I. MATERIEL BIOLOGIQUE
1. Transfection en vue d’analyser l’expression de constructions chimériques
1.1 La transfection transitoire
La méthode utilisée est celle du précipité au phosphate de
calcium décrite par Gorman et al, 1982 moyennant les modifications
suivantes :
Le jour précédent la transfection, les cellules sont ensemencées
dans des boites de 10 centimètres de diamètre à raison de 2 10^ de cellules
pour HepG2, de 3.5 10^ pour 7777C8-G, de 5 10^ pour Fa32 et de 1.5 10^ de
cellules pour RSFTG3 en raison de leur croissance à rythme différent. La
transfection est réalisée dans un milieu DMEM contenant 5% de sérum. Le
milieu original est remplacé par ce milieu environ 1 heure avant la
transfection.
Matériel et Méthodes 33
La formation du précipité de phosphate de calcium s’obtient par
addition d’une suspension d’ADN-CaC12 à une solution HBS 2X (Tampon
Hepes 50 mM; NaCl 280 mM; Na2 HP04 1.5 mM ) amené à pH 7.1.
Pour chaque boite à transfecter, 250pl d’une solution d’ADN-
CaC12 sont préparés de la façon suivante: à 10 pg d’ADN transporteur sont
ajoutés successivement 1/10 du volume total de CaC12 2.5M et lOpg d’ADN
plasmidique portant la construction à tester . Les expériences sont réalisées en
présence d’un témoin interne de transfection, le plasmide pSV2LUC. Celui-ci
est ajouté à raison de 0,5pg lorsque les transfections sont réalisées en parallèle
dans les cellules RSFTG3 et HepG2 et de 1 pg lorsque celles-ci sont réalisées
dans les cellules HepG2, 7777 C8-G et Fa32. Une solution de Tris 10 mM
EDTA 1 mM, à pH 7.9 est ajoutée jusqu’à l’obtention du volume désiré. La
solution d’ADN est alors mélangée goutte à goutte à une solution d’HBS de
même volume qui est agitée au vortex. Au bout de quelques minutes à
température ambiante, un précipité opalescent se forme. Celui-ci est prélevé et
déposé sur chaque boîte. Après 8 heures d’incubation, le milieu présent à la
surface des cellules est remplacé par du milieu DMEM additioné de 10% de
sérum foetal.
1.2 Mesure de l’activité CAT
La transfection est réalisée ici en vue d’une mesure de l’activité
Chloramphénicol Acétyl Transférase due à la transcription du gène CAT et
révélatrice de l’efficacité de la région régulatrice placée en amont de ce gène
indicateur. Le principe du dosage CAT est basé sur le fait que l’enzyme
Chloramphénicol Acétyl Transférase inactive le Chloramphénicol en
l’acétylant en position 3; ce groupe acétyl peut passer de manière
indépendante d’enzyme en position 1 et une nouvelle acétylation en position 3
peut alors avoir lieu. Les différentes formes de chloramphénicol acétylé en
position 1, en position 3, et en position 1+3 peuvent être séparées par
chromatographie ascendante.
48 heures après la transfection, les cellules sont décrochées de
leur support à l’aide de trypsine et lavées au tampon phosphaté PBS. Le culot
de cellules est resuspendu dans 200 pi de tampon Tris 250mM pH 7.9 et
transféré dans un tube Eppendorf. Les cellules sont ensuite lysées par choc
Matériel et Méthodes 34
thermique comprenant trois cycles de congélation-décongélation, puis
centrifugées pendant 5 minutes. Le surnageant renfermant le contenu
cytoplasmique est récupéré et lOOpl sont transvasés dans un autre tube
Eppendorf en vue d’un dosage de l’activité luciférase; le reste est placé dans
un bain à 65 °C pendant 5 minutes. Ce traitement permet la dénaturation d’une
éventuelle activité acétylase endogène. Les extraits cellulaires sont à nouveau
centrifugés pendant 5 minutes. Pour les cellules HepG2 et RSFTG3, un
prélèvement de 50pl est ensuite effectué et 40pl de Tris 250 mM pH 7.9 y sont
ajoutés; pour les cellules Fa32 et 7777 C8-G, la quantité prélevée est de 90pl.
A cette fraction sont ajoutés successivement 2p,l de C*"* et lOpl d’une solution
d’Acétyl Coenzyme-A préparée fraîchement (1 mg acétyl Coa/100|Lil de Tris
12 mM).
Le mélange est placé dans un bain à 37 °C pendant 1 heure, pour
permettre à la réaction de s’effectuer. Après incubation, l’extraction des
différentes formes de Chloramphénicol est réalisée par l’Acétate d’Ethyl.
2 X 800 |Lil d’Acétate d’Ethyl sont donc ajoutés au mélange, celui-ci est agité
au Vortex jusqu’à homogénéisation, puis centrifugé pendant 5 minutes.
Les 1600 pi de la phase organique sont alors recueillis dans un tube Eppendorf
et mis à évaporer pendant 35 minutes. Dans chaque tube Eppendorf sont
ajoutés 20 pl d’Acétate d’Ethyl. Le contenu des tubes est homogénéisé par
agitation puis centrifugé pendant quelques secondes. Une quantité précise de
surnageant est déposée en un point sur une plaque de chromatographie sur
couche mince au moyen d’un tube capillaire. La plaque de chromatographie
est placée dans une cuve contenant un mélange de 95 ml de Chloroforme avec
5 ml de Méthanol. La migration permet la séparation des différentes formes de
Chloramphénicol. Une fois celle-ci terminée, la plaque est retirée de la cuve,
séchée, puis mise à autoradiographier pendant une nuit à température
ambiante.
Après chromatographie et autoradiographie, les régions de la
plaque de chromatographie correspondant aux taches (où ont migré les
différentes formes acétylées de Chloramphénicol) sont découpées et déposées
dans une fiole à scintillation contenant 1 ml d’Acétate d’Ethyl et 9 ml de
liquide scintillant. Les fioles sont ensuite placées dans un compteur destiné à
mesurer la radioactivité des échantillons. La quantité de radioactivité obtenue
pour chacun d’entre eux est une mesure de l’activité de l’enzyme CAT.
Celle-Matériel et Méthodes 35
ci sera ensuite normalisée par rapport à l’activité luciférase mesurée dans
chaque échantillon.
1.3 Dosage luciférase
Il consiste à mesurer l’activité luciférase présente dans les
cellules après transfection d’un plasmide où le gène codant pour l’enzyme de
ver luisant est placé sous le contrôle du promoteur précoce du virus SV40
(pSV2-LUC). Le dosage est fait selon la méthode décrite dans de Wet et
al, 1987.
50 des 100 pi d’extraits cellulaires prélevés avant choc
thermique, sont déposés dans un tube à essais et mélangés à 350 pl d’une
solution test de glycylglycine 25 mM (pH 7.8) comprenant de l’ATP 5mM
(provenant d’une solution stock 20 mM pH 7.5) et du MgS04 15 mM; le reste
des extraits est congelé à -20°C. Le tube est placé dans le luminomètre
(Lumac), la réaction est alors initiée par l’injection de 100 pl de luciférine 1
mM. Le pic d’émission lumineuse est enregistré et apparaît sur l’écran.
L’intensité de ce pic est une mesure de l’activité LUC
2. Etudes des interactions ADN-proteines in vitro
2.1 Préparation des extraits nucléaires à partir des cellules en culture
Les extraits nucléaires ont été préparés suivant les protocoles
décrits par Cereghini et al, 1987 moyennant les modifications suivantes.
Les noyaux ont été purifiés comme décrit dans ces protocoles
mais la composition du tampon A utilisée était la suivante : 10 mM Hepes
KOH pH 7.9; 10 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,1 mM EGTA; 0,5 mM DIT; 0,5
mM PMSF. Les noyaux ainsi purifiés sont resuspendus à raison de 10.^
noyaux pour 3 ml de tampon C (20 mM Hepes pH 7,9, 25 % glycérol; 0,42 M
NaCl; 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM EGTA; 0,5 mM PMSF). La suspension ainsi
obtenue est agitée pendant 30 minutes à 4°C.
Matériel et Méthodes 36
La Chromatine est sédimentée par une centrifugation de 20
minutes à 50.000 rpm dans un rotor Beckman SN 1038. Le surnageant est
recueilli et les protéines sont précipitées par l’addition de 0,3 g de (NH4)2S04
par ml de surnageant. Celles-ci sont ensuite culottées après une nouvelle
centrifugation de 30 minutes à 55.000 rpm dans un rotor Beckman SN 1038.
Les protéines sont remises en suspension à raison de 10^ noyaux
engagés pour 300 pi de tampon D (20 mM Hepes pH 7,9; 100 mM KCl; 20 %
glycérol; 1 mM DTT; 1 mM PMSF et 0,2 mM EDTA) et sont dialysées
pendant 2 à 4 heures contre du tampon D (500X en volume avec 1 changement
de tampon). Les extraits nucléaires sont alors centrifugés pendant 10 minutes
dans une centrifugeuse Eppendorf et le surnageant réparti en fractions de 20 pl
qui sont rapidement congelées dans l’azote liquide et peuvent être conservées
à - 80°C.
2.2 Expériences de footorintina in vitro à la DNase I
Ces expériences nécessitant généralement plusieurs étapes ont été
réalisées selon un protocole décrit dans Zhang et al, 1990 et modifiées
comme suit:
Les expériences de fixation des protéines à l’ADN ou réaction de
binding ont été réalisées dans un volume final de lOOpl d’une solution tampon
dont la composition est la suivante: lOmM Hepes-KOH; 30mM KCl;
12%glycérol; 0,5mM DTT; 0,4mM EDTA. Ces réactions ont été effectuées, en
présence de 4pg de polydI-dC, d’une quantité de fragment marqué
terminalement équivalente à Ing et de respectivement lOpg et 20pg d’extraits
de protéines nucléaires totales. Les mélanges sont alors maintenus pendant 30
minutes sur glace.
Vient alors l’étape de digestion à la DNase I. Celle-ci se réalise
en présence d’enzyme en proportion variable; c’est pourquoi, plusieurs tubes
Eppendorf contenant des dilutions successives d’une solution stock d’enzymes
sont préparés. Ces dilutions s’échelonnent de 0,003 à 3U. 5pl de chacune des
dilutions sont prélevés et ajoutés aux tubes Eppendorf contenant la réaction de
Matériel et Méthodes 37
binding. Les tubes sont incubés pendant 1 minutes à 25°C afin de permettre à
la DNase d’agir. La réaction est arrêtée à l’aide de 200|j,l d’une solution 20mM
EDTA; 0.5% SDS; 20mM Tris PH7.5 contenant 7pg/ml de ssDNA et
lOOpg/ml de protéinase K. Les tubes sont ensuite placés pendant 30 minutes à
60°C. Les protéines sont éliminées par une extraction au phénol chloroforme
et TADN est précipité. Celui ci est resuspendu dans 6pl d’une solution dont la
composition est identique à celle utilisée pour stopper la digestion à la Dnase I
et le mélange est placé à -20°C.
Parallèlement à la réaction de digestion à la DNase I et dans le
but de localiser les séquences protégées et /ou les sites plus sensibles à la
DNasel, la sonde -201+33 a été séquencée selon la méthode de Maxam et
Gilbert en utilisant l’acide formique qui clive spécifiquement au niveau des
purines (réaction G+A). On prépare dans un tube Eppendorf stérile une
solution de lOpl qui contient 3 à 6ng de fragment marqué, Ipg de DNA de
thymus de veau. Le volume de la solution est amené à lOpl à l’aide du tampon
Tris lOmM EDTA ImM PH 7.9. A cette solution, on ajoute Ipl d’acide
formique 4%; le tube Eppendorf est ensuite placé pendant 25 minutes à 37°C.
La solution de pipéridine IM est préparée et maintenue sur glace jusqu’à
utilisation. Après incubation, 150pl de la solution pipéridine est introduite
dans le tube Eppendorf qui est placé dans un bain à 90° C pendant 30minutes.
La réaction est ensuite maintenue sur glace pendant 5 minutes et 1ml de
butanol y est ajouté. Le tout est agité puis mis à centrifuger pendant 2 minutes.
Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 150pl de SDS 1%.
1ml de butanol est ajouté et le tout agité au vortex avant d’être centrifugé une
nouvelle fois. Le culot est alors rincé 2X avec 0.5ml de butanol avant d’être
séché pendant 10 minutes; 5 à lOpl de tampon de charge sont utilisés pour
remettre le culot d’ADN en suspension. La réaction est conservée à -20°C.
l’ADN est dénaturé pendant 2 minutes à 90°C. Après quoi, 3pl de
la réaction de footprinting et 3 pi de réaction G+A comme témoin de taille sont
déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant 6%. Une fois la migration
terminée, le gel est mis à sécher et autoradiographié. Les réactions contenant
les quantités de DNasel donnant les plus belles images d’empreintes sont
ensuite sélectionnées et remises sur un nouveau gel.
Matériel et Méthodes 38
2.3 Expériences de retard de migration sur gel.
La sonde utilisée dans ces expériences est un fragment Sall-Xbal
d’environ 50 paires de bases, correspondant à la séquence promotrice AFP
comprise entre les positions -80pb et -38pb et flanquée de segments issus du
polylinker. Cette séquence peut être excisée par une double digestion Sali et
Xbal du polylinker du plasmide pBLCAT2, La sonde est marquée par une
opération consistant à combler les extrémités 5’ simple brin, générées par la
restriction enzymatique, à l’aide de nucléotides marqués et de 1’ ADN
polymérase de Klenow. Elle est ensuite isolée sur un gel acrylamide 8%.
La réaction de fixation des protéines s’opère dans un volume final
de 25pl. Les extraits sont d’abord préincubés pendant 15 minutes à 0°C en
présence de compétiteur non spécifique (Ipg de poly dl-dC) dans un tampon
(20mM Hepes-KOH pH 7,9; 50 mM NaCl; 2mM MgClj; ImM EDTA; 0,5
mM DTT). Ensuite, 30 picogrammes de sonde marquée sont ajoutés à cette
réaction, et le mélange est incubé pendant 15 minutes à 0°C.
Ces échantillons sont chargés sur un gel de polyacrylamide 6 %
réalisé dans un tampon TBE et préalablement soumis à une tension de 120V
pendant environ 1/2 heure. Les différents complexes ADN-protéines sont
séparés à température ambiante. Après migration le gel est fixé dans une
solution (10% d’acide acétique; 10% méthanol; 10% glycérol) avant d’être
séché et mis à autoradiographier.
2.4 Expériences de Southwestern Blottina
Cette technique est une variante de la technique de Western Mot
dans laquelle les protéines ayant préalablement été séparées sur un gel
polyacrylamide dénaturant sont transférées ensuite sur un filtre de
nitrocellulose. Ce filtre sera alors mis en contact avec un fragment d’ADN
marqué radioactivement afin de repérer les protéines qui s’y fixent. On peut
résumer les différentes étapes de cette expérience en quelques points
principaux:
Matériel et Méthodes 39
Les échantillons contenant les extraits nucléaires de protéines sont tout
d’abord déposés sur un gel de polyacrylamide 7.5 % (SDS -page) et soumis à
migration. Une fois la migration terminée ceux-ci sont transférés sur une
membrane de nitrocellulose.
Après transfert, les membranes ainsi obtenues sont mises à préhybrider 1 à 2
heures dans une solution tampon ( 2.5% de lait dégraissé; 20mM Hepes-KOH
pH 7,9; 50 mM NaCl; 2mM MgC12; ImM EDTA; 0,5 mM DTT).
Les membranes sont ensuite mises à hybrider pendant plusieurs heures dans
une solution tampon identique à la précédente mais en absence de lait. Celle-ci
contient la sonde à raison d’au moins 2 10^ cpm/ml et en plus, du compétiteur
non spécifique ( ssDNA) à raison de lOpg/ml.
Après hybridation, les filtres sont lavés 5 à 10 minutes dans 100-200ml d’une
solution (20mM Hepes-KOH pH 7,9; 50 mM NaCl; 2mM MgC12; ImM
EDTA; 0,5 mM DTT). Le lavage est répété trois fois, les filtres sont ensuite
mis à sécher et à exposer
AFP
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Fibroblastes
AFP-6
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Figure 1 Structure schématique du gène AFP et stratégie utilisée pour Tétude fonctionnelle de la région
promotrice (HAF).
Résultats 40
RESULTATS
I. ANALYSE COMPARATIVE DE L’ACTIVITE DE LA REGION
PROMOTRICE DU GENE AFP DANS DES CELLULES D’HEPATOME
PRODUCTRICES ET NON PRODUCTRICES D’AFP ET DANS DES
FIBROBLASTES
Le gène AFP est exprimé dans les cellules hépatiques au stade
foetal ou à l’état adulte dans certaines cellules d’hépatome mais jamais dans
les cellules normales d’autres différenciations telles que des fibroblastes. Nous
nous sommes dès lors posés la question de savoir quels sont les mécanismes
de régulation mis enjeu par ces différentes cellules pour assurer la spécificité
d’expression du gène. Il s’agit plus particulièrement d’examiner si la non
expression de celui-ci est contrôlée par un mécanisme de régulation commun
dans les différentes cellules non productrices d’AFP qu’elles soient d’origine
hépatique ou non. Nous avons donc envisagé de repérer des régions
régulatrices responsables de cette absence d’expression. Des études antérieures
menées au laboratoire sur l’expression du gène AFP ont montré que la région
promotrice qui s’étend de la position -1023pb à + 33pb (région HAF) est à
l’image du gène endogène, dépourvue de toute activité dans les fibroblastes
de rat de la lignée RSFTG3 ainsi que dans les cellules d’hépatome de rat non
productrices d’AFP de la lignée Fa32.
Afin de repérer dans cette région les séquences responsables de ce
comportement, la région promotrice HAF a donc été progressivement délétée à
partir de son extrémité 5’ pour donner les fragments dont l’extrémité 5’ est
située à -608pb, -371pb, -201pb et -80pb (voir figure 1). Pour des raisons de
facilité de construction, ces séquences ont été introduites dans un vecteur
commercial, le plasmide pCAT-Basic contenant un polylinker, plutôt que dans
un plasmide pBR322 qui avait été utilisé lors des expériences antérieures. La
rigueur nous imposait donc d’introduire également la séquence HAF dans le
plasmide pCAT-Basic.
Résultats 41
Dans ces expériences de transfection, nous avons utilisé comme
témoin négatif, le plasmide pCAT-Basic où le gène indicateur n’est précédé
d’aucune séquence promoteur ou enhancer eucaryote et comme témoin positif,
le plasmide pSV2-CAT où le gène indicateur est précédé de la région
promoteur enhancer SV40. Nous avons transfecté ces constructions dans des
cellules d’hépatome productrices d’AFP et non productrices d’AFP ainsi que
dans des fibroblastes (non producteurs d’AFP).
Ces expériences ont été réalisées en présence d’un témoin interne
de transfection, particulièrement indiqué dans le cas ou l’on étudie des effets
régulateurs négatifs. Le contrôle interne permet en effet de distinguer
l’absence d’activité d’une construction due à une efficacité médiocre de
transfection, d’une expression faible voire nulle de cette construction. Le
plasmide pSV2-LUC où le gène codant pour l’enzyme luciférase est placé en
amont du promoteur-enhancer du virus SV40, a été choisi comme témoin de
transfection. La sensibilité du dosage luciférase en fait un contrôle interne
idéal. Les très faibles quantités de plasmide pSV2-LUC que l’on peut utiliser
rendent négligeables la possibilité d’une compétition entre le plasmide servant
de témoin interne et les différentes constructions dont on veut mesurer
l’activité.
Nous disposions de lignées productrices ou non d’AFP bien
caractérisées d’origine rat: 7777C8-G et Fa32, lignées de cellules d’hépatome
respectivement productrices et non productrices d’AFP et RSFTG3, lignée de
fibroblastes. Nous avons également indu dans cette analyse la lignée de
cellules d’hépatome humain productrices d’AFP, HepG2; elle a été utilisée par
de nombreuses équipes de chercheurs qui analysent le contrôle de l’expression
de l’AFP et sert de référence.
Les résultats de ces expériences rapportés dans le tableau 1 sont
illustrés par la figure 2
Figure 2
Légende des figures 2A et 2B : Mesure de I' Activité des constructions
dérivées du pHAF-CAT-Basic après transfection dans différentes lignées cellulaires; (A)
dans les cellules productrices d'AFP d'origine humaine (HepG2) et d'origine rat
(7777 C8-G); (B) dans les cellules non productrices d'AFP d'origine rat (Fa32) et
(RSFTG3). Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle positif pSV2-CAT
après avoir été normalisés par rapport à l'activité du plasmide contrôle interne pSV2-LUC.
CM: chloramphénicol, CM-AC: Chloramphénicol monoacétylé, CMdiAC: Chloramphénicol
diacétylé
1: pSV2-CAT
2: p-CAT-Basic
3: pHAF-CAT-Basic =(p-1023+33)-CAT-Basic
4: p(-608+33)-CAT-Basic
5: p(-371+33)-CAT-Basic
6: p(-201+33)-CAT-Basic
7: p(-80+33)-CAT-Basic
Résultats 42
Tableau 1: Activité relative des différentes constructions chimériques
AFP-CAT dans des lignées de cellules d’hépatome et de fibroblastes.
Constructions
chimériques
CAT
cellules
d’hépatome
humain (AFP+)
HepG2
cellules
d’hépatome
de rat (AFP+)
7777 C8-G
cellules
d’hépatome
de rat (AFP-)
Fa32
fibroblastes
de rat
( afp-)
RSFTG3
pSV2-CAT(1) 100% 100% 100% 100%
pHAF-CAT-Basic (3) 150% 46% 2.95% 8.5%
p(-608+33)-CAT-B (4) 160% 39% 2.5% 8.5%
p(-371+33)-CAT-B (5) 130% 55% 4% 10%
p(-201+33)-CAT-B(6) 175% 75% 6% 13%
p(-80+33)-CAT-B (7) 50% 30% 5% 13%
p-CAT-Basic (2) 3% 2.5 % 2% 9%
Les résultats du tableau I et illustrés par la figure 2 sont exprimés en pourcentage d’activité
relativement à celle du contrôle positif pSV2-CAT après avoir été normalisés par rapport à l’activité
du plasmide contrôle interne pSV2-LUC. L’activité spécifique du pSV2-CAT (considérée comme
égale à 100%) est exprimée en pmoles de Chloramphénicol Acétylé/ Heure /Unité Lumière. Elle
équivaut à 5 10'^ pm C.A./H./U.L. dans HepG2, à 3 10‘^pm C.A./H./U.L. dans 7777 C8-G, à 1,3
10’7 pm C.A./H./U.L. dans Fa32 et à 1,3 10'^ pm C.A./H./U.L. dans RSFTG3. Chaque résultat est
une moyenne d’au moins trois valeurs obtenues chacune lors d’expériences indépendantes. L’écart
entre ces différentes valeurs et la moyenne ne dépasse pas 15%.
A.) Les résultats montrent que dans les cellules d’hépatome productrices
d’AFP (fig. 2A) qu’elles soient d’origine humaine (HepG2) ou de rat (7777
C8-G), la région promotrice de 1056 pb (HAF) ou les fragments qui en
dérivent sont tous actifs. Toutes ces constructions chimériques sont en effet
responsables d’une activité CAT substantielle:
1) la construction p(-608+33)-CAT-Basic qui a été délétée des 415 pb
situées à l’extrémité 5’ par rapport à la séquence HAF montre en effet une
activité comparable à celle-ci ;
2) une délétion 5’ supplémentaire de 237pb ne modifie pas non plus
l’activité promotrice puisque la construction p(-371+33)-CAT-Basic
manifeste une activité du même ordre de grandeur que la construction
contenant la région promotrice entière;
Figure 2
B
CM-AC CM:
1 : pSV2-CAT
2: p-CAT-Basic
3: pHAF-CAT-Basic =(p-1023+33)-CAT-Basic
4: p(-608+33)-CAT-Basic
5: p(-371 +33)-CAT-Basic
6:p(-201+33)-CAT-Basic
7: p(-80+33)-CAT-Basic
Résultats 43
3) la construction où le gène CAT est précédé de la séquence promotrice
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