Détermination de la CMC par l’utilisation d’un colorant

Des colorants tels que l’éosine Y, le merocyanine ou le sudan voient leurs caractéristiques spectrales changer en UV-Visible en présence de micelles de tensioactifs. Ces colorants sont utilisés pour déterminer des CMC grâce à leurs interactions avec les tensioactifs [46–50]. Dans la littérature [42], l’apparition de micelles, au-dessus de la CMC, induit un effet bathochrome due à la solubilisation du colorant dans le cœur de la micelle [42]. L’éosine Y (EY) soluble dans l’eau a été utilisée pour déterminer nos CMC. L’EY appartient à la famille des xanthènes. D’après Patist et al. [42] l’Eosine Y, soluble dans l’eau, montre une longueur d’onde d’absorbance maximum à 518nm. L’augmentation de la concentration en tensioactif induit à un effet hyperchrome et bathochrome de 518 à 538nm (Figure 3-25). Une meilleure dispersion des spectres de l’EY est observée à 542nm. La CMC est déterminée en représentant graphiquement l’absorbance du colorant à 542nm en fonction de la concentration en tensioactif. Le point d’inflection en absorbance correspond à la CMC.

Figure 3-25 : Détermination de la CMC du Tween 20 utilisant la méthode de l'Eosine Y, exemple de la littérature. La droite en pointillé représente l'absorbance du colorant dans l'eau en l'absence de

84

Cependant, le spectre de l’EY varie en fonction des conditions expérimentales (température, pH, force ionique, solvant, etc) et en fonction de la structure et de la concentration en tensioactif [46,47]. Dans notre cas, en milieu PBS l’éosine Y présente un maximum d’absorption à 516nm avec un épaulement à 495nm traduisant respectivement, la présence de monomères et la dimérisation du colorant [46]. Chakraborty et al. [46] ont montré que l’augmentation de la concentration en colorant favorise sa dimérisation, c’est pourquoi nous avons travaillé avec une concentration faible en colorant soit 19µM. Le spectre de l’EY montre un effet hyperchrome à 528nm avec l’augmentation de la concentration en tensioactifs polyoxyéthylènés (molécules étudiées dans le chapitre 4). Les CMC ont été déterminées en représentant graphiquement l’absorbance de l’EY à 535nm en fonction de la concentration en tensioactifs polyoxyéthylènés. La CMC correspond à l’intersection de la droite représentant l’absorbance du colorant dans le PBS en absence de tensioactifs (droite rouge en pointillé) et la droite de régression (cf annexes page 213).

Des gammes de concentration ont été préparées avec les différents tensioactifs à étudier en milieu PBS avec une concentration finale en colorant de 0.019mM. Les solutions ont été analysées au spectrophotomètre Perkin elmer lambda 35 UV/Vis dans une cuve en PMMA de 0.4cm.

3.3.3. Evaluation du coefficient de partage K

Le paramètre Kb permet de définir la partition du tensioactif dans la membrane érythrocytaire par rapport au solvant. Ce paramètre peut se mesurer par calorimétrie [51,52] mais également par la méthode de Lichtenberg [2]. Cette méthode consiste à étudier la solubilisation de différentes concentrations en lipides membranaires érythrocytaires par des tensioactifs. Cela implique l’étude des différentes courbes hémolytiques avec la détermination de différentes concentrations ; Csat et Csol qui sont les concentrations requises respectivement pour induire la saturation (début de la lyse) et la solubilisation membranaire (100% de lyse) [2,53–56].

Un pool de sangs a été réalisé en milieu PBS. Les différentes suspensions d’érythrocytes (0.075-0.2% d’hématocrite final) ont été ajoutées à la gamme de tensioactifs à étudier.

Nous avons ensuite réalisé le test hémolytique élaboré précédemment (3.2.2.3 Protocole hémolytique). Les échantillons ont été incubés et agités pendant 15 minutes à 37°C dans un thermomixer® [55].

D’après les courbes hémolytiques obtenues, les C_sat et Csol ont été définies (3.2.2.4 Traitement des données). Csat et Csol ont été tracées en fonction de la concentration lipidique membranaire permettant la détermination du Re, le ratio molaire effectif tensioactifs/lipides pour l’hémolyse initiale (Re^sat) et totale (Re^sol) (Tableau 3-8).

Ht final (%) 0,075 0,1 0,15 0,2 Lipides (µM) 6.5 8.7 13 17

Tableau 3-8 : Hématocrite étudié et concentration lipidique, d’après [54] La concentration totale en tensioactif est définie par l’Équation 3-17:

ܦ

ൌ  ܦ

൅ܦ

Avec Dt la concentration totale en tensioactif, Db la concentration en tensioactif contenu dans la bicouche, Dw la concentration en tensioactif contenu dans le milieu aqueux, Re le ratio molaire tensioactifs/lipides (

ܴ

ൌ 

௅) et L la concentration en lipides.

Par lyse osmotique le tensioactif s’équilibre entre la bicouche lipidique et le milieu aqueux. L’équation de droite obtenue pour de cas, suit l’Équation 3-18 :

ࡰ

ൌ ࡾ

Ǥ ࡸ ൅ ࡰ

où Dt est la concentration totale en tensioactifs (Csat, Csol), L est la concentration lipidique membranaire et Re le ratio molaire tensioactifs/lipides

ܴ

ൌ 

௅ [55]. Quand la bicouche est solubilisée en micelle mixte, la concentration en tensioactif en milieu aqueux est environ égale à la CMC. C’est pourquoi, à des concentrations en tensioactif supérieures à la CMC, l’équation de droite utilisée est la suivante (Équation 3-19) :

ࡰ

ൌ ࡯ࡹ࡯ ൅ࡾ

Ǥ ࡸ

Équation 3-19

Les valeurs de Re ont été calculées à partir de la pente de la droite tandis que l’ordonnée à l’origine correspond au Dw, la concentration en tensioactifs libre en solution [2]. La Figure 3-26 représente une droite théorique illustrant les concentrations en tensioactifs en fonction de la concentration en lipides pour déterminer le ratio molaire efficace.

Figure 3-26 : Représentation théorique du Ratio molaire efficace représentant la concentration en

tensioactifs totale (Dt) en fonction de la quantité de lipides

Dans cet exemple, Re est de 1.4 et Dw de 2.0 µM. Le Kb (M^-1), le coefficient de partage du tensioactif pour la membrane érythrocytaire, est obtenue à partir du Re^sat et du Dw^sat, selon l’Équation 3-20 :

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ࡷ

ൌ_ࡰ ^ࡰ

ሺࡸ ൅ ࡰ

ሻ ൌ

ࡾ

ࡰ

ሺ૚ ൅ ࡾ

ሻ

Avec Dw la concentration en tensioactif contenu dans le milieu aqueux, Db la concentration en tensioactif contenu dans la bicouche et Re le ratio molaire tensioactif/lipides.

3.4. Références

[1] Delay C. Isolement, caractérisation et identification de saponines hemolytiques de gypsophila paniculata. 1998.

[2] Lichtenberg D. Characterization of the solubilization of lipid bilayers by surfactants. Biochim Biophys Acta 1985;821:470–8.

[3] Troussard X, Vol S, Cornet E, Bardet V, Couaillac J-P, Fossat C, et al. Full blood count normal reference values for adults in France. J Clin Pathol 2014;67:341–4.

[4] Shalel S, Streichman S, Marmur A. The mechanism of hemolysis by surfactants: effect of solution composition. J Colloid Interface Sci 2002;252:66–76.

[5] Zou CG, Agar NS, Jones GL. Haemolysis of human and sheep red blood cells in glycerol media: The effect of pH and the role of band 3. Comp Biochem Physiol - A Mol Integr Physiol 2000;127:347–53.

[6] Matsuzawa T, Ikarashi Y. Haemolysis of various mammalian erythrocytes in sodium chloride, glucose and phosphate-buffer solutions. Lab Anim 1979;13:329–31.

[7] Mock DM, Matthews NI, Strauss RG, Burmeister LF, Schmidt R, Widness J a. Red blood cell volume can be independently determined in vitro using sheep and human red blood cells labeled at different densities of biotin. Transfusion 2009;49:1178–85.

[8] Nelson GJ. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids 1967;2:64–71.

[9] Mohandas N, Gallagher PG. Red cell membrane: past, present, and future. Blood 2008;112:3939–48.

[10] Putnam JC, Carlson SE, DeVoe PW, Barness LA. The effect of variations in dietary fatty acids on the fatty acid composition of erythrocyte phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in human infants. Am J Clin Nutr 1982;36:106–14.

[11] De la Maza A, Parra J. Solubilizing effects caused by alkyl pyridinium surfactants in phosphatidylcholine liposomes. Chem Phys Lipids 1995;77:79–87.

[12] Fonseca LC, Arvelos LR, Netto RCM, Lins AB, Garrote-Filho MS, Penha-Silva N. Influence of the albumin concentration and temperature on the lysis of human erythrocytes by sodium dodecyl sulfate. J Bioenerg Biomembr 2010;42:413–8.

[13] Reza DM, Ali Akbar M-M, Parviz N, Ghourchian G, Hedayat-Olah H-O, Shahrokh S. Inhibition of Human Hemoglobin Autoxidaiton by Sodium n-Dodecyl Sulphate. J Biochem Mol Biol 2002;35:364–70.

[14] Salehi N, Moosavi-Movahedi a. a., Fotouhi L, Yousefinejad S, Shourian M, Hosseinzadeh R, et al. Heme degradation upon production of endogenous hydrogen peroxide via interaction of hemoglobin with sodium dodecyl sulfate. J Photochem Photobiol B Biol 2014;133:11–7.

[15] Harold J, Drabkin L. Spectrophotometry studies: II.Preparations from wahed blood cells; nitic oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. J Biol Chem 1935;11:51–65.

[16] Brown M, Wittwer C. Flow cytometry: Principles and clinical applications in hematology. Clin Chem 2000;46:1221–9.

[17] Rongeat N. Utilisation de sources polychromes pour le diagnostic sytologique. Application à l’hématologie. 2011.

[18] Tuvia S, Almagor a, Bitler a, Levin S, Korenstein R, Yedgar S. Cell membrane fluctuations are regulated by medium macroviscosity: evidence for a metabolic driving force. Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:5045–9.

[19] Betz T, Lenz M, Joanny J-F, Sykes C. ATP-dependent mechanics of red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106:15320–5.

[20] Schmidt MM, Dringen R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Front Neuroenergetics 2009;1:1.

[21] Khairy K, Foo J, Howard J. Shapes of Red Blood Cells: Comparison of 3D Confocal Images with the Bilayer-Couple Model. Cell Mol Bioeng 2008;1:173–81.

[22] Khodadad JK, Waugh RE, Podolski JL, Josephs R, Steck TL. Remodeling the shape of the skeleton in the intact red cell. Biophys J 1996;70:1036–44.

[23] Manno S, Takakuwa Y, Mohandas N. Modulation of erythrocyte membrane mechanical function by protein 4.1 phosphorylation. J Biol Chem 2005;280:7581–7.

[24] Al Z, Cohen CM. Phorbol 12-myristate 13-acetate-stimulated phosphorylation of erythrocyte membrane skeletal proteins is blocked by calpain inhibitors: possible role of protein kinase M. Biochem J 1993;296:675–83.

[25] Preston GM, Jung JS, Guggino WB, Agre P. The mercury-sensitive residue at cysteine 189 in the CHIP28 water channel. J Biol Chem 1993;268:17–20.

[26] Jain N, Ascough GD, Van Staden J. A smoke-derived butenolide alleviates HgCl2 and ZnCl2 inhibition of water uptake during germination and subsequent growth of tomato - Possible involvement of aquaporins. J Plant Physiol 2008;165:1422–7.

[27] Hirano Y, Okimoto N, Kadohira I, Suematsu M, Yasuoka K, Yasui M. Molecular mechanisms of how mercury inhibits water permeation through aquaporin-1: Understanding by molecular dynamics simulation. Biophys J 2010;98:1512–9.

[28] Savage DF, Stroud RM. Structural Basis of Aquaporin Inhibition by Mercury. J Mol Biol 2007;368:607–17.

[29] Bernhardt I, Clive Ellory J. Red cell membrane transport in health and disease. 2003.

[30] Martins AP, Marrone A, Ciancetta A, Cobo AG, Echevarría M, Moura TF, et al. Targeting aquaporin function: Potent inhibition of aquaglyceroporin-3 by a gold-based compound. PLoS One 2012;7.

88

[31] Zhang W-H, Tyerman SD. Inhibition of Water Channels by HgCl2 in Intact Wheat Root Cells. Plant Physiol 1999;120:849–58.

[32] Yukutake Y, Tsuji S, Hirano Y, Adachi T, Takahashi T, Fujihara K, et al. Mercury chloride decreases the water permeability of aquaporin-4-reconstituted proteoliposomes. Biol Cell 2008;100:355–63.

[33] Sauer A, Kurzion T, Meyerstein D, Meyerstein N. Kinetics of hemolysis of normal and abnormal red blood cells in glycerol-containing media. Biochim Biophys Acta - Biomembr 1991;1063:203–8.

[34] Salhany JM, Schopfer LM. Kinetic mechanism of DIDS binding to band 3 (AE1) in human erythrocyte membranes. Blood Cells, Mol Dis 2001;27:844–9.

[35] Sato Y, Yamakose H, Suzuji Y. Participation of Band 3 protein in hypotonic hemolysis of human erythrocytes. Pharm Soc Japan 1993;16:188–94.

[36] Beseničar MP, Bavdek A, Kladnik A, Maček P, Anderluh G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin-A surface plasmon resonance approach. Biochim Biophys Acta - Biomembr 2008;1778:175–84.

[37] Arikan S. A Comparison of the Effect of Methyl- β -Cyclodextrin on the Osmotic Fragility of Ovine , Bovine and Human Erythrocytes. Turk J Vet Anim Sci 2003;27:383–7.

[38] Yi J, Choo H, Cho B, Kim H, Kim Y, Ham Y, et al. Ginsenoside Rh2 induces ligand-independent Fas activation via lipid raft disruption. Biochem Biophys Res Commun 2009;385:154–9.

[39] Steck TL, Ye J, Lange Y. Probing red cell membrane cholesterol movement with cyclodextrin. Biophys J 2002;83:2118–25.

[40] Elbert DL, Hubbell J a. Self-assembly and steric stabilization at heterogeneous, biological surfaces using adsorbing block copolymers. Chem Biol 1998;5:177–83.

[41] Wallace PK, Tario JD, Fisher JL, Wallace SS, Ernstoff MS, Muirhead K a. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: Monitoring proliferation by dye dilution. Cytom Part A 2008;73A:1019–34.

[42] Patist A, Bhagwat SS, Penfield KW, Aikens P, Shah DO. On the measurement of Critical Micelle Concentrations of pure and technical grade nonionic surfactants. J Surfactants Deterg 2000;3:53–8.

[43] Evans DF, Allen M, Ninham BW, Fouda A. Critical Micelle Concentrations for Alkyltrimethylammonium Bromides in Water from 25 to 160°C. J Solution Chem 1984;13:87– 101.

[44] Wilhelmy plate method by KRUSS n.d.

[45] Puech P-H, Borghi N, Karatekin E, Brochard-Wyart F. Line thermodynamics: adsorption at a membrane edge. Phys Rev Lett 2003;90:128304.

[46] Chakraborty M, Panda AK. Spectral behaviour of eosin y in different solvents and aqueous surfactant media. Spectrochim Acta - Part A Mol Biomol Spectrosc 2011;81:458–65.

[47] Acharya S, Rebery B. Fluorescence spectrometric study of eosin yellow dye-surfactant interactions. Arab J Chem 2009;2:7–12.

[48] Khan MN, Sarwar A. Study of dye-surfactant interaction: Aggregation and dissolution of yellowish in N-dodecyl pyridinum chloride. Fluid Phase Equilib 2006;239:166–71.

[49] Bielska M, Sobczyńska A, Prochaska K. Dye-surfactant interaction in aqueous solutions. Dye Pigment 2009;80:201–5.

[50] Garcia DME, Sanz-Medel A. Dye-surfactant interactions: A review. Talanta 1986;33:255–64. [51] Heerklotz H, Seelig J. Detergent-Like Action of the Antibiotic Peptide Surfactin on Lipid

Membranes. Biophys J 2001;81:1547–54.

[52] Heerklotz H, Seelig J. Correlation of Membrane/Water Partition Coefficients of Detergents with the Critical Micelle Concentration. Biophys J 2000;78:2435–40.

[53] Domingues CC, Malheiros SVP, de Paula E. Solubilization of human erythrocyte membranes by ASB detergents. Brazilian J Med Biol Res 2008;41:758–64.

[54] Preté PSC, Malheiros SVP, Meirelles NC, de Paula E. Quantitative assessment of human erythrocyte membrane solubilization by Triton X-100. Biophys Chem 2002;97:1–5.

[55] Preté PSC, Gomes K, Malheiros SVP, Meirelles NC, de Paula E. Solubilization of human erythrocyte membranes by non-ionic surfactants of the polyoxyethylene alkyl ethers series. Biophys Chem 2002;97:45–54.

[56] Malheiros S V, Meirelles NC, de Paula E. Pathways involved in trifluoperazine-, dibucaine- and praziquantel-induced hemolysis. Biophys Chem 2000;83:89–100.