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tensioactifs
Magalie Manaargadoo-Catin
To cite this version:
Délivré par l’Université de Montpellier
Préparée au sein de l’école doctorale Sciences Chimiques
Balard (ED459)
Et de l’unité de recherche des Biomolécules Max
Mousseron (IBMM)- UMR 5247
Spécialité : Ingénierie Moléculaire
HORIBA Medical
Présentée par Magalie MANAARGADOO-CATIN
Soutenue le 14 décembre 2015 devant le jury composé de
Mme. Catherine BRAUN-BRETON Présidente
Professeur des universités, Université de Montpellier
Mme. Maïté PATERNOSTRE Rapporteur
Directeur de recherche, CEA Saclay
M. Igor CLAROT Rapporteur
Maitre de conférences, Université de Lorraine
M. Manouk ABKARIAN Examinateur
Chargé de recherche, CNRS Montpellier
Mme. Jocelyne ADJEMIAN Encadrante
Ingénieur de recherche, HORIBA Médical Montpellier
Remerciements
Les travaux de recherche présentés dans cette thèse ont été réalisés entre l’entreprise HORIBA Medical à Montpellier et l’Institut des Biomolécules Max Mousseron au sein de l’équipe Sciences Analytiques des Biomolécules et Modélisation moléculaire sous la direction du Professeur Catherine PERRIN. Je tiens à la remercier et à lui exprimer ma reconnaissance pour m’avoir accueillie régulièrement au sein de son laboratoire. Je remercie également Arnaud PRADEL, Directeur du Développement Produit d’HORIBA Medical, Sylvain JACQUEMIN, Directeur de l’Innovation d’HORIBA Medical et Gilles CAUET, Responsable de la BU Réactif, pour m’avoir accueillie au sein de leur entreprise, pour leur confiance quant à la réalisation de ce projet et pour la collaboration réalisée dans l’équipe physique et morphogénèse de microcirculation de Manouk ABKARIAN. J’exprime également ma reconnaissance à mes encadrants successifs d’HORIBA Medical, Sylvie VERIAC, Jean-Luc POUGNAS et Jocelyne ADJEMIAN pour le suivi de mes travaux.
Mes sincères remerciements à Mme Maïté PATERNOSTRE, Directeur de Recherche au CEA à Saclay pour avoir pris le temps de rapporter et d’échanger avec moi sur mon manuscrit. Un grand merci à M. Igor CLAROT, Maitre de conférences à l’Université de Lorraine pour avoir jugé en tant que rapporteur ce travail. Je remercie chaleureusement Mme Catherine BRAUN-BRETON, Professeur des universités à l’Université de Montpellier, pour nos échanges sur l’un des chapitres de mon manuscrit et M. Manouk ABKARIAN, Chargé de recherche au CNRS de Montpellier, pour avoir consenti à examiner ce travail.
J’exprime plus particulièrement ma reconnaissance et ma gratitude à Monsieur Manouk ABKARIAN pour sa disponibilité, ses conseils, sa confiance, ses encouragements, son soutien, son accueil au sein de son équipe lors de notre collaboration. Pour tout cela MERCI Manouk.
Je souhaite également remercier toutes les personnes de l’équipe de la BU Réactif d’HORIBA Medical (Nevzat, Christophe, Christelle, Agnès, Laurence, Anne, Elodie et Mélanie). Je remercierai tout particulièrement Anaïs et Aurélien pour leur disponibilité et leurs connaissances scientifiques. Merci Aurélien pour les nombreuses relectures de mon manuscrit, nos échanges mathématiques, ton soutien et les nombreux conseils que tu m’as apportés pendant ces trois ans. Un grand MERCI aux techniciens, stagiaires et doctorants qui ont égayé ma thèse. Je pense en particulier à Jessica, Emilie, Elina, David, Guillaume, Valentin et Jeff. Merci aux collègues pour les petits restaurants du vendredi midi (Nina, Christelle, Martine, HK, Nelly, Axelle, Sylvie).
Je tiens à remercier toutes les personnes qui m’ont soutenue pendant ces trois années, je pense à mes amis, ma famille et ma belle-famille. Un grand merci à mes beaux parents, Jocelyne et Paul, pour avoir pris le temps de lire ma thèse. Merci pour l’écoute que vous m’avez apportée et tous vos conseils.
!
Tables des matières
1.
Introduction générale
... 1
2.
Chapitre 1 – Hemolysis by surfactants
... 3
ABSTRACT
... 4
Contents
... 5
1. Introduction
... 6
2. Erythrocyte membrane characteristics
... 7
a. Composition and function ... 7
b. Erythrocyte shape and parameters influence ... 10
3. Surfactants and their interactions with erythrocyte membrane ... 12
a. The surfactant micellization mechanism ... 12
b. Erythrocyte lysis mechanisms by surfactants ... 12
i. Osmotic way lysis ... 12
ii. Membrane solubilization ... 13
iii. The specific case of saponins : potential lysis mechanisms ... 15
c. Other effects of surfactant on membrane... 16
i. Cell lysis protective properties of surfactants in hypotonic media... 16
ii. Morphological change of erythrocyte induced by surfactants ... 16
4. Surfactants erythrolytic potency regarding their physicochemical properties ... 17
a. Physicochemical parameters and descriptors of first group surfactants ... 17
b. Experimental conditions influence ... 22
5. Conclusion ... 24
Table 1 ... 25
Reference ... 32
Additional informations ... 45
3.
Chapitre 2 – Matériels et méthodes
... 53
3.1.Molécules sélectionnées
... 53
3.2.Tests lytiques sur les cellules sanguines
... 56
3.2.1. Détermination du pouvoir érythrolytique des tensioactifs ... 57
3.2.1.2. Principe du test hémolytique ... 57
3.2.2. Mise au point d’un nouveau protocole hémolytique ... 58
3.2.2.1. Choix du matériel biologique ... 58
3.2.2.2. Variation du spectre de l’hémoglobine ... 60
3.2.2.3. Protocole hémolytique ... 63
3.2.2.4. Traitement des données ... 64
3.2.2.5. Cinétique d’hémolyse... 66
3.2.3. Détermination du pouvoir lytique des tensioactifs sur les GB par cytométrie en flux ... 67
3.2.3.1. Principe de la Cytométrie en flux ... 68
3.2.3.2. Protocoles ... 70
3.2.3.3. Cinétique de lyse des GB ... 72
3.2.4. Automate de biochimie ABX Pentra 400 ... 72
3.2.5. Modification des propriétés de perméabilité et mécaniques des GR ... 74
3.2.5.1. Déplétion en ATP ... 74
3.2.5.2. Urée ... 76
3.2.5.3. Phosphorylation de la protéine 4.1R ... 77
3.2.5.4. Inhibition de l’aquaporine par le chlorure de mercure ... 77
3.2.5.5. Inhibition de la bande 3 par le DIDS ... 78
3.2.5.6. Déplétion en cholestérol par la MβCD ... 79
3.2.6. Etude Microscopique ... 79
3.2.6.1. Microscope ... 79
3.2.6.2. Poly-L-lysine-PEG... 80
3.2.6.3. Marquage des GR au PKH26 ... 80
3.3. Etude physico-chimique
... 81
3.3.1. Caractérisation des tensioactifs par HPLC-MS et HPLC-Corona ... 81
3.3.2. Détermination des CMC ... 81
3.3.2.1. Détermination de la CMC par tension de surface - Méthode Wilhelmy ... 82
3.3.2.2. Détermination de la CMC par l’utilisation d’un colorant... 83
3.3.3. Evaluation du coefficient de partage Kb ... 84
4.
Chapitre 3 – Effet des saponines sur les globules rouges
... 91
4.1. Saponines Quillaja Saponaria Molina
... 91
4.2. Observations microscopiques et résultats spectrophotométriques
... 94
4.2.1. Implication des lipides membranaires ... 94
4.2.1.1. Déplétion en cholestérol ... 94
4.2.1.2. Marquage des lipides par PKH26 ... 96
4.2.2. Implication des protéines transmembranaires ... 98
4.2.2.1. Inhibition de l’aquaporine ... 99
4.2.2.2. Inhibition de la bande 3 ... 101
4.2.3. Modification des propriétés mécaniques des GR ... 104
4.2.3.1. Par déplétion en ATP ... 104
4.2.3.2. Par des traitements à l’urée ... 108
4.2.3.3. Par la phosphorylation de la protéine 4.1R ... 110
4.3. Conclusion
... 112
4.4. Références
... 113
5. Chapitre 4 – Etudes des relations structure-activité lytique... 119
5.1. Molécules testées
... 119
5.1.1. Tensioactifs polyoxyéthylènés ... 119
5.1.2. Tensioactifs à base d’acides aminés ... 123
5.2. Activité hémolytique
... 126
5.2.1. Tensioactifs polyoxyéthylènés ... 126
5.2.1.1. Influence de la chaine hydrophobe et de la balance hydrophile-lipophile .... 126
5.2.1.2. Importance de la forme conique et paramètre d’empilement ... 132
5.2.1.3. Micellisation et hémolyse ... 134
5.2.1.4. Coefficient de partage Kb ... 144
5.2.1.5. Relation Kb.CMC ... 147
5.2.1.6. Synthèse ... 149
5.2.2. Les tensioactifs à base d’acides aminés ... 149
5.2.2.1. Influence de la chaine hydrophobe et de la balance hydrophile-lipophile .... 150
5.2.2.4. Coefficient de partage Kb ... 159
5.2.2.5. Relation Kb.CMC ... 160
5.2.2.6. Synthèse ... 161
5.3. Effets des tensioactifs sur les globules blancs
... 162
5.3.1. Lyse des GB versus hémolyse ... 163
5.3.1.1. Saponine Quillaja ... 163
5.3.1.2. Brij® ... 164
5.3.1.3. Tensioactifs à bases d’acides aminés ... 165
5.3.1.4. Synthèse ... 167
5.3.2. Cinétique d’hémolyse sur l’automate ABX Pentra 400 ... 168
5.3.3. Matrices différentielles obtenues par cytométrie en flux ... 171
5.4. Conclusion
... 175
5.5. Références... 176
6. Conclusion générale... 181
7. Annexes... 185
7.1. Tests hémolytiques ... 192 7.1.1. Tensioactifs polyoxyéthylènés ... 1927.1.2. Tensioactifs à base d’acides aminés ... 195
7.2. Tests lytiques sur les GB ... 198
7.2.1. Tensioactifs polyoxyéthylènés ... 198
7.2.2. Les tensioactifs à base d’acides aminés ... 201
7.3. Détermination des CMC ... 204
7.3.1. Par tension de surface ... 204
7.3.1.1. Tensioactifs polyoxyéthylènés ... 204
7.3.1.2. Tensioactifs à base d’acides aminés ... 208
7.3.2. Par solubilisation de l’éosine Y ... 213
7.3.2.1. Tensioactifs polyoxyéthylènés ... 213
7.4. Détermination des coefficients de partage Kb ... 221
7.4.1. Tensioactifs polyoxyéthylènés ... 221
7.2.2. Les tensioactifs à base d’acides aminés ... 237
Tables des figures
Chapitre 1
Figure 1 : Erythrocyte membrane composition [143] ... 7
Figure 2 : Representation of two conformations of the band 3 protein [17]. The outward-facing conformation allowing anions influx and the inward-facing conformation leading to anions efflux thanks to cytoskeleton spectrin molecules folding or unfolding. ... 9
Figure 3 : Erythrocyte shape: echinocytes and stomatocyte [144] ... 10
Figure 4 : Asymmetrical distribution of lipid in erythrocyte membrane [10] ... 11
Figure 5 : Solubilization mechanisms possible [54] ... 14
Figure 6 : Pore formation by saponin-cholesterol complex reorganization [2] ... 15
Figure 7 : The effect of the packing parameter on the structures of assemblies formed [145] ... 21
Chapitre 1 Additional informations
Figure 1 : At the top: Electron microscopy image of these two linkages in spectrin meshwork [7]. At the bottom: Ankyrin and 4.1R complexes schematic representation of red cell membrane [8]. ... 46Figure 2 : Schematic representation of regular triangular network of the erythrocyte cytoskeleton [9]. ... 46
Figure 3 : Schematic drawing of the spectrin-membrane connection. In normal cells, a de- and phosphorylation of 4.1R protein results in membrane stability. ATP-depletion increase the spectrin-membrane interaction resulting in an increase spectrin-membrane tension and PKC activation disrupts the spectrin-membrane interaction leading to decrease of membrane tension [13]. ... 47
Figure 4 : Schematic representation on ATP regulation by ABC proteins and ecto-5'-nucleotidases, inspired by [16] ... 48
Figure 5 : General structure of triterpenoid saponins. ... 49
Chapitre 2
Figure 3-1 : Chromatogramme du mélange Ultra Dry 100Q (lot 111111), extrait du certificat d’analyse fourni par Desert King... 53Figure 3-2 : Représentation explicative de la mise au point de deux tests lytiques ... 56
Figure 3-3 : Courbe d'hémolyse théorique en fonction de la concentration en tensioactifs. Csat= Concentration de saturation, Csol=Concentration de solubilisation et HE50=Concentration pour laquelle 50% des GR sont lysés. ... 57
Figure 3-4 : Tableau récapitulatif des HE50 obtenues avec la saponine Ultra Dry sur sang humain ... 59
Figure 3-5 : Variation de l’hématocrite d’un sang humain en fonction de la concentration en saponine ... 59
Figure 3-6 : Tableau récapitulatif des HE50 obtenues avec la saponine Ultra Dry sur sang humain en sérum AB (Ht=40%) ... 60
Figure 3-8 : Spectres de l'hémoglobine de mouton. Une concentration fixe en hémoglobine est diluée dans différentes concentrations en saponine (0, 10, 20, 40, 50, 100, 150µM) : Analyse différée dans le temps des surnageants après centrifugation de l’ensemble des cuves, (A), cuves immédiatement analysées après centrifugation (B) et avec ajout de 10mM de SDS (C) ... 62 Figure 3-9 : Spectre de l'hémoglobine de mouton à 93.8µM en CTAC à 1minute (en bleu), 1H30 (en rouge) et 3H (vert). A) sans SDS B) avec SDS ... 63 Figure 3-10 : Matrice caractérisant trois populations de leucocytes sous l'action de 75µM de saponine dans du PBS avec le cytomètre LSR de Becton Dickinson (BD) ... 67 Figure 3-11 : Principe de l'hydrofocalisation ... 68 Figure 3-12 : Schéma simplifié du système optique en cytométrie en flux. Extrait de [17] ... 69 Figure 3-13: Création d'un pulse électronique lors du passage de la cellule dans le faisceau lumineux ... 69 Figure 3-14 : Liaison spécifique du fluorochrome FITC, conjugué à l'anticorps, à l'antigène situé à la surface cellulaire ... 70 Figure 3-15 : Suivi de la lyse des GB en fonction de la concentration en saponine ; en bleu : les GB fluorescents, en vert : les débris de GB fluorescents et en noir : les GR ou les débris. ... 71 Figure 3-16 : Courbes de lyse théorique obtenues en fonction des fenêtrages R1 et R2 ... 72 Figure 3-17 : Cinétique de lyse théorique obtenue sur P400... 73 Figure 3-18 : Hémolyse d'un pool de sangs en sérum AB sur un temps de 216 secondes à 37°C par la méthode spectrophotométrique et P400... 73 Figure 3-19 : Schéma récapitulatif de la déplétion en ATP sur deux pools de sangs, l'un en PBS et l'autre en sérum AB ... 75 Figure 3-20 : Mécanisme d’association de la membrane avec la spectrine par déplétion en ATP ... 75 Figure 3-21 : Mécanisme de dissociation de la membrane avec la spectrine par activation de la PKC .... 77 Figure 3-22 : Exemple d'insertion d'un colorant de la famille des PKH dans la membrane ... 80 Figure 3-23 : Représentation schématique de la méthode utilisant la plaque de Wilhelmy. « L » équivaut au périmètre de la plaque immergée [44]. ... 82 Figure 3-24 : Détermination de la CMC par tension de surface. Représentation de la tension de surface Ɣ en fonction du log de la concentration en tensioactifs pour un système air/eau [45] ... 82 Figure 3-25 : Détermination de la CMC du Tween 20 utilisant la méthode de l'Eosine Y, exemple de la littérature. La droite en pointillé représente l'absorbance du colorant dans l'eau en l'absence de tensioactif [42] ... 83 Figure 3-26 : Représentation théorique du Ratio molaire efficace représentant la concentration en tensioactifs totale (Dt) en fonction de la quantité de lipides ... 85
Chapitre 3
Figure 4-21 : Cinétique d'hémolyse par 5µM de saponine sur deux pools de sangs vieillis pendant trois jours l'un dans du PBS (A) et l'autre dans le sérum AB (B). (Htfinale=1%) ... 106 Figure 4-22 : Cinétique d'hémolyse à 5µM de saponine d'un pool de sangs dans un milieu PBS et en milieu « ATP déplétant ». L’expérience a été réalisée une fois. (Htfinale=1%) ... 107 Figure 4-23 : Variation moyenne du rayon d’un GR en milieu PBS et en milieu ATP déplétant sous l'action de 7µM de saponine (Ht=0.08%) ... 108 Figure 4-24 : Cinétique d’hémolyse par 5µM de saponine à 540nm avec des incubations au préalable des érythrocytes dans différentes concentrations en urée. (Htfinale = 1%) ... 109 Figure 4-25 : Observations microscopiques de GR en milieu PBS sans urée (A) et en PBS à 1.7M en urée (B) Htfinale = 0.08% ... 109 Figure 4-26 : Observations microscopiques de GR incubé dans 2,5M d’urée (Htfinale = 0.16%) (A) suivie d’une lyse d’un GR (B) par 7µM de saponine au cours du temps (Htfinale = 0.08%)... 110 Figure 4-27: Schéma représentant, à gauche, des phosphorylations/déphosphorylations de la protéine 4.1R conduisant au maintien de l’élasticité du cytosquelette et à droite l’état du cytosquelette lorsque la protéine 4.1R est phosphorylée [36]. ... 111 Figure 4-28 : Cinétique d'hémolyse à 5µM de saponine d'un pool de sangs dans un milieu PBS et en milieu favorisant l’activité de la PKC. (Htfinale=1%) ... 111 Figure 4-29 : Variation moyenne du rayon d’un GR en milieu PBS et en milieu favorisant l’activité de la PKC sous l'action de 7µM de saponine (Ht=0.08%) ... 112
Chapitre 4
Tables des tableaux
Chapitre 2
Tableau 3-1 : Informations relatives aux tensioactifs polyoxyéthylènés ... 54
Tableau 3-2 : Informations relatives aux dérivés acides aminés ... 55
Tableau 3-3 : Informations relatives au N-lauroylsarcosinate de sodium ... 56
Tableau 3-4 : Solution de cinétique de lyse contenant de l’urée en milieu PBS ... 76
Tableau 3-5 : Solution de cinétique de lyse contenant du HgCl2 en milieu PBS ... 78
Tableau 3-6 : Solution de cinétique de lyse contenant du HgCl2 et 5µM de BME en milieu PBS ... 78
Tableau 3-7: Solution de cinétique de lyse contenant du DIDS en milieu PBS ... 78
Tableau 3-8 : Hématocrite étudié et concentration lipidique, d’après [54] ... 84
Chapitre 3
Tableau 4-1 : Structure des saponines majoritaires ... 92Tableau 4-2 : Valeurs des t50 obtenues pour les différentes incubations dans du DIDS ... 101
Chapitre 4
Tableau 5-1 : Structure des tensioactifs polyoxyéthylènés étudiés ... 120Tableau 5-2 : Structure des tensioactifs à base d’acide aminé avec R= C8 à C16 ... 124
Tableau 5-3 : Groupes de contribution hydrophobe et hydrophile pour calculer les valeurs d’HLB ... 127
Tableau 5-4 : Tableau récapitulatif des valeurs de CMC obtenues par l'éosine Y et par tension de surface ainsi que le ratio Dye/ST ... 143
Tableau 5-5 : Récapitulatif des valeurs de Kb obtenues pour les tensioactifs polyoxyéthylènés ainsi que les Re et Dw. Avec Resat et Resol représentant respectivement les ratios molaires tensioactifs/lipides au début de la lyse et à la lyse totale. Dwsat et Dwsol représentent respectivement les concentrations en tensioactifs libres en solution au début de la lyse et à la lyse totale. Certaines valeurs sont grisées représentant des résultats pouvant être faussés, dus au chevauchement des courbes hémolytiques (c.f annexes page 221) ... 145
Tableau 5-6: Tableau récapitulatif des tests hémolytiques et des paramètres physico-chimiques. Lignes surlignées en rouge = tensioactif peu lytique et lignes surlignées en vert = tensioactif lytique. ... 149
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