anhydre, filtrés et évaporés à sec sous un flux d’azote. Le résidu est concentré dans 50 µL d’acétate d’éthyle HPLC-grade. Les AHL présents dans les extraits sont

séparés à l’aide d’une chromatographie sur couche mince C₁₈ en phase inversée (CCM Gel de

silice 60 RP-18 F₂₅₄S, 10 x 20 cm, Merck, Darmstadt, Germany) à l’aide d’une phase mobile

composée de méthanol/eau (60 : 40, V/V). Les extraits (4 μL) sont appliqués sur la plaque C₁₈ en phase inversée. Des dépôts de standards sont également réalisés (4 µL) : 0,9 nmoles de C6-HSL, 30 pmoles de C8-C6-HSL, 60 pmoles de 3-oxo-C8-C6-HSL, 300 pmoles de C10-HSL (Cayman Bio-Connect, Huissen, Pays-Bas) (Shaw et al., 1997). Après migration, la plaque est séchée à l’air libre. Elle est ensuite transférée dans une boîte en Plexiglas et couverte par la

Figure 33 : Essai biorapporteur avec la souche P. aeruginosa CGMCC 1.860 (production des C4-HSL)

78 souche biorapporteur préparée dans un milieu AB maintenu à 45 °C contenant 0,4 % de mannitol, 0,7 % d’agar et 60 mg/L X-Gal. Le mélange d’agar et de la souche biorapporteur (150 mL) forme une fine pellicule (environ 3 mm) recouvrant la plaque de silice. Après solidification, la boîte est incubée pendant 48 h à 28 °C. Durant cette incubation, des taches bleues se développent aux endroits de migration des AHL. Une image digitale de la plaque est

analysée par le ChemDoc XRS⁺ et le software Image Lab™ 3.0. Les résultats sont représentés

par mesure du Rf pour chaque tache.