Principe du test hémolytique

Le principe de cette méthode repose sur la mesure de l’absorbance à 540nm de l’hémoglobine, contenue dans les surnageants, obtenus après centrifugation du milieu dans lequel les globules rouges ont été incubés. Ce milieu contient différentes concentrations en tensioactifs. Ainsi le tracé des valeurs d’absorbances acquises en fonction de la concentration en tensioactifs fournit des courbes d’hémolyse. La Figure 3-3 illustre une courbe sigmoïdale d’hémolyse théorique en fonction de la concentration en tensioactifs.

Figure 3-3 : Courbe d'hémolyse théorique en fonction de la concentration en tensioactifs. Csat=

Concentration de saturation, Csol=Concentration de solubilisation et HE50=Concentration pour laquelle

50% des GR sont lysés.

Si on compare cette courbe d’hémolyse au mode d’action théorique, le premier plateau représente l’incorporation du tensioactif dans la membrane jusqu’à la saturation de celle-ci [2]. La pente correspond à la lyse caractérisée par la fuite d’hémoglobine et est suivie d’un second plateau caractéristique de la solubilisation ou de la perméabilisation membranaire, correspondant à la libération totale d’hémoglobine. La concentration de saturation (C_sat) est la concentration pour laquelle la membrane est saturée par les monomères de tensioactifs, avant la lyse. La concentration de solubilisation (Csol) correspond à la concentration à laquelle la membrane devient perméable et au moment où l’hémoglobine totale est libérée. L’effet hémolytique 50% (HE50) est la concentration pour laquelle 50% des cellules sont lysées. La méthode développée en interne a été utilisée pour mesurer

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repose sur une incubation de 10 secondes à température ambiante pour une dilution telle que l’hématocrite final soit de 1%, afin de mimer au mieux le cycle d’un automate d’hématologie, et le ralentissement de la lyse par une trempe des tubes à hémolyse dans un bain de glace à 4°C. L’hématocrite d’un sang représente le volume d’érythrocytes sur le volume total d’un échantillon (généralement, l’hématocrite moyenne pour l’Homme se situe entre 40 et 52% [3]). Après centrifugation, le surnageant est prélevé et l’absorbance est mesurée à 540nm afin de déterminer le pourcentage d’hémolyse. Le pourcentage d’hémolyse a été obtenu d’après l’Équation 3-1 :

ࡴé࢓࢕࢒࢙࢟ࢋሺΨሻ ൌ_࡭ࢁ^࡭ࢁ

ࢋࢇ࢛

ൈ ૚૙૙

Équation 3-1

Avec AU[X] l’absorbance du surnageant mesurée aux différentes concentrations en tensioactifs et AUeau l’absorbance du surnageant représentant la lyse totale dans l’eau [1]. La fidélité du protocole tiré de la thèse de Corinne Delay [1] a été vérifiée dans un premier temps avec notre tensioactif de référence, la saponine Ultra Dry. Un manque de répétabilité et de fidélité intermédiaire a été observé. Ceci peut s’expliquer de différentes manières. Tout d’abord par des erreurs de manipulation, mais également par l’utilisation d’hématies de mouton pour lesquelles des variations biologiques existent selon les lots. Ajoutons à cela, l’effet du tensioactif sur le spectre de l’hémoglobine décrit par Shalel [4], un temps d’incubation trop court difficile à maitriser, la variation de la température d’incubation et les temps annexes à l’incubation (centrifugation, temps de lecture sur le spectrophotomètre, un temps de lecture entre le premier et dernier tube différent) trop longs par rapport à l’incubation elle-même. En effet, au-cours de ces laps de temps, l’action du tensio-actif bien que ralentie par la trempe à 4°C, se poursuit. Un nouveau protocole a donc été mise au point.

3.2.2. Mise au point d’un nouveau protocole hémolytique

3.2.2.1. Choix du matériel biologique

Le suivi en parallèle de la lyse des globules blancs et celle des globules rouges rend impossible la poursuite de l’étude sur des hématies de mouton. L’utilisation des hématies de mouton permet d’obtenir un classement rapide du pouvoir érythrolytique des tensioactifs. Cependant les érythrocytes de mouton et humain ne réagissent pas de la même façon face à la lyse [5]. Les érythrocytes de moutons sembleraient plus fragiles à la lyse osmotique que les érythrocytes humains [6]. Il existe également des différences morphologiques avec un volume globulaire moyen de 30µm³ pour le GR de mouton comparé à 90µm³ pour le GR humain [7]. Des différences apparaissent également dans la composition membranaire soit par exemple la présence de 32,7% de phosphatidyl éthanolamine contre 27% et 52,3% de sphingomyéline contre 26%, chez le GR de mouton et humain respectivement [8,9]. Il est donc préférable pour notre étude de faire nos tests sur des sangs humains. La Figure 3-4 représente les valeurs d’HE50 obtenues avec trois sangs humains différents possédant des hématocrites de 47.3, 44.9 et 46.9% en présence de saponines.

Sang 1 Ht=47.3% HE50 (µM) Sang 2 Ht=44.9% HE50 (µM) Sang 3 Ht=46.9% HE50 (µM) Saponine 15,8 15,1 13,3

Figure 3-4 : Tableau récapitulatif des HE50 obtenues avec la saponine Ultra Dry sur sang humain

Une importante variabilité des valeurs est observée. Cela peut s’expliquer par une variabilité biologique, en effet en fonction du sang utilisé la concentration de tensioactifs pour lyser 50% des GR varie [10,11]. Des expériences ont été réalisées en faisant varier l’hématocrite d’un sang humain (Figure 3-5).

Figure 3-5 : Variation de l’hématocrite d’un sang humain en fonction de la concentration en saponine Lorsque l’hématocrite diminue, c’est-à-dire lorsque le nombre de GR diminue, les HE50 obtenues augmentent. En effet, pour chaque dilution de notre échantillon de sang par du plasma, la quantité de plasma augmente. Il existe donc des lipoprotéines, des protéines plasmatiques telles que l’albumine [12], dont le rôle principal est de fixer les acides gras permettant leur transport, qui interagissent avec notre tensioactif et par conséquent, plus de tensioactif est nécessaire pour lyser les GR. Il a donc été décidé de travailler à hématocrite fixe, soit 40%. Cette valeur a été choisie de façon arbitraire, caractérisant un hématocrite moyen. De plus, pour gommer les variations biologiques, un pool de 10 sangs a été effectué. Pour cela chaque sang a été lavé au PBS comme décrit ci-dessous. L’étape de lavage permet d’éliminer le plasma, les anticorps, les nutriments, etc. Puis ils sont repris dans un volume de sérum AB de manière à obtenir un hématocrite de 40%. Ce sérum AB, ne contenant ni anticorps anti-A ni anticorps anti-B, permet de minimiser les activités immunologiques. La Figure 3-6 représente les valeurs d’HE₅₀ obtenues avec quatre pools de sangs différents en sérum AB.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 5 10 15 20 25 A⁵⁴ 0n m N o rmal isée Concentration en saponine (µM) Ht = 46,6% Ht = 42,7% Ht = 37,4% Ht = 33,6%

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Figure 3-6 : Tableau récapitulatif des HE50 obtenues avec la saponine Ultra Dry sur sang humain en sérum

AB (Ht=40%)

En utilisant un pool de 10 sangs et en fixant l’hématocrite à 40%, moins de variations sont observées. La suite de notre étude a donc été réalisée avec ce matériel biologique. Les tubes de sangs que nous recevons viennent des différents laboratoires partenaires d’HORIBA Medical.

Les dix sangs ont été centrifugés à 700g pendant 5 minutes. Nous avons procédé par la suite à l’étape de lavage : le surnageant de chacun des 10 tubes de sang a été prélevé et jeté puis remplacé par un volume semblable de PBS. Pour finir, les échantillons ont été homogénéisés puis centrifugés à 700g pendant 5 minutes. Le PBS a été obtenu à partir de tablettes achetées chez Sigma-Aldrich, une tablette a été diluée dans 200ml d’eau osmosée, représentant 0.01M de tampon phosphate, 0.0027M de chlorure de potassium et 0.137M de chlorure de sodium soit pH 7.4 à 25°C. Un second lavage a été réalisé dans les mêmes conditions. Le troisième lavage a été effectué au sérum AB. Suite à ce dernier lavage, les surnageants ont été prélevés, éliminés et remplacés par un volume équivalent de sérum AB. Après mélange des différents tubes, l’hématocrite du pool obtenu a été vérifié grâce à un automate d’hématologie, de type ABX Pentra 60 d’HORIBA Medical. L’hématocrite doit être de 40%. Au besoin l’hématocrite a été réajusté par dilution ou concentration. Nous avons également travaillé sur des pools de sangs en milieu PBS. Pour cela, la dernière étape de lavage ne s’est pas effectuée en sérum AB mais en milieu PBS. Après centrifugation, les sangs ont été déplétés de leur surnageant puis dilués dans du PBS. Les sangs ont ensuite été mélangés pour obtenir un pool de sangs en milieu PBS ayant un hématocrite de 40%.