Vecteurs d’expression

pBlCAT2 {Luckow et Shutz., 1987) (figurel): dans ce plasmide, le gène

indicateur CAT est placé sous le contrôle du promoteur du gène de la

thymidine Kinase (TK). La présence d’une séquence polylinker en amont du

promoteur hétérologue TK permet le clonage de séquences dont on veut

étudier l’activité régulatrice.

pBlCAT3 {Luckow et Schutz, 1987): ce plasmide est dérivé du précédent par

délétion de la séquence promotrice TK. Il ne contient aucune séquence

promotrice eucaryote placée devant le gène indicateur CAT.

pHAF-TK-CAT(Mo/«d et al, 1989) (figurel): dans cette construction, la

région promotrice du gène AFP (HAF) comprise entre les positions -1023pb et

+33pb a été placée devant le promoteur TK

p(-37+33)-TK-CAT: ce plasmide a été généré par une délétion de la séquence

-1023-38 de la région HAF suite à une digestion du plasmide pHAF-TK-CAT

par les enzymes de restriction HindlII-EcoNI. Ce plasmide contient donc en

amont du promoteur TK, le promoteur AFP minimum qui renferme la TATA

box

p(-1023-38)-TK-CAT; ce plasmide est dérivé du plasmide pHAF-TK-CAT

dans lequel une délétion EcoNI-BamHI a éliminé le segment d’ADN

correspondant à une portion du promoteur du gène AFP compris entre les

positions -37pb et +33pb. Cette construction est la complémentaire de la

précédente.

p(-608-38)-TK-CAT: ce plasmide a été construit en excisant du plasmide

pHAF-TK-CAT le fragment PvuII- EcoNI dont les extrémités sont rendues

Matériel et Méthodes 28

franches et en clonant ce fragment au site Xbal comblé du plasmide

pBLCAT2.

p(-371+33)-TK-CAT: ce plasmide a été construit en excisant le fragment

Ndel compris entre les positions -371pb et -80pb du plasmide pHAF-

CAT{Molné et al, 1989) et en l’introduisant au site Ndel du plasmide p(-

80+33)-TK-CAT.

p(-371-38)-TK-CAT : ce plasmide a été obtenu après une double digestion

EcoNI-BamHI du plasmide p(-371+33)-TK-CAT. Les extrémités libres du

plasmide ont ensuite été comblées puis le plasmide religué.

p(-201+33)-TK-CAT: ce plasmide a été construit en insérant un fragment

MboII comblé-BamHI issu du plasmide pHAF-TK-CAT dans le plasmide

pBlCAT2 entre les sites Xbal comblé et BamHI. Ce plasmide contient donc,

placée en amont du promoteur TK, la région promotrice proximale du gène

AFP.

p(-201-38)-TK-CAT: ce plasmide a été obtenu après une double digestion

EcoNI-BamHI du plasmide p(-201+33)-TK-CAT. Les extrémités libres du

plasmide ont été ensuite comblées puis le plasmide religué.

p(-80+33)-TK-CAT: ce plasmide est le résultat d’une délétion Ndel du

plasmide pHAF-TK-CAT qui élimine de la région de HAF, la portion située

en amont de la position -80pb.

p(-80-38)-TK-CAT: ce plasmide a été obtenu après insertion d’un

oligonucléotide de synthèse correspondant à la séquence d’ADN issue du gène

AFP comprise entre les positions -80pb et -38pb. Ce fragment bordé en 5’ par

le site de restriction sali et en 3 ’ par le site Xbal, a été inséré dans le plasmide

pBlCAT2 préalablement digéré par les mêmes enzymes.

p(-80-38)2X-TK-CAT: ce plasmide a été obtenu après ligation des fragments

suivants:

-un fragment Xbal comblé - Kpnl du plasmide p(-80-38)-TK-CAT

-un fragment Sali comblé - Kpnl du plasmide p(-80-38)-TK-CAT

Matériel et Méthodes 29

p(-80-38)3X-TK-CAT: ce plasmide a été obtenu après ligation des fragments

suivants:

-un fragment Xbal comblé - Kpnl du plasmide p(-80-38)-TK-CAT

-un fragment HindlII comblé - Kpnl du plasmide p(-80-38)2X-TK-CAT

p(-80-38)4X-TK-CAT: ce plasmide a été obtenu après ligation des fragments

suivants:

-un fragment Xbal comblé - Kpnl du plasmide p(-80-38)2X-TK-CAT

-un fragment Sali comblé -Kpnl du plasmide p(-80-38)2X-TK-CAT

p(-584-371)-TK-CAT (Houart et al, 1990): ce plasmide a été construit en

insérant dans le site Xbal comblé du plasmide pBLCAT2, un fragment Ndel

de 213pb généré par restriction enzymatique du plasmide pHAF-CAT.

p(-584-548)-TK-CAT: ce plasmide a été construit en insérant un

oligonucléotide de synthèse dont la séquence correspond au segment de la

région HAF compris entre les positions -584pb et -548pb. Ce segment bordé

en 5 ’ par le site de Sali et en 3 ’ par Xbal a été cloné devant le promoteur TK

du plasmide pBLCAT2 entre les sites Sali et Xbal.

p(-547-512)-TK-CAT: ce plasmide a été construit en insérant un

oligonucléotide de synthèse dont la séquence correspond au segment de la

région HAF compris entre les positions -547pb et -512pb. Ce segment bordé

en 5’ par le site de Sali et en 3’ par Xbal a été cloné devant le promoteur TK

du plasmide pBLCAT2 entre les sites Sali et Xbal.

p(-446-400)-TK-CAT: ce plasmide a été construit en insérant un

oligonucléotide de synthèse dont la séquence correspond à un segment de la

région HAF compris entre les positions - 446pb et -512pb. Ce segment bordé

en 5’ par le site de Sali et en 3’ par le site Xbal a été cloné devant le

promoteur TK du plasmide pBLCAT2 entre les sites Sali et Xbal.

p(-62-38)-TK-CAT: ce plasmide a été construit en insérant un

oligonucléotide de synthèse dont la séquence correspond à la partie droite du

fragment -80-38. Celui-ci bordé en 5’ par le site de Sali et en 3’ par le site

Xbal, a été cloné devant le promoteur TK du plasmide pBLCAT2 entre les

sites Sali et Xbal.

Ampr; gène de résistance à l'ampiciline

CAT: gène codant pour l'enzyme Chloramphénicol Acétyl Transférase

SV40: "small T antigen région"

Matériel et Méthodes 30

p(-62-38)3X-TK-CAT: ce plasmide a été construit en insérant un multimère

3fois de la séquence -62pb -38pb entre les sites Sali et XbAI du plasmide

pBLCAT2.

p(-80-38)MUTC-TK-CAT, 38)MUTD-TK-CAT, et

p(-80-38)MUTCD-TK-CAT: ces plasmides ont été construits en suivant la même

stratégie de clonage que celle utilisée pour construire le plasmide p(-80-38)-

TK-CAT

p(-80-38)MUTC2X-TK-CAT, p(-80-38)MUTD2X-TK-CAT et p(-80-

38)MUTCD2X-TK-CAT: ces plasmides ont été construits de la même

manière que la construction sauvage à partir des constructions mutantes

équivalentes.

pSV2-CAT (Gorman et al, 1982): ce plasmide porte le gène indicateur codant

pour la chhloramphénicol acétyl transférase (CAT) précédé de la région

pvomoieuY-enhancer du virus SV40.

p-CAT-Basic (figure 3): le plasmide pCAT- basic est un plasmide

commercial de la firme Proméga dérivé d’un pBR322. Il contient un gène de

résistance à l’ampiciline. Ce plasmide a été choisi parce qu’il présente des

facilités de clonage du fait de la présence d’un polylinker situé juste en amont

du gène CAT. Ce plasmide a permis les constructions suivantes:

pHAF-CAT-Basic: le segment de la région HAF compris entre les positions

-1023 pb et -38pb a été excisé du plasmide pHAF-TK-CAT après double

digestion de celui-ci par les enzymes de restriction EcoNI-HindlII. Ce

fragment a ensuite été inséré dans le plasmide p(-371+33)-CATbasic digéré

par les mêmes enzymes après avoir éliminé la région comprise entre la

position -371pb et -38pb.

p(-608+33)-CAT-Basic: ce plasmide a été construit par insertion d’un

fragment PvuII- XBal isolé à partir du plasmide pHAF-CATBasic, dans le

polylinker du plasmide pCAT-basic entre les sites Sali et Xbal après avoir

Matériel et Méthodes 31

p(-371+33)-CAT-Basic: cette construction est dérivée du plasmide

p(-371+33)-TK-CAT qui après digestion par les enzymes BglII-BamHI et

élimination du fragment plasmidique correspondant au promoteur TK a été

refermée. Le plasmide obtenu a été doublement digéré par les enzymes Pstl-

Xbal et le fragment de 371pb ainsi produit a été cloné dans le polylinker du

pCAT-Basic entre les sites Pstl-Xbal.

p(-201+33)-CAT-Basic: cette construction est dérivée du plasmide

p(-201+33)-TK-CAT. Ce plasmide, après double digestion par les enzymes

BglII-BamHI et élimination du fragment plasmidique correspondant au

promoteur TK a été religué, puis digéré par les enzymes Pstl-Xbal afin de

généré le fragment de 200pb. Ce fragment de 200 pb qui correspond au

promoteur proximal du gène AFP a été réinséré dans le polylinker du pCAT-

Basic entre les sites Pstl-Xbal.

p(-80+33)-CAT-Basic: le fragment -80-38 a été isolé en plusieurs étapes à

partir du plasmide pHAF-TK-CATqui a tout d’abord été délété du promoteur

TK par une double digestion BglII-BamHI, puis soumis à une digestion Ndel

afin d’éliminer de la région HAF la partie située en amont de la position -80pb

avant d’être religué. La construction ainsi obtenue est à nouveau digérée par

les enzymes Ndel- Xbal libérant le fragment de 80pb correspondant à la partie

proximale du promoteur AFP. Celle-ci est réinsérée dans le plasmide pCAT-

Basic entre les sites Sali comblé -Xbal

pSV2-LUC: un fragment contenant le promoteur-ew/iawcer du virus SV40 a

été isolé par digestion PvuII-HindlII du plasmide pSV2-CATet inséré dans le

plasmide pXp2 {Nordeen, 1988) en amont du gène codant pour la luciférase

entre les sites Smal- HindlII.

Tous ces plasmides ont été purifiés sur des colonnes Quiagen.

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