- - -
- - -
Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Henriette, M.-F. (1997). Etude des mécanismes de régulation responsables de la non expression du gène AFP (Unpublished doctoral dissertation).
Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212194/1/8f1f0370-8681-4897-92e6-76baf020a5e0.txt
(English version below)
Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).
Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.
DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :
Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;
L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;
Le contenu ne soit pas modifié.
L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.
--- English Version ---
This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).
If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.
DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.
Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:
The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;
The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;
The content is not changed in any way.
It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.
DBM 00514
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Département de Biologie Moléculaire Laboratoire de Biologie du Développement Directeur de Thèse : Professeur J. Roscam-Szpirer
ETUDE DES MECANISMES DE REGULATION RESPONSABLES DE LA NON EXPRESSION
DU GENE AFP
Mémoire présenté pour l’obtention du grade de Docteur en Sciences Marie-France Henriette
Octobre 1997
ULB - DBM
BIBLIOTHEQUE
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Département de Biologie Moléculaire Laboratoire de Biologie du Développement
Directeur de Thèse : Professeur J. Roscam- Szpirer
ETUDE DES MECANISMES DE REGULATION RESPONSABLES DE LA NON EXPRESSION
DU GENE AFP
JLB - DBM
BIBLIOTHEQUE
Mémoire présenté pour l’obtention du grade de Docteur en Sciences Marie-France Henriette
Octobre 1997
Remerciements
Au terme de ce travail, je désire exprimer toute ma reconnaissance au Professeur Josiane Roscam-Szpirer pour avoir assuré la direction de cette thèse. Sa
disponibilité et son soutien ne m'ont jamais fait défaut malgré un parcours qui ne s'est pas déroulé sans embûche. J'ai particulièrement apprécié sa façon d'aborder les problèmes. Je tiens également à associer à ces remerciements le Professeur Claude Szpirer. Ses critiques ainsi que ses conseils avisés m'ont été très précieux lors de l'élaboration de ce travail. Ensemble, ils m'ont initiée au domaine de la recherche scientifique et m'ont enseignée que celle-ci nécessite rigueur et patience.
J'ai débuté au sein d’un groupe d’où émergeaient trois personnalités. J'ai nommé Karin, Montsé et Myriam. Celles-ci ont largement contribué à faire évoluer mon propre esprit critique alors que je n'étais qu'une jeune doctorante.
La recherche étant avant tout un travail d'équipe, c'est donc tout naturellement que je désire exprimer ma gratitude à ceux et celles du groupe AFP qui m'ont
accompagnée au cours de ces dernières années et plus particulièrement à Pierre Drèze. Non seulement il m ’a fait bénéficier de son expérience et de son savoir faire mais travailler avec lui fut un réel plaisir. Dynamisme et optimisme sont des
qualités que j'ai rencontrées chez Philippe et Thierry. Bien plus que quelques divergences d'opinions, je retiendrai de toi Philippe, une grande disponibilité et complicité. Thierry, sans ta patience, ce travail n'aurait pu être édité si facilement.
L'organisation et le goût du travail bien fait de Sophie, de même que la détermination de Mercè, ont été également un exemple pour moi.
Les années passées à Rhode St Genèse, m'ont permis de croiser bien d'autres pas.
Je voudrais cependant remercier plus spécialement les personnes du laboratoire de Biologie du Développement ainsi que celles du laboratoire de Génétique auprès desquelles j'ai passé de très bons moments.
J’aimerais joindre à ces remerciements, Soumaya avec qui j'ai partagé bien plus qu'une simple « paillasse » de même que Barbara, Béatrice, Jamila, Miguel. Nous formions une équipe soudée dont je garde un excellent souvenir lors de ces années
de Licence Spéciale en Biologie Moléculaire. A cette occasion je n 'oublie pas un ami, Vincent, que j'ai appris à connaître et à apprécier.
Enfin, je tiens à témoigner toute mon affection à mes proches qui m'ont soutenue et
encouragée au cours de mes années d'étude. De près ou de loin, ils ont contribué à
me rendre la vie plus facile.
« Je n’ai jamais cru en une vérité unique. Qu’il s’agisse de la mienne ou de celle des autres. Je crois que toutes les écoles, toutes les théories, peuvent être utiles en un certain lieu, en un temps donné.
Mais Je crois qu’on ne peut vivre qu’en s’identifiant passionément, et absolument, à un point de vue.
Toutefois, le temps passant, à mesure que nous changeons, que le monde change, les objectifs varient et le point de vue se déplace. Si je considère les essais que j’ai écrits, les idées émises en maints endroits et en des occasions si variées, au cours de toutes ces années, une chose me frappe : une certaine continuité. Pour qu’un point de vue soit d’une quelconque utilité, il faut s’y consacrer totalement, il faut le défendre jusqu'à la mort. Pourtant, en même temps, une petite voix intérieure murmure : « Hold on tilghtly, let go lightly ». »
Peter BROOK (points de suspension)
TABLE DES MATIERES
RESUME
INTRODUCTION... 1
I. LE CONTROLE DE L’EXPRESSION DES GENES DE DIFFERENCIATION HEPATIQUE ... 2
1. L’activité transcriptionnelle des gènes est associée à leur état structural...2
1.1 La Méthylation... 2
1.2 L’état structural des régions régulatrices...3
2. Les facteurs régulateurs contrôlant la transcription dans le contexte hépatique...5
2.1 Les facteurs dits hépatiques... 5
2.2 Les associations entre protéines modulent l’activité transcriptionnelle des gènes hépatiques...9
3. Participation des facteurs à l’établissement et au maintien de la différenciation hépatique... 11
4. Extinction des fonctions différenciées dans les hybrides somatiques...13
4.1 Les modifications associées au phénomène d’extinction... 13
4.2 Fondement génétique du phénomène d’extinction... 14
4.3 Identification de séquences régulatrices négatives...16
5. Les mécanismes de répression transcriptionnelle actuellement connus...17
5.1 Répression par interférence avec l’action des activateurs... 17
5.2 Répression par entrave de l’initiation de la transcription... 18
IL LE CAS PARTICULIER DU GENE AFP... 19
1. La régulation transcriptionnelle du gène AFP... 20
1.1 Mécanismes de types CIS ... 21
1.2 Mécanismes de types TRANS ... 22
2. La régulation spatiotemporelle du gène... 23
BUT DU TRAVAIL 26
MATERIEL ET METHODES 27
I. MATERIEL BIOLOGIQUE... 27
1. Vecteurs d’expression... 27
2. Lignées cellulaires utilisées et conditions de culture... 31
IL METHODES... 32
1. Transfection en vue d’analyser l’expression de constructions chimériques...32
1.1 La transfection transitoire... 32
1.2 Mesure de l’activité CAT... 33
1.3 Dosage Luciférase...35
2. Etudes des interactions ADN-protéines in vitro... 35
2.1 Préparation des extraits nucléaires à partir des cellules en culture... 35
2.2 Expériences de Footvrintim in vitro à la DNasel... 36
2.3 Expériences de retard de migration sur gel...38
2.4 Expériences de Southwestern Blottim ...38
RESULTATS...40
I. ANALYSE COMPARATIVE DE L’ACTIVITE DE LA REGION PROMOTRICE DU GENE AFP DANS DES CELLULES D’HEPATOME PRODUCTRICES ET NON PRODUCTRICES D’AFP ET DANS DES FIBROBLASTES... 40
IL ETUDE DU COMPORTEMENT REGULATEUR DE LA REGION PROMOTRICE AFP OU DES FRAGMENTS DE CELLE-CI SUR UN PROMOTEUR A EXPRESSION UBIQUISTE... 46
1. La région H AF contient-elle une ou des séquence(s) qui abaisse(nt) l’activité du promoteur TK ?... 46
2. Localisation de régions régulatrices négatives au sein de la région-1023-38... 48
2.1 Analyse de l’activité des constructions contenant les fragments de la région promotrice AFP dans les cellules d’hépatome productrices d’AFP ...49
2.2 Analyse de l’activité des constructions contenant les fragments de la région promotrice AFP dans les cellules d’hépatome non productrices d’AFP...51
2.3 Analyse de l’activité des constructions contenemt les fragments de la
région promotrice AFP dans les Fibroblastes... 53
III. ESSAI D’IDENTIFICATION DE FACTEURS REGULATEURS ACTIFS
AU NIVEAU DE LA REGION PROMOTRICE AFP... 55 1. Analyse par footprinting du promoteur AFP région -201+33...55 2. Analyse de l’interaction du fragment -80-38 avec des facteurs
nucléaires de fibroblastes... 58 2.1 La séquence -80-38 est-elle la cible de protéines fibroblastiques ?...59 2.2 Localisation des sites de fixation des protéines repérées par retard
de migration sur gel... 60 IV. CORRELATION ENTRE LA FIXATION DES COMPLEXES
PROTEIQUES ET l’ACTIVITE BIOLOGIQUE DU FRAGMENT -80-38... 63 1. Analyse de l’activité de la construction FNEl délétée dans les fibroblastes...63 2. Analyse de l’activité des constructions porteuses de mutation
dans les fibroblastes et à titre comparatif dans les cellules d’hépatome...64 V. LES PROTEINES RESPONSABLES DE l’EFFET NEGATIF OBSERVE
DANS LES FIBROBLASTES SONT-ELLES PRESENTES DANS DES
CELLULES D’AUTRES TISSUS ?...68 VI. TENTATIVE DE CARACTERISATION DES PROTEINES
FIBROBLASTIQUES SE FIXANT A FNEl... 69
DISCUSSION ET CONCLUSION ... 71 I. LA REGION PROMOTRICE DU GENE AFP RENFERME DES SITES DE
REGULATION POSITIVE ET NEGATIVE ACTIFS DANS LES CELLULES
D’HEPATOME NON PRODUCTRICES... 72 II. LA REGION PROMOTRICE AFP EST INACTIVE DANS LES
FIBROBLASTES ET CONTIENT DES ELEMENTS REGULATEURS NEGATIFS CAPABLES DE REDUIRE L’ACTIVITE D’UN PROMOTEUR
HETEROLOGUE... 76
ANNEXES ET BIBLIOGRAPHIE 83
Résumé
RESUME
Notre travail s'inscrit dans le cadre de l'étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent l'expression des fonctions différenciées de mammifères. Les gènes codant pour des fonctions de différenciation sont soumis le plus souvent à un contrôle transcriptionnel rigoureux. Le gène de l'Alpha-Foetoprotéine (AFP) ne fait pas exception à cette règle et présente la propriété d'être étroitement régulé spatiotemporellement. En effet, l'expression de ce gène est liée à la différenciation hépatique et subit un contrôle développemental puisque la protéine correspondante n'est plus détectée chez un individu adulte mis à part dans certains cas d'hépatocarcinogénèse et teratocarcinogénèse.
Au cours de cette thèse, nous avons entrepris d'analyser d'un point de vue fonctionnel la région promotrice AFP dont l'activité est bien corrélée à celle du gène endogène dans différentes cellules exprimantes et non exprimantes. La dissection de cette région a révélé qu'elle contient plusieurs éléments régulateurs participant au contrôle différentiel du gène dans ces cellules:
-un élément régulateur a été mis en évidence dans une région comprise entre - 584pb et -201pb. Celui-ci renferme une, voire plusieurs séquence(s) régulatrice(s) négative(s) active(s) dans les fibroblastes ainsi que dans les cellules hépatiques non productrices où elle(s) pourrai(ent) être impliquée(s) dans la régulation ontogénique du gène AFP.
-l'autre élément régulateur défini par cette approche et le mieux étudié lors de
cette analyse est localisé à proximité du site d'initiation de la transcription dans
une région comprise entre -80pb et -38pb. Ce fragment -80-38 n’est pas
seulement la cible d’un mécanisme d’activation dans les cellules hépatiques
mais il est aussi la cible d’un mécanisme de répression dans les fibroblastes. Il a
de ce fait été appelé FNEl (Fibroblastic Négative Elément 1) et a fait l'objet
d'une caractérisation plus poussée au moyen d'expériences de footprinting in
vitro et de retard de migration sur gel.
Résumé
Celles-ci ont montré que FNEl fixe plusieurs protéines
fibroblastiques et hépatiques. L’introduction de mutations dans cette séquence a
permis de localiser plus finement les sites cibles de ces protéines et de préciser
par un test fonctionnel leur contribution, soit à l'activité négative de ce fragment,
soit à son activité positive. Un site compris entre -47pb et -43pb s’est avéré être
plus directement impliqué dans la répression exercée dans les fibroblastes. Il
fixe un complexe protéique qui parait être présent dans les fibroblastes mais
aussi dans d’autres types cellulaires non exprimants y compris dans des cellules
d'origine hépatique. Ce complexe protéique est vraisemblablement responsable
de l’action inhibitrice observée. Le site en question est également la cible de
protéines présentes dans les cellules productrices d’AFP; ces protéines n’ont pas
été identifiées mais il est probable qu’elles contribuent à l’activité positive du
fragment.
introduction
INTRODUCTION
Chez les eucaryotes supérieurs, les cellules issues des divisions zygotiques se spécialisent au cours du développement pour donner finalement naissance à un organisme de structure complexe. Cette spécialisation s’accompagne généralement d’une diminution progressive du taux des divisions cellulaires ainsi que de profondes modifications tant du point de vue morphologique que fonctionnel. Ce processus par lequel les cellules issues de l’oeuf fécondé se différencient et acquièrent la propriété de synthétiser des produits spécifiques de leur état de différenciation, résulte non pas d’un contenu génétique distinct mais plutôt de l’expression différentielle du patrimoine génétique. L’établissement et le maintien des différences fonctionnelles impliquent la mise en place de mécanismes de contrôles étroits d’autant que la plupart de ces produits hautement spécialisés, sans être indispensables à la pérennité cellulaire, sont toutefois vitaux pour l’organisme entier.
Parmi les mécanismes qui assurent le contrôle de l’expression génétique, ceux régulant la transcription sont sans doute les plus cruciaux. Ils font non seulement appel à des facteurs nucléaires diffusibles mais également à des modifications de la structure des gènes. Ces mécanismes appelés respectivement TRANS et CIS coopèrent pour permettre l’élaboration et le maintien du schéma d’expression spatio-temporel des fonctions différenciées.
Elucider les rouages de ces différents mécanismes constitue par conséquent une étape primordiale dans la compréhension du phénomène complexe qu’est la différenciation. Celle-ci passe obligatoirement par la caractérisation des différentes composantes intervenant dans ces régulations spécifiques et notamment par l’identification des facteurs transcriptionnels et de leur site cible.
La différenciation hépatique s’avère un système particulièrement
intéressant pour entreprendre de telles investigations. En effet, le foie remplit
une fonction essentielle au sein de l’organisme nécessitant la synthèse d’un
introduction 2
nombre important de produits spécialisés qui lui sont propres. De plus, au cours de leur maturation, les hépatocytes subissent une série de modifications phénotypiques qui caractérisent la transition de l’état foetal à l’état adulte. La variation de la synthèse de différentes enzymes ou de certaines protéines plasmatiques telles que l’Alpha-Foetoprotéine (AFP), illustre ces changements
Les gènes codant pour des traits histospécifiques et en particulier ceux caractéristiques de la différenciation hépatique sont des gènes dont l’expression est très finement régulée notamment au niveau de la transcription.
I. LE CONTROLE DE ['EXPRESSION DES GENES DE DIFFERENCIATION HEPATIQUE
1. L’activité transcriptionnelle des gènes est associée à leur état structural
Le contrôle transcriptionnel s’opère par l’intermédiaire de séquences régulatrices réparties autour du promoteur minimum suivant une organisation spatiale et une combinaison propre à chacun des gènes. La réunion de ces éléments régulateurs de type «CIS» donne naissance à des régions contrôles de configuration plus complexe qui peuvent être sujettes à des modifications locales de structure. Il a en effet été démontré que, de manière générale, différents événements tels que des changements du taux de méthylation et de la conformation chromatinienne sont associés à des modifications de l’état d’expression des gènes {Delers et al., 1984 ; Sellem et al, 1985 ; Cedar, 1988 ; Beard et al, 1995 ; Elgin, 1988 ; Edmonson et Roth,
1996).
1.1 La méthylation
Des travaux relatifs à la méthylation ont ainsi souligné l’existence
d’une relation inverse entre le taux de méthylation des gènes et leur activité ;
ceux-ci se sont attachés à montrer que les gènes activement transcrits sont
généralement hypométhylés alors que les gènes silencieux se singularisent le
plus souvent par une hyperméthylation de leurs régions régulatrices {Sellem et
introduction 3
al. 1985; Tratner et al, 1987). On constate par exemple, que les gènes codant pour l’AFP et la PEPCK sont hautement méthylés dans des tissus où ils ne sont jamais exprimés. Par contre, dans des tissus où ils sont activement transcrits ou susceptibles de l’être, ils sont partiellement voire totalement déméthylés {Benvenisty et al, 1985 ; Tratner et al, 1988 ; Smith et al, 1989).
L’existence d’une corrélation stricte entre la déméthylation sélective de sites particuliers et l’état actif du gène a également été démontrée dans des cas bien précis {Sellem et al, 1985 ; Opdecamp et al, 1992). Toutes ces observations suggèrent que la méthylation contribue au contrôle de l’expression des gènes.
Des arguments en faveur de cette idée ont été apportés par différentes équipes étudiant l’effet de la méthylation sur l’activité des gènes {Yisraeli et al, 1988 ; Opdecamp et al, 1992 ; Ngô et al, 1996). L’introduction dans des cellules de gènes méthylés et non méthylés a montré que la méthylation des îlots CpG pouvait affecter l’activité transcriptionnelle du gène. On pense actuellement que la méthylation pourrait affecter l’expression des gènes par deux types de mécanismes soit en entravant directement ou indirectement la liaison des protéines activatrices à l’ADN soit au contraire, en favorisant l’accès de ce dernier à des protéines de type répresseur (Watt et Molloy, 1988; Bird, 1992 ; Tate et Bird, 1993 ; Nan et al, 1997).
1.2 L’état structural des régions régulatrices
D’autres études ont montré que le degré de compaction de l’ADN en association avec des protéines reflète également l’état d’expression d’un gène. Ln effet in vivo, dans le noyau des cellules eucaryotes, la chromatine peut adopter en fonction du degré d’activité des gènes une configuration plus ou moins relâchée qui constitue un facteur déterminant du contrôle transcriptionnel (Felsenfeld, 1992). On constate que lors de l’activation transcriptionnelle des gènes, la chromatine compacte et inactive subit des altérations structurales qui peuvent être visualisées par un accroissement de la sensibilité de l’ADN à la digestion des nucléases {Fritton et al, 1987 ; Elgin et al, 1988 ; Nitsch et al, 1990)', ces nucléases accèdent sans doute plus facilement à F ADN une fois que celui-ci présente un état décondensé.
L’acétylation des histones constitue une étape importante dans la
transition entre la forme inactive de la chromatine et sa forme active (Hebbes
introduction 4
et al, 1988 ; Braunstein et al, 1993). L’un des modèles actuellement proposés considère que l’acétylation des résidus lysines des histones affaiblirait les interactions ADN-histones, induisant un changement conformationnel. De ce fait un accès privilégié à 1’ ADN serait offert aux facteurs de transcription (Lee et al, 1993, Garcia Ramirez et al, 1995). L’acétylation des histones serait insuffisante pour induire l’expression d’un gène inactif mais faciliterait d’avantage l’apparition d’une structure favorable à la transcription (Hebbes et al, 1992). A ce stade, la liaison de protéines à l’ADN pourrait s’avérer nécessaire pour réorganiser la chromatine. Certains facteurs transcriptionnels comme le récepteur aux glucocorticoïdes {GR) sont en effet capables de modifier le positionnement des nucléosomes. Le récepteur aux glucocorticoïdes se fixe au niveau de régions activatrices du gène hépatique codant pour la Tyrosine Amino Transférase (TAT) et, en présence d’hormone, perturbe le positionnement de deux nucléosomes permettant aux autres facteurs régulateurs d’accéder à leur site cible et de transactiver le gène {Reik et al, 1991 ; Rigaud et al, 1991). Le mécanisme par lequel le GR déréprime la chromatine est fonction d’un stimulus hormonal puisque lorsqu’on ôte l’hormone ou que l’on ajoute un inhibiteur compétitif de celle-ci, on observe alors un retour vers le stade réprimé. Il semble que ce mécanisme puisse faire appel à des interactions spécifiques entre le GR et un ou plusieurs coactivateurs tels que la protéine CBP manifestant par ailleurs des propriétés acétyltransférases (Ogrysko et al, 1996 ; Bannister et Kouzarides, 1996). Ce complexe G/?-coactivateurs pourrait également contacter un ou plusieurs composants du complexe transcriptionnel {McEwan et al, 1997).
Il semble néanmoins que si le récepteur aux glucocorticoïdes peut initier l’activation du gène TAT dans les cellules hépatiques, il s’en avère incapable dans les fibroblastes où le gène est présent sous une forme beaucoup plus compacte {Reik et al, 1991). Le récepteur aux glucocorticoïdes est donc un élément permettant la transcription du gène mais seul, il ne suffit pas.
Plusieurs études montrent par ailleurs que l’établissement et le
maintien de cet état structurel inactif {silencing) recquièrent l’intervention
d’une combinaison de protéines régulatrices qui agissent au niveau de
séquences appelées silencers {Rine et Herskowitz, 1987 ; Shore et Nasmyth,
1987 ; Hardy et al, 1992; Loo et Rine, 1995). Inversément, on a mis en
évidence des régions appelées LCR {Locus Control Région) également
reconnues par des facteurs régulateurs qui rendent les transgènes placés sous
Transthyretine
n
-200pb
Tataa i -100pb
Alpha 1 -antitrypsi ne AP1
f
-500pb -250pb
Albumine
-10500pb
"T
■-100pb
w»» Tataa
ENHANCER PROMOTEUR
Figure 1: Représentation schématique de l'interaction des facteurs transcriptionnels
hépatiques et ubiquistes avec les promoteurs et enhancers de trois gènes hépatiques.
introduction 5
leur contrôle, indépendants de leur localisation chromosomique et leur confèrent un haut taux d’expression {Felsenfeld, 1992; Chung et al, 1993;
Ellis et al, 1996). On suppose que ces LCR participent à l’élaboration et au maintien d’une structure chromatinienne ouverte. Silencer et LCR, quoiqu’ils manifestent des comportements antagonistes et conduisent à l’établissement d’un état structural de la chromatine totalement opposé, pourraient partager des propriétés et un mode de fonctionnement similaires (Kamakaka, 1997).
Dans chacun des cas, les mécanismes responsables impliqueraient la formation de complexes nucléoprotéiques spécifiques qui pourraient participer à l’activation ou à la répression séquentielle et restrictive des gènes au cours du développement.
2. Les facteurs régulateurs contrôlant la transcription dans le contexte hépatique
Le contrôle de l’expression des gènes repose sur la reconnaissance de séquences régulatrices par des facteurs transcriptionnels.
Ces facteurs ont pour fonction de moduler le niveau minimum de transcription initiée par la machinerie transcriptionnelle de base qui comprend l’ARN polymérase II et les Facteurs Transcriptionnels Généraux (FTG). Dans le contexte des cellules hépatiques, leur rôle consiste non seulement à réguler l’activité transcriptionnelle en fonction des différentes situations physiologiques mais également à assurer l’expression histospécifique des gènes (figure 1).
2.1 Les facteurs dits hépatiques
Différentes approches biochimiques et génétiques ont permis au
cours de ces dix dernières années d’isoler et de caractériser de nombreux
facteurs transcriptionnels participant notamment au contrôle de l’expression
de gènes hépatiques. Aucun cependant, ne présente de répartition
histospécifique stricto sensu.
introduction 6
Ainsi, des facteurs hépatiques ont été isolés à partir du foie par différentes équipes (figure 2). Ils sont présents en relativement grande quantité dans ce tissus mais l’étude de leur répartition, a révélé leur présence dans des tissus non hépatiques. {Landschutz et al, 1988 ; Descombes et al, 1990 ; Cao et al, 1991 ; Mueller et al, 1990, Courtois et al, 1988 ; Frain et al, 1989 ; Rey -Campos et al., 1991, Lai et al, 1990 ; 1991 ; Sladek et al, 1990 ; Lemaigre et al, 1996; Xanthopoulos et al, 1991 ; Cereghini, 1996).
Parmi ces différents facteurs, nous ne citerons que les plus connus et/ou encore ceux pour lesquels un lien direct entre leur expression et l’expression de gènes de différenciation hépatique a été clairement démontré {Feuerman et al, 1989 ; Costa et al., 1989, 1990., Xanthopoulos et al, 1991, Gregori et al, 1993 ; Schweizer-Groyer et al, 1994 ). Nous préciserons que ceux-ci font partie de familles comprenant d’autres membres. On peut ainsi citer les facteurs C/EBPa, C/EBPP, DBP, les facteurs HNFla et P, les facteurs HNF3 a, P, ô et enfin le facteur HNF4. Pour un certain nombre d’entre-eux, la localisation chromosomique a été déterminée {Szpirer et al, 1991 ; Szpirer et al, 1992 ; et résultats non publiés). Le foie est le seul cependant à exprimer simultanément et à un taux relativement élevé tous ces facteurs. On admet donc actuellement que la spécificité d’expression des gènes hépatiques dépend de l’assortiment unique de ces facteurs.
Tous ces facteurs possèdent un domaine leur conférant la propriété de se lier à l’ADN. Plusieurs types de domaines de liaison à l’ADN ont été répertoriés, chacun se singularisant par la présence d’un motif structurel caractéristique leur permettant de reconnaître et de se fixer en des sites de régulation déterminés. Sur cette base, on peut aisément classer ces facteurs en différentes familles.
• C/EBPa, C/EBPP (LAP, NFIL6), DBP sont des membres d’une famille de
facteurs transcriptionnels qui possèdent une région basique en hélice a
(pour revue, voir Cereghini, 1996). Celle-ci détermine leur fixation à
l’ADN et est adjacente à un domaine de dimérisation de « type fermeture
éclair à leucine bzip » La dimérisation permet le rapprochement des régions
en hélice a, nécessaire pour qu’elles acquièrent la capacité de s’associer à
l’ADN. CEBPa et CEBPp se fixent à une séquence contenant généralement
un motif CCAAT mais ils peuvent également se lier à d’autres
séquences comme la séquence TGTGGA/TA/TA/TG (Jonhson et al, 1987 ;
Figure 2: Tableau répertoriant les facteurs transcriptionnels hépatiques et leurs caractéristiques
Facteurs de transcription hépatiques Localisation Chromosomique Motifs de fixation ou DNA Sites consensus Fixation sous forme Monomère / Dimère
Gèn Hépatiques
es cibles
Fact. transcriptionnels
Répartition tissulaire
C/EBP
CEBPa Chromosome 1 (rat) 19 (humain)
b leucine zipper ATTGC/GCAAT Dimère
(homo/hétéro)
Alb, AFP, AldB, TAT,TTR ...
CEBP,HNF3 foie, intestin, poumon, rein cerveau,rate,adypocyte
CEBP^ (LAP, NFIL6) Chromosome 3 (rat) 20 (humain)
Par Protein DBP Chromosome 1 (rat) 19 (humain) RTTAYGTAAR Dimère Alb, AldB ... absent dans testicules
enrichi dans foie
HNF1
HWFfa(LFBI) Chromosome 12 (rat) 12 (humain)
Variante d'un homéodomaine GGTTAATNATTAACA/C Dimère (homo/hétéro)
Alb, al-AT, AFP, AldB, fibrinogène,
TTR...
HNF4
foie,rein,intestin, pancréas
VHNF1P Chromosome 10 (rat) 17 (humain)* rein,intestin,estomac,thymus
gonades,pancréas,foie
HNF3
HNF3a Chromosome 12 fsourisi
Forkhead domain A(ATr)TRTT(G7r)RYTY Monomère Alb, al-AT, AFP, AldB, TAT, TTR ...
HNF3 ,HNF1
foie,intestin,estomac.
pancréas, poumon
HWF3P Chromosome 2 ^souris^ foie,intestin,estomac,pancréas
poumon
HNF3y Chromosome 7 fsourisi foie,intestin,testicuIes
HNF4 Chromosome 3 (rat) 20 (humain)* Doigt de zinc GGGTCAAAGGTCA Dimère
(homodimère)
al-AT, TAT, TTR HNF1 foie,rein;intestin,estomac pancréas
HNF6 En cours Variante d'un homéodomaine (A/T)(A/T)AT(T/G)RYTT ? PFKj, TAT, AFP,
TTR ...
foie,cerveau,testicules,rate
(*) C. Szpirer non publié, communication personnelle _ d'après Cereghini, 1996
Abréviations de gènes: Alb: albumine, AldB: aldolase B, a1-AT: antitrypsine, TAT: tyrosine aminotransférase, TTR: transthyretine, AFP: alphafoetoprotéine, PFK2: 6-phosphofructo-2-kinase
introduction 7
Landschutz et al., 1988 ; Descombes et al, 1990 ) ; la séquence consensus étant ATTGCGCAAT {Cereghini, 1996). DBP bien que possédant un domaine de fixation similaire, se montre plus restrictif quant à la reconnaissance de son site de liaison et ne se fixe qu’à certains sites reconnus par les autres membres de la famille.
• HNFla (LFBl) et HNFlp sont des protéines porteuses d’un homéodomaine chargé positivement en amont duquel on trouve un motif
« POU » {Frain et al, 1989 ; Herr et al, 1988). Ces domaines sont tous les deux nécessaires à la liaison de ces facteurs à une séquence bien conservée que l’on trouve dans la région contrôle de nombreux gènes hépatiques et dont on a déduit la séquence consensus GGTTANATTAAC(A/C).
L’homéodomaine confère essentiellement au facteur la propriété de se fixer à l’ADN alors que la spécificité de reconnaissance du site serait d’avantage assurée par le domaine POU (Tomei et al, 1992).
• La séquence consensus dérivée de celles reconnues par les différents membres de la famille HNF3 est A A(A/T) TRTT(G/T)RYTY {Cereghini, 1996). Ces facteurs possèdent un domaine de fixation similaire à celui que l’on rencontre pour la protéine homéotique ‘‘‘’fork head” de la drosophile qui serait une variante du domaine d’interaction à l’ADN de type hélice-tour- hélice. Le fait que leur domaine de fixation montre une structure proche de l’un des domaines présents chez l’histone H5 ainsi que la présence de leurs sites de fixation loin en amont de plusieurs gènes hépatiques, suggèrent que ces facteurs pourraient intervenir dans la réorganisation de la chromatine {Clark et al, 1993 ; Rigaud et al, 1991; Mc Pherson et al, 1993).
• Enfin HNF4 est un membre de la superfamille des récepteurs d’hormones stéroïdes qui se caractérisent par la présence d’un motif d’interaction avec l’ADN à deux doigts de zinc. La séquence consensus pour ce facteur est GGGTCAAAGGTCA {Cereghini, 1996). Les facteurs de la famille HNF4 ne semblent pas devoir être activés par la fixation d’une hormone. Ils semblent jouer un rôle important au début du développement.
Les promoteurs des gènes appartenant à la différenciation
hépatique contiennent en plus des sites cibles des facteurs hépatiques, des sites
cibles pour des facteurs ubiquistes tels que JUN FOS et NFl ainsi que ceux
introduction 8
reconnus par des récepteurs hormonaux nucléaires {Rigaud et al., 1991 ; Zhang et al, 1990 ; Schweizer-Groyer et al, 1994).
Il existe chez ces facteurs, qu’ils soient à distribution plus restreinte ou au contraire ubiquiste, outre le domaine de fixation à l’ADN, un domaine responsable de l’activation transcriptionnelle. Chez certains d’entre- eux, celui-ci est limité uniquement à la partie carboxyterminale de la protéine.
{Nicosia et al, 1990; Sladek et al, 1990). Chez d’autres, par contre, des domaines situés dans les parties amino et carboxyterminales sont nécessaires à l’activation sans doute pour que celle-ci soit maximale {Lai et al, 1990; Qian et al, 1995). De plus, ces domaines d’activation divergent quant à leur composition et cela au sein même des membres d’une famille {Bach et al, 1993). Ceci laisse présager que les membres d’une même famille sont munis de propriétés régulatrices distinctes qui de sucroît peuvent être modulées par modifications post-traductionelles {Cereghini, 1996).
On sait actuellement que les domaines d’activation sont
impliqués dans les contacts physiques que ces facteurs établissent avec la
machinerie transcriptionnelle de base. Ils ont vraisemblablement pour objectif
de permettre d’une part au complexe transcriptionnel de se positionner
correctement au niveau du promoteur et de faciliter d’autre part les
interactions fonctiormelles entre ces différents constituants de manière à ce
que la transcription soit initiée correctement et efficacement. Il a en effet été
montré lors d’expériences in vitro que ces domaines d’activation permettent
aux facteurs transcriptionnels d’établir des contacts directs avec certains
constituants de la machinerie transcriptionnelle de base tels que le facteur
TFIIB {Baniahmad et al, 1993 ; Roberts et al, 1993 ; Sauer et al, 1995 ). Ces
différents domaines d’activation qui sont généralement classés suivant leur
séquence primaire en acides aminés, peuvent aussi reconnaitre et se fixer à des
T AFS {TBP associated factors) spécifiques {Verrijzer et Tjian, 1996) D’autres
études indiquent qu’ils sont également susceptibles d’établir des contacts
indirects avec la machinerie de transcription au travers de protéines
médiatrices telles que certaines des protéines du complexe SRB {supressor
RNA polymérase B) associées à la queue carboxyterminale de l’ARN
polymérase II, ou encore au travers des cofacteurs généraux ou spécifiques
{Merino et al, 1993 ; Gerber et al, 1995 ; Hentgartner et al, 1995 ; Mc Ewan
et al, 1997 ; BjorKlund et Kim, 1996).
Figure 3: représentation schématique du mécanisme d'activation tel qu'on le suppose actuellement.
Les facteurs transcriptionnels se fixent aux séquences régulatrices (promoteur et enhancer) et
interagissent avec la machinerie trancriptionnelle de base comprenant l'ARN polymérase II (pol) et les
facteurs transcriptionnels généraux (GTFs). On pense que la transmission du signal activateur vers ce
complexe se fait au travers des TAFs, protéines associées à la TATA binding protein, au travers des
protéines du complexe SRB ( suppressor RNA polymerase B ou mediator) associées à l'extrémité
carboxyterminale de I' ARN polymérase II et des cofacteurs généraux ou spécifiques (LIAS).
introduction 9
Ces facteurs intermédiaires jouent le rôle de facteurs ponts entre les facteurs fixés à l’ADN et le complexe transcriptionnel (figure 3). Comme ils paraissent nécessaires à la transmission de l’effet activateur des facteurs transcriptionnels, il a été suggéré qu’ils agissent de concert pour permettre une activation synergique de la transcription de gènes dont l’expression spécifique dépend, outre des facteurs fixés sur la région promotrice, de ceux se liant aux régions activatrices situées parfois à plusieurs kilobases de distance du site d’initiation de la transcription. Aucun cofacteur spécifique de facteurs hépatiques n’a été jusqu’ici isolé, exception faite du coactivateur DCOH associé au dimère HNFl, dont la présence s’avère indispensable pour obtenir une transactivation maximale. Il ne semble pas toutefois contacter la machinerie transcriptionnelle mais il contribuerait d’avantage à stabiliser le complexe {Hansen et Crabtree, 1993).
2.2 Les associations entre protéines modulent l’activité transcriptionnelle des gènes hépatiques
La plupart des facteurs qui participent à la régulation de l’expression de gènes transcrits dans le foie se fixent aux éléments de régulation sous formes de dimères ( homo ou hétérodimères) à l’exception des membres de la famille HNF3 qui agissent sous forme monomérique. Ces associations entre membres de dimères se font par l’interaction de domaines particuliers qui doivent être compatibles. Les facteurs de la famille C/EBP sont reconnaissables par la présence d’un domaine de dimérisation caractéristique de type « leucine zipper ». Toutefois, le facteur DBP détient un domaine « leucine zipper » quelque peu atypique et ne semble pas pouvoir se dimériser avec les autres membres de la famille mais uniquement avec certaines protéines détentrices d’un domaine de dimérisation similaire. Celles- ci font partie d’un sous ensemble de protéines que l’on nomme « PAR protein » en raison de leur domaine d’activation riche en proline et acides
aminés acides.
Les différents membres d’une même famille peuvent
généralement se dimériser entre-eux mais on constate que les complexes ainsi
formés sont dotés de propriétés régulatrices différentes. Ces multimères de
protéines reconnaissent ainsi des sites de régulation virtuellement identiques et
Transcription Activation
û û û û û
CAP--- AUG--- AUG---
U ^7
-AUG- -UAG —PolyA
N LAP
LIP
r ü
N LAP
C C
N LIP N LAP
LAP-LAP
±(?)
Figure 4: représentation schématique de la synthèse et des activités putatives des
protéines LAP et LIP. D*après Descombes et al., 1991.
introduction 10
c’est donc en fonction du partenaire auquel ils se lient, qu’ils modulent de manière différente l’activité transcriptionnelle des gènes. Les membres d’une famille sont, suivant les cas, produits à partir de gènes différents ou à partir d’un même gène qui peut donner naissance à plusieurs protéines, consécutivement à un épisssage différentiel de l’ARNm, à un site de démarrage de traduction alternatif ou encore à l’utilisation de sites alternatifs de polyadénylation {Foulkes et Sassone-Corsi, 1992). Plusieurs facteurs transcriptionnels nécessaires à l’expression de gènes hépatiques sont ainsi produits à partir d’un même gène. L’utilisation de sites de démarrage de traduction alternatifs au niveau de l’ARN messager conduit, par exemple, à la production de deux isoformes du facteurs C/EBP(3: la protéine LAP d’une part, et la protéine appelée LIP d’autre part (figure 4). Cette dernière est tronquée et dépourvue du domaine d’activation. Contrairement aux hétérodimères LAP/LAP, les hétérodimères LAP/LIP et LIP/LIP, bien que toujours capables de se fixer à leur séquence cible, sont inaptes à transactiver efficacement les gènes porteurs d’une telle séquence {Descombes et Schibler, 1991). LIP se comporte donc comme un inhibiteur compétitif de LAP. Chacun des gènes codant pour les facteurs HNFla et p peut aussi être à l’origine de plusieurs isoformes qui peuvent s’associer et présenter des capacités d’activation qui varient {Bach et Yaniv, 1993). Les isoformes B et C du facteur HNFla stimulent d’avantage l’activité transcriptionnelle que l’isoforme A du même facteur. L’isoforme C de HNFip se comporte comme un répresseur dominant de la transcription et comme un inhibiteur compétitif des autres isoformes.
En outre, certains de ces facteurs peuvent être détournés de leur
propre site d’action auquel ils sont devenus incapables de se fixer suite à des
associations avec d’autres protéines {Ron et Habener, 1992). Ainsi un membre
de la famille C/EBP (à leucine Zipper), le facteur CHOP peut s’associer à
C/EBPa et à LAP. Cependant, une substitution de deux acides aminés au
niveau du domaine basique de CHOP l’empêche de se fixer aux sites de
régulation normalement reconnus par les autres membres de la famille et
empêche aussi les dimères auxquels il participe de s’y associer. Par contre, il a
été récemment montré que CHOP possède un domaine d’activation et peut
stimuler la transcription de gènes (les gènes inductibles par le stress), en se
fixant à d’autres séquences cibles {Wang et Ron, 1996 ; Ubeda et al, 1996).
introduction 11
La dimérisation est donc un moyen aisé permettant d’augmenter la sélectivité de reconnaissance des sites de liaison à l’ADN mais également de contrôler de manière plus subtile la transcription. Il n’y a pas que l’homo et l’hétérodimérisation entre membres de familles qui rendent plus complexe le contrôle de l’expression des gènes ; en effet, des facteurs transcriptionnels spécifiques peuvent également interagir avec des facteurs ubiquitaires. Ainsi, on a montré l’existence d’interactions entre membres de la famille C/EBP et membres de la famille JUN {Hsu et al, 1994), chacun d’entre-eux possédant un domaine de dimérisation riche en leucines. Les membres de la famille JUN participent au contrôle de la prolifération cellulaire mais jouent également des rôles plus spécifiques. Ils sont notamment impliqués dans le développement du foie {Hilberg et al, 1993). Par le fait qu’ils forment des hétérodimères avec des facteurs hépatiques, ils modulent donc aussi l’expression des gènes hépatiques.
3. Participation des facteurs à l’établissement et au maintien de la différenciation hépatique
Les facteurs transcriptionnels dit hépatiques sont généralement abondants dans le foie mais ils sont également présents dans d’autres tissus.
Nombreuses sont les études qui ont conduit à l’idée que c’est l’assortiment particulier en certains de ces facteurs qui détermine l’expression spécifique des fonctions hépatiques. Toutefois, le profil d’expression des fonctions hépatiques change en cours du développement du foie et par conséquent l’assortiment en facteurs a été supposé varier au cours de celui-ci.
Une corrélation a pu être établie entre l’ordre chronologique dans
lequel apparaissent ces facteurs au cours de l’ontogenèse et des étapes
développementales précises menant à la différenciation hépatique. Une
tentative a donc été faite pour établir une hiérarchie entre ces facteurs (Kuo et
al, 1992 ; Ang et al, 1993). Les membres de la familles HNF3 (HNF3(3 et a)
qui sont les premiers à être exprimés au cours du développement constituent le
premier niveau de cette hiérachie. HNF4 et HNFlp apparaîtraient au moment
de l’ébauche de la différenciation hépatique. Ils constituent donc le second
niveau alors que l’apparition plus tardive de HNFla serait corrélée à la
formation du foie. Enfin, les protéines appartenant à la famille C/EBP étant
Figure 5 ; représentation schématique du réseau transcriptionnel de régulation existant entre les différents facteurs hépatiques et non hépatiques. Celui-ci a été établi d'après Xanthopoulos et al., 1989 Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86, 4117-4121 ; Tian et Schibler, 1991 ; Kuo et al., 1992; SasaKi et al., 1994; Piaggio et al., 1994 Nue. Ac. Res. 22, 4284-4290;
Gualdi et al., 1996.
—►: signal de régulation positif
---
1: signal de régulation négatif
introduction 12
exprimées relativement tardivement et intervenant dans l’arrêt du cycle cellulaire, il a été suggéré qu’elles pourraient être critiques pour la différenciation terminale et pour le maintien de l’état non prolifératif des cellules hépatiques. L’élaboration des structures hépatiques de même que l’apparition séquentielle et ordonnée de ces facteurs au cours du développement sont certainement en partie conditionnées par les contacts intracellulaires ainsi que par des signaux extracellulaires {Cascio et Zaret, 1991 ; Liu et al, 1991; Gualdi et al, 1996).
Par ailleurs, certaines évidences expérimentales indiquent qu’il existerait également un niveau hiérarchique de contrôle entre ces facteurs dont l’expression est elle-même régulée au niveau transcriptionnel (Xanthopoulos et al., 1989; Cereghini et al, 1990). Il semble en effet que les facteurs hépatiques se contrôlent mutuellement et que certains sont capables de s’autoréguler {Tian et Schibler., 1991 ; Zhong et al, 1994 ; Sasaki et Hogan, 1994 ; Bulla et al, 1994 ; Legraverend et al, 1993) (figure 5). Ainsi par exemple, l’expression stable de HNF4 dans des cellules d’hépatome de rat dédifférenciées est capable d’activer le gène endogène silencieux codant pour le facteur HNFla {Kuo et al, 1992). En outre, les facteurs peuvent agir en concertation avec d’autres facteurs dont certains comme le complexe API sont ubiquistes mais d’autres sont exprimés spatiotemporellement.
HNFl et HNF4, bien qu’ils soient des facteurs clés contrôlant l’expression de nombreux traits hépatiques, s’avèrent cependant incapables d’activer la transcription de ces fonctions dans des cellules de différenciation non hépatique ou non différenciées {Bulla et al, 1992 ; Bulla et Fournier, 1994). De telles observations appuient non seulement l’idée qu’un facteur transcriptionnel est incapable d’induire la différenciation hépatique à lui seul mais également que l’activation différentielle des gènes nécessite sans doute l’établissement préalable dans ces cellules d’un état stuctural qui rend les gènes compétents. Celui-ci pourrait faire appel à des régions telles que les LCR et à leur association avec un assortiment spécifique de facteurs. De telles structures une fois établies pourraient alors se maintenir de façon autocatalytique en 1’ absence même des agents inducteurs.
Ces observations suggèrent également qu’il pourrait exister dans
les cellules d’autres différenciations des mécanismes qui empêcheraient
l’expression ectopique de ces gènes.
introduction 13
4. Extinction des fonctions différenciées dans les hybrides somatiques
4.1 les modifications associées au phénomène d’extinction
Les expériences d’hybridation somatique sont parmi les premières à avoir suggéré l’importance de la régulation négative dans l’établissement et le maintien du schéma d’expression spatiotemporelle des gènes de différenciation {Davidson et al, 1974 ; Ringertz et Savage., 1976 ; Gourdeau et Fournier, 1990 ; Boshart et al, 1993). Ces expériences ont permis de montrer que dans de nombreux cas, consécutivement à la fusion de cellules d’origines différentes, il y avait extinction des fonctions différenciées.
Les hybrides somatiques issus de la fusion de cellules hépatiques avec des fibroblastes, par exemple, cessent d’exprimer les fonctions caractéristiques de la différenciation hépatique {Szpirer et Szpirer, 1976; Church et al, 1984).
Des expériences de “run on ” ont établi que la répression touchant l’expression de ces fonctions et plus généralement celle des traits histospécifiques se fait au niveau de la transcription de leur gène respectif (Cereghini et al, 1990 ; Ben-Shushan et al, 1993), cette répression pouvant s’accompagner de modifications structurales des locus génétiques correspondants {Sperling et al, 1984 ; Tomy et al, 1990 ; Opdecamp et al,
1991 ; Ben-Shushan et al, 1993).
Par ailleurs, l’extinction de gènes hépatiques après fusion
cellulaire est associée à la disparition de facteurs transcriptionnels nécessaires
à l’expression de ces gènes {Cereghini et al, 1990 ; Bulla et al, 1992 ;
Boshart et al, 1993 ). Ainsi, les facteurs des familles C/EBP, HNFl, HNF3 et
HNF4 et les ARN messagers correspondants sont particulièrement abondants
dans le foie. Les mêmes ARN messagers ont été dosés dans des hybrides
montrant l’extinction des fonctions de différenciation hépatique ; ils y sont
peu abondants ou totalement absents. Par contre dans des hybrides dérivés
montrant une réexpression de ces mêmes fonctions, la réexpression
pléotropique des traits hépatiques est concomitante à celle des facteurs
HNFl a et HNF4 {Griffo et al, 1993).
Figure 6 : la fusion entre cellules somatiques constitue un outil pour étudier la différenciation cellulaire.
introduction 14
Des observations similaires ont également été rapportées pour d’autres gènes à expression histospécifique {Junker et al, 1990). Le gène codant pour la chaîne légère
kd’immunoglobuline s’éteint après la fusion des cellules exprimantes et des fibroblastes. L’extinction de ce gène est associée à la disparition du facteur OCT2 qui joue un rôle primordial dans l’activité du promoteur. Le gène codant pour l’hormone de croissance de rat ou GHr est, quant à lui exprimé exclusivement par les cellules somatotrophes du lobe antérieur de l’hypophyse. On sait maintenant que l’extinction de ce trait histospécifique dans des hybrides entre cellules pituitaires et fibroblastes est, entre autres, associée à la répression d’un gène codant pour le facteur PITl. Ce facteur n’est exprimé que dans un petit nombre de cellules dont les cellules somatotrophes. D’où, certains auteurs concluent que l’extinction résulte de la perte d’expression de facteurs transcriptionnels plutôt que de l’action d’un répresseur au niveau d’un site régulateur situé en amont du gène. On peut alors se demander comment se fait l’extinction des gènes codant pour les facteurs activateurs.
4.2 Fondement génétique du phénomène d’extinction
Il est établi depuis plusieurs années que le phénomène d’extinction dépend de l’expression de gènes {Killary et Fournier, 1984 ; Petit et al, 1986 ; Chin et Fournier, 1987). En effet, à partir de certains hybrides éteints, des dérivés réexprimants ont pu être obtenus et dans ces cas il a été observé que ces clones réexprimants ont perdu des chromosomes issus du parent extincteur (figure 6). De plus, d’autres travaux montrent que l’extinction est sujette au dosage de gènes {Malawista et Weiss., 1974). Ces observations suggèrent que la suppression des fonctions différenciées requiert la présence continue de gènes codant pour des facteurs régulateurs négatifs.
Afin d’isoler de tels gènes régulateurs, des expériences de fusion
ont été réalisées cette fois entre cellules hépatiques et microcellules dérivées
de fibroblastes {Killary et Fournier, 1984 ; Petit et al, 1986). Ces
microcellules ne contiennent qu’un nombre limité de chromosomes de la
cellule fibroblastique. Ces fusions ont donné naissance à des hybrides ne
contenant qu’un seul ou quelques chromosomes du parent fibroblaste; elles
introduction 15
ont démontré qu’un chromosome unique peut assurer l’extinction de certains marqueurs hépatiques. De tels chromosomes porteurs de locus extincteurs ont été identifiés par cette approche:
• le chromosome 11 de souris et le chromosome 17 humain sont porteurs d’un locus extincteur appelé TSEl pour Tissue Spécifie Extinguisher 1.
L’introduction du chromosome extincteur ou d’un fragment de celui-ci originaire de fibroblastes dans des cellules hépatiques, induit l’extinction de 7 gènes hépatiques dont ceux codant pour la Tyrosine Amino Transférase (TAT) et la Phosphoénol Pyruvate Carboxy-Kinase (PEPCK). TSEl code pour la sous-unité régulatrice RIa de la Protéine Kinase A (PKA). RIa inhibe l’activité de la PKA et ainsi la phosphorylation du facteur CREB médiateur de la réponse à l’AMPcyclique {Boshart et al, 1991; Jones et al, 1991). Or, l’expression de tous ces gènes nécessite une activation de la cascade de transduction de signal utilisant l’AMPe comme messager secondaire. RIa se comporte donc comme un modulateur de cette réponse, mais il ne s’agit pas d’un répresseur qui s’associe à une séquence cible de l’ADN. Le facteur RIa est présent non seulement dans les fibroblastes mais également dans les cellules hépatiques; toutefois il existe des différences dans le taux d’expression de cette protéine dans les deux types cellulaires, ceci explique que TSEl apparaît comme un extincteur.
• un autre locus extincteur dont le produit n’a pas encore été identifié intervient dans la répression de trois gènes hépatiques dont le gène codant pour l’albumine. Il a été identifié sur un chromosome distinct: le chromosome 1 de souris ou le chromosome 2 humain. Dans les cellules où a été introduit ce chromosome, l’extinction de l’albumine a lieu indépendamment de celle des facteurs HNFla et HNF4 contrairement à ce qui se passe dans les hybrides complets (Cerosaletti et Fournier, 1996). Il faut donc en conclure que l’extinction du gène albumine ne s’explique pas uniquement par la disparition de ces facteurs activateurs.
L’extinction apparaît donc comme le reflet d’un phénomène
complexe impliquant plusieurs facteurs régulateurs dont des facteurs négatifs
qui pourraient agir à différents niveaux de la cascade de régulation en inhibant
l’activité ou la synthèse de facteurs activateurs mais également en agissant
directement au niveau des gènes codant pour une fonction différenciée.
introduction 16
4.3 Identification de séquences régulatrices négatives
A l’heure actuelle, il existe plusieurs arguments qui appuient l’idée de mécanismes de répression transcriptionnelle agissant directement sur les gènes de différenciation dans les cellules non exprimantes. Les arguments les plus probants proviennent sans doute de l’identification de sites régulateurs négatifs dans les gènes eucaryotes et de l’isolement d’un nombre croissant de répresseurs {Herbst et al, 1988 ; Maue et al, 1990; Jackson et al, 1992;
Kageyama et Pastan, 1989; Cooney et al, 1992 ; Cowell et al, 1992 ; Fondell et al, 1993 ; Liu et al, 1994 ; Chong et al, 1995 ; Schoenherr et Anderson, 1995 ; Tanuma et al, 1995).
Comme les sites cibles d’une régulation positive, les sites de régulation négative sont le plus souvent localisés dans la partie 5’ adjacente au site d’initiation de la transcription, certains de ces éléments étant capables d’affecter l’activité d’un promoteur hétérologue indépendamment de leur position et de leur orientation. Ces séquences ont été mises en évidence par le fait que lorsqu’elles sont mutées elles provoquent une activation de la transcription des gènes placés sous leur contrôle. Des séquences de ce type ont été identifiées en amont du gène codant pour l’hormone de croissance de rat mais également en amont d’autres gènes de différenciation {Tripputi et al, 1988 ; Faraonio et al, 1990, Maue et al, 1990 Jackson et al, 1992 ). Leur rôle consisterait à prévenir l’expression inappropriée de ces gènes.
La découverte de ces sites régulateurs s’accompagne dans certains cas de l’identification des facteurs régulateurs qui s’y fixent. On a montré par exemple que le silencer le plus proximal du gène de l’hormone de croissance de rat se lie spécifiquement à une protéine trouvée dans les cellules non productrices. La séquence reconnue est similaire au site de liaison du facteur transcriptionnel ubiquiste NFl. La protéine régulatrice négative ne semble toutefois pas être le facteur NFl lui-même puisque le poids moléculaire de la protéine fixée diffère de celui de NFl mais il pourrait s’agir d’une isoforme {Roy et al, 1992). Récemment, un autre facteur régulateur nommé NRSF a été isolé {Chong et al, 1995 ; Schoenherr et Anderson, 1995).
Celui-ci régule négativement l’expression des gènes codant pour la synapsine
ou encore pour les canaux à sodium de type II dont l’expression est
intimement liée à la différenciation des neurones. Ce facteur appartient à la
introduction 17
famille des protéines porteuses d’un domaine KRAB parmi lesquelles on a identifié des répresseurs de la transcription chez la drosophile, comme par exemple la protéine “Krüppel”(Lzc/zt et al, 1990).
On peut supposer que la spécificité d’expression de gènes de différenciation relèverait de deux mécanismes distincts: d’une part, l’activation de gènes dans les cellules appropriées par des facteurs activateurs et d’autre part, la répression de ce même gène par des répresseurs dans les autres cellules.
5. Les mécanismes de répression transcriptionnelle actuellement connus
La répression transcriptionnelle chez les eucaryotes peut faire appel à des protéines régulatrices négatives dont l’organisation structurelle rappelle étonnamment celle des protéines activatrices avec des domaines fonctionnels distincts. Ces facteurs répresseurs peuvent exercer leur action de diverses manières suscitant ainsi des réponses différentes, certains d’entre-eux ayant même parfois été identifiés initialement comme des activateurs de la transcription. Différents modes de répression ont été décrits {Levine et Manley,
1989 ; RenKawitz, 1990 ; Cowell, 1994 ; Hanna-Rose et Hansen, 1996). On peut les classer arbitrairement en deux catégories: soit les répresseurs interfèrent avec l’action des activateurs, soit ceux-ci empêchent l’initiation correcte de la transcription.
5.1 Répression par interférence avec l’action des activateurs
Des facteurs régulateurs négatifs peuvent inhiber l’activité
transcriptionnelle d’un gène en entravant la fixation du facteur activateur par
compétition avec des facteurs régulateurs positifs pour un même site de
fixation à F ADN ou par encombrement stérique lorsque les sites de fixation se
chevauchent. La séquestration est également un moyen utilisé par certains
répresseurs pour empêcher des facteurs transcriptionnels de se fixer sur leur
site.
introduction 18
Dans d’autres cas, c’est la transmission du signal activateur vers le complexe d’initiation de la transcription qui est la cible du répresseur et ceci sans pour autant qu’en soit affectée la fixation des protéines activatrices à l’ADN. Le répresseur qui interfère avec l’action de l’activateur l’empêche alors de contacter correctement le complexe d’initiation de la transcription.
Celui-ci peut interagir directement avec l’activateur et masquer son domaine d’activation (phénomène dit de ‘’^quenching”) ou encore interagir avec un complexe activateur-coactivateur Ç^tethering'"’). Il peut également séquestrer un coactivateur ("‘squelching”) nécessaire à l’activité fonctionnelle de l’activateur. Enfin, il existe des répresseurs qui, comme la sous unité régulatrice de la protéine kinase A, agissent par le biais de modification postranscriptionnelle. En effet, un certain nombre de facteurs régulateurs comme le facteur CREE voient leur activité régulatrice modulée par des modifications postraductionnelles telles que des changements de phosphorylation .
Dans chacun des exemples cités, c’est le rapport entre les différentes molécules protagonistes, leur affinité respective et l’affinité de chacun des complexes protéiques pour le site de régulation qui déterminera en définitive l’état d’activité du gène.
5.2 répression par entrave de l’initiation de la transcription
Le répresseur peut également affecter la transcription en interférant directement avec la machinerie transcriptionnelle de base. L’action répressive est dirigée ici sur l’activité du complexe transcriptionnel et, par conséquent, s’oppose directement à l’initiation de la transcription. Le facteur régulateur négatif se lie à l’ADN en un site défini et désorganise le complexe transcriptionnel le rendant ainsi inaccessible aux facteurs activateurs. Cet effet inhibiteur peut augmenter significativement en présence d’un nombre répété de séquences régulatrices négatives.
Il existerait différentes manières d’empêcher les interactions
productives entre les éléments du complexe transcriptionnel de manière à
entraver soit la formation de celui-ci, soit la transition entre l’initiation et
l’élongation de la transcription. Il a notamment été suggéré que les répresseurs
introduction 19
contacteraient directement leur cible au sein du complexe transcriptionnel ou alternativement, qu’ils recruteraient des répresseurs généraux dont le rôle consiterait à empêcher soit la fixation de la protéine TBP à la boite TATA soit l’intégration d’autres facteurs transcriptionnels généraux au sein du complexe transcriptionnel. La mise au point d’une nouvelle technique de génie génétique, le système des doubles hybrides, a également permis la découverte de cofacteurs spécifiques, parmi lesquels figurent également des corépresseurs. Ceux-ci jouent le rôle de médiateur entre les facteurs fixés à l’ADN et la machinerie transcriptionnelle. Parmi les facteurs transcriptionnels que l’on trouve associés à ses cofacteurs spécifiques figurent entre autres les récepteurs hormonaux nucléaires. Ainsi, le récepteur à l’hormone thyroïdienne erbA P module généralement positivement l’activité transcriptionnelle en présence de son ligand et négativement en son absence. Il a été montré qu’en absence de ligand, le récepteur est associé à un corépresseur (SMRT) et que la fixation du ligand dissocie cette interaction permettant au récepteur d’activer la transcription (Chen et Evans, 1995). Très récemment il a été montré que ce corépresseur interagit lui-même avec d’autres cofacteurs, l’un d’entre-eux possédant des propriétés déacétylases {Hassig et al, 1997 ; Nagy et al, 1997).
L’association de ces différents facteurs aboutirait à la formation d’un complexe supramoléculaire qui favoriserait dès lors la création d’un environnement structurel peu propice à la transcription. Dans certains cas on a en effet pu établir l’existence d’un lien étroit entre la répression transcriptionnelle directe et des changements locaux de l’organisation de la structure chromatinienne. Ainsi comme le font certains facteurs régulateurs positifs, certains des facteurs régulateurs négatifs, en se fixant à des sites spécifiques, contribuent à l’établissement et au maintien d’un état structural transmissible.
II. LE CAS PARTICULIER DU GENE AFP
L’Alpha-Foetoprotéine, AFP, constitue avec l’Albumine l’une
des protéines majoritaires du sérum foetal. Ces deux glycoprotéines d’environ
70kD chacune, sont synthétisées au cours du développement des mammifères
et constituent des marqueurs précoces de la différenciation hépatique. Bien
qu’il soit admis que toutes deux sont impliquées dans le transport de
centromère
Albumine AFP
aFL Vit D binding protein
Time
AFP
9.5
Expression (timina) in the mouse Birth
_J_
