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L’automate a prélevé 7µl de sangs qu’il a incorporé à 280µl de solution de tensioactifs (Htfinal=1%). Le milieu réactionnel thermostaté à 37°C a ensuite été mélangé par un système de bullage. Toutes les 12 secondes l’absorbance a été enregistrée et ceci sur une période de 216 secondes. Les données ont été traitées sous Excel et Minitab®.
3.2.5. Modification des propriétés de perméabilité et mécaniques des GR
Afin de comprendre l’effet des tensioactifs sur les GR, différentes expériences utilisant la spectrophotométrie ont été réalisées. Dans le but de mettre en évidence une éventuelle implication du cytosquelette des GR, des cinétiques de lyse des GR, dont le cytosquelette a été modifié, ont été étudiées. Afin de modifier les propriétés mécaniques des GR, différents traitements sont utilisés dont la déplétion en adénosine triphosphate (ATP), l’urée ou la phosphorylation de la protéine 4.1R. Par ailleurs, des protéines spécifiques des GR telles que la l’aquaporine CHIP28 et la bande 3 ont été inhibées, respectivement, à l’aide de chlorure de mercure (HgCl2) et de l’acide 4.4’-diisothiocyanostilbéne-2.2’-disulfonique (DIDS) pour souligner leur éventuelle implication au cours de la lyse. Enfin, les GR ont également subi des traitements au Méthyl-β-Cyclodextrine (MβCD) pour les dépléter de leur cholestérol et mettre en évidence une éventuelle implication du cholestérol lors de la lyse. Toutes ces expériences ont débuté par la mise au point d’un pool de sangs en PBS, dont l’hématocrite était de 40%. Après centrifugation différents milieux d’incubation ont été appliqués. Les cinétiques de lyse ont été observées pour une concentration en saponine de 5µM, représentant l’HE50 pour un temps de 10 minutes.
3.2.5.1. Déplétion en ATP
Dans un premier temps, nous avons réalisés une expérience permettant de dépléter le milieu en ATP, par des lavages quotidien des GR. Par la suite, un milieu déplétant l’ATP a été appliqué pour vérifier les résultats de la première expérience.
3.2.5.1.1. Par lavage des GR
La déplétion de l’ATP peut s’effectuer par le retrait des nutriments tels que le glucose contenu dans le plasma afin de stopper la production d’ATP par la glycolyse. Pour cela, un pool de sangs dans en milieu PBS a été réalisé. Puis chaque jour, ce pool a subit une centrifugation à 700g pendant 5 minutes suivi d’un lavage au PBS. Les GR ont été remis en suspension dans du PBS pour obtenir un hématocrite de 40%. Jour après jour, nous avons effectué des courbes d’hémolyse ainsi que des cinétiques de lyse à 5µM de saponine sur l’échantillon de sang à analyser (Htfinal=1%).
De plus, le suivi de l’évolution de deux pools de sangs a été réalisé. Le premier pool a subi des lavages au PBS quotidiennement et le second a été placé en sérum AB et a vieilli pendant trois jours. Au bout du troisième jour, les deux pools de sangs ont été lavés au PBS puis des cinétiques de lyse ont été réalisées, suivies par spectrophotométrie à 540nm. Afin de vérifier le retour des GR dans leur état initial et l’effet de la déplétion en ATP, les deux échantillons ont été incubés d’une part dans 1.2mM d’ATP [18] et d’autre part dans 10mM de glucose pendant 2 heures à température ambiante
sous une agitation rotationnelle de 20rpm. La Figure 3-19 illustre un schéma récapitulatif du mode opératoire.
Figure 3-19 : Schéma récapitulatif de la déplétion en ATP sur deux pools de sangs, l'un en PBS et l'autre en sérum AB
L’évolution de ces deux sangs a été suivie par une cinétique de lyse par la saponine Ultra Dry à 5µM (Htfinal=1%). Les témoins négatifs sont les pools de sangs du premier jour. L’ATP (CAS 34369-07-8, M=551.14) a été acheté chez Sigma-Aldrich.
3.2.5.1.2. Par un milieu déplétant en ATP
Nous avons vu dans le chapitre 1, que l’un des rôles de l’ATP est de fournir de l’énergie à la protéine kinase C pour phosphoryler la protéine 4.1R et ainsi détacher la spectrine de la membrane (Figure 3-20). Lorsque l’on dépléte le milieu en ATP, cette phosphorylation n’a pas lieu et le réseau de spectrine reste attaché à la membrane. Il a été démontré par le retrait de l’ATP que la tension membranaire augmentait [19].
Figure 3-20 : Mécanisme d’association de la membrane avec la spectrine par déplétion en ATP La méthode utilisée pour dépléter le milieu en ATP a été décrite par Tuvia et al. [18]. Elle utilise un
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l’enzyme glycolytique glycéraldéhyde-3-déshydrogénase (GAPDH). Cette molécule est fréquemment utilisée comme agent alkylant pour modifier les groupes thiols en S-carboxyamidométhylation. Les résidus cystéines de la GAPDH forment des liaisons thioéthers avec l’iodoacétamide, l’enzyme est inactive et la glycolyse inhibée [20]. L’inosine, quant à elle, est transformée en inosine monophosphate (IMP) par l’action de l’enzyme inosine kinase avec la consommation d’ATP, d’après l’Équation 3-15.
ATP + Inosine ADP + IMP
Équation 3-15
D’après Tuvia et al. [18], ce milieu ATP déplétant permet de réduire l’ATP intracellulaire de 1.2mM à 1-5µM après une heure d’incubation à 37°C.
Une centrifugation du pool de sangs en PBS a été effectuée à 700g pendant 5 minutes. Le volume de surnageant a été remplacé par un volume semblable d’une solution d’incubation. Cette solution est composée d’inosine à 10mM et d’iodoacétamide à 6mM dans du PBS contenant 0.2% de DMSO. Nous avons vérifié que l’hématocrite était toujours de 40%. Si l’hématocrite obtenu était au dessus de 40%, nous réalisions une dilution à l’aide de la solution d’incubation. En dessous de 40%, nous effectuions une centrifugation pour retirer l’excès de solution d’incubation. L’incubation a été effectuée pendant 3 heures à 37°C sous une agitation de 400rpm (à l’aide d’un thermomixer®). L’évolution de ce pool a été suivie par une cinétique de lyse par 5µM de saponine (Htfinal=1%). Le témoin négatif est le pool de sangs en PBS, n’ayant pas subi d’incubation en milieu déplétant en ATP. L’iodoacétamide (CAS 144-48-9, M=184.96g/mol) et l’inosine (CAS 58-63-9, M=268.23g/mol) ont été acheté chez Sigma-Aldrich.
3.2.5.2. Urée
L’urée traverserait la membrane érythrocytaire et affaiblirait les liaisons du cytosquelette de façon réversible. De faibles concentrations en urée sont nécessaires pour dénaturer la spectrine, contrairement aux protéines bande 3 et ankyrine [21,22]. Il a été montré que pour une incubation à 1,5M à 37°C pendant 10 min l’élasticité du cytosquelette est réduit de 18% (par des mesures de tension membranaire en micromanipulation), ce qui implique un relâchement du cytosquelette et une perte d’élasticité [22].
Différentes solutions d’incubation en urée ont été testées : 0.5, 0.8 ,1.0 ,1.3 et 1.7µM en milieu PBS sur un pool de sangs en PBS. L’incubation a été appliquée pendant 10 minutes à 37°C sous une agitation de 400rpm (à l’aide d’un thermomixer®). L’évolution de ces pools a été suivie par une cinétique de lyse par 5µM de saponine contenant des équivalents d’urée aux concentrations à étudier (Htfinale=1%) (Tableau 3-4). Le témoin négatif est le pool de sangs en PBS. Les solutions mères de saponine et d’urée ont été respectivement de 50µM et 5M.
Urée (M) 0 0,5 0,8 1 1,3 1,7
Saponine (µM) 5 5 5 5 5 5
3.2.5.3. Phosphorylation de la protéine 4.1R
Dans le but de favoriser l’activité de la protéine kinase C (PKC), le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et la calyculine A ont été utilisés. Le PMA est appliqué pour diminuer l’association de la glycophorine C avec le cytosquelette, causée par la phosphorylation de l’adducine [23]. En effet, le PMA est connu pour stimuler la phosphorylation des protéines du cytosquelette telles que la protéine 4.1R, la dématine et l’adducine par les protéines kinases [24]. La calyculine A est un inhibiteur des phosphatases, dont leur rôle est de retirer les groupements phosphates des protéines par hydrolyse [23]. L’activité de la PKC se traduit par le détachement de la spectrine de la membrane conduisant au relâchement du cytosquelette (Figure 3-21).
Figure 3-21 : Mécanisme de dissociation de la membrane avec la spectrine par activation de la PKC Suite à la centrifugation d’un pool de sangs en PBS, le volume de surnageant a été remplacé par un volume identique d’une solution d’incubation. Cette solution est composée de Calyculin A à 0.02µM diluée dans du PBS à 0.2% de diméthyl sulfoxide (DMSO). L’incubation a été de 30 minutes à 37°C sous une agitation de 400rpm. Une solution de PMA à 2µM diluée dans du PBS à 0.2% de DMSO a été ajoutée. L’incubation a été effectuée pendant 90 minutes à 37°C sous une agitation de 400rpm (à l’aide d’un thermomixer®). L’évolution de ce pool a été suivie par une cinétique de lyse par 5µM de saponine en PBS à 0.2% de DMSO (Htfinal=1%). Le témoin négatif est le pool de sangs en PBS. La calyculin A (CAS 101932-71-2, M=1009.17g/mol) et le PMA (CAS 16561-29-8, M=616.83g/mol) ont été acheté chez Sigma-Aldrich.
3.2.5.4. Inhibition de l’aquaporine par le chlorure de mercure
Les ions mercure sont connus pour inhiber la plupart des aquaporines dont l’aquaporine-1 (AQP1 ou CHIP28 pour les érythrocytes) en oxydant les résidus cystéines [25,26]. Le résidu est la cystéine 189 (Cys189) pour l’AQP1 humaine situé dans le pore. Une étude sur le mécanisme d’inhibition a été investiguée et un changement de conformation de la protéine par l’interaction des ions mercure avec les résidus cystéine se produirait, conduisant à l’inhibition du pore [27]. Les ions mercures pourraient également bloquer le pore par un encombrement stérique sans pour autant induire un changement de conformation [28]. Il existe deux isoformes d’aquaporine appelées 1 et 3. L’AQP1 est la plus abondante avec 120 000 à 160 000 copies [29]. L’AQP 3 résiste aux ions mercure et permet la diffusion facilité du glycérol et de l’urée au travers de la membrane plasmique. L’inhibition de l’AQP1 est complètement réversible par incubation des érythrocytes dans du β-mercaptoethanol (BME) pendant 15 minutes, un agent réducteur [25,30–32]. Les inconvénients dans l’utilisation des ions
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mercure sont leur faible sélectivité et leur forte toxicité [30], c’est pourquoi les résultats ont été interprétés avec précaution.
Différentes solutions d’incubation de chlorure de mercure (HgCl2) ont été testées : 100, 200 et 300µM en milieu PBS sur un pool de sangs en PBS. L’incubation a été réalisée pendant 10 minutes à 37°C sous une agitation de 400rpm (à l’aide d’un thermomixer®). L’évolution de ces pools a été suivie par une cinétique de lyse par 5µM de saponine contenant des équivalents d’HgCl2 aux concentrations à étudier (Htfinal=1%) (Tableau 3-5). Le témoin négatif est le pool de sangs en PBS.
HgCl2 (µM) 0 100 200 300
Saponine (µM) 5 5 5 5
Tableau 3-5 : Solution de cinétique de lyse contenant du HgCl2 en milieu PBS
Par la suite, une centrifugation à 700g de ces échantillons traités a été appliquée pendant 5 minutes. Le volume de surnageant a été remplacé par un volume identique d’une solution d’incubation de 5µM de BME en milieu PBS. L’incubation a été effectuée pendant 15 minutes à 37°C sous une agitation de 400rpm (à l’aide d’un thermomixer®). L’évolution de ces pools a été suivie par une cinétique de lyse par 5µM de saponine contenant des équivalents d’HgCl2 aux concentrations à étudier (Htfinal=1%) (Tableau 3-6).
HgCl2 (µM) 0 100 200 300
Saponine (µM) 5 5 5 5
BME (µM) 5 5 5 5
Tableau 3-6 : Solution de cinétique de lyse contenant du HgCl2 et 5µM de BME en milieu PBS
Les solutions mères de saponine, d’HgCl2 et de BME sont respectivement de 50, 3683.24 et 12.8µM. HgCl2 (CAS 7487-94-7, M=271.50g/mol) et le BME (CAS 60-24-2, M=78.13g/mol) ont été acheté chez Sigma-Aldrich.
3.2.5.5. Inhibition de la bande 3 par le DIDS
La protéine bande 3 est inhibée de façon réversible par un inhibiteur compétitif, l’acide 4.4’-diisothiocyanostilbéne-2.2’-disulfonique (DIDS) [5,33–35]. Différentes solutions d’incubation au DIDS ont été testées : 0.1, 10,100 et 1000µM en milieu PBS sur un pool de sangs lavé au PBS. L’incubation a été réalisée pendant 1 heure à température ambiante sous une agitation rotationnelle de 20rpm. L’évolution de ces pools a été suivie par une cinétique de lyse par 5µM de saponine contenant des équivalents de DIDS aux concentrations à étudier (Htfinal=1%) (Tableau 3-7). Le témoin négatif est le pool de sangs n’ayant pas subi d’incubation en présence de DIDS.
DIDS (µM) 0 0,1 10 100 1000
Saponine (µM) 5 5 5 5 5
Les solutions mères de saponine et de DIDS sont respectivement de 50 et 1200µM. Le DIDS a été acheté chez Sigma-Aldrich (CAS 207233-90-7, M=498.48g/mol).
3.2.5.6. Déplétion en cholestérol par la MβCD
La méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) est une molécule cyclique composée de 7 unités de glycose, liées par les liaisons α-1,4 [36,37]. La molécule MβCD est connue pour enlever le cholestérol des membranes cellulaires [38]. Cette molécule se lie sélectivement aux stérols membranaires pour former des complexes solubles dans l’eau [37,39]. Le mécanisme d’extraction reste encore peu compris. Une étude sur l’action de cette molécule sur les GR a été réalisée, montrant une augmentation de la fragilité osmotique des GR avec l’augmentation de la concentration en MβCD. A forte concentration, la cyclodextrine peut induire de la lyse.
Différentes solutions d’incubation au MβCD ont été testées : 3 et 5mM en milieu PBS sur un pool de sangs lavé au PBS. L’échantillon de sangs a été introduit (5% v/v) dans la solution d’incubation. L’incubation appliquée a été de 30 minutes à 37°C au bain marie. Suite à une centrifugation de 5 minutes à 700g, le surnageant a été dosé par l’automate de biochimie ABX Pentra 400, pour connaitre le contenu en cholestérol. Les érythrocytes ont été remis en suspension dans du PBS. L’évolution de ces pools a été suivie par une cinétique de lyse par 5µM de saponine en PBS (Htfinal=1%). Le témoin négatif est le pool de sangs n’ayant pas subi de déplétion en cholestérol. La molécule a été acheté chez Sigma-Aldrich (CAS 128446-36-6, M=1310g/mol).