Implication des lipides membranaires

Le cholestérol serait l’un des sites de complexation des saponines pour la formation d’un pore permettant l’hémolyse. Afin de mettre en évidence l’implication du cholestérol dans le mode d’action de nos saponines, la molécule méthyl-β-cyclodextrine est utilisée pour dépléter la membrane érythrocytaire en cholestérol [15]. En parallèle, un marquage des phospholipides par la PKH26 a été réalisé pour souligner l’implication des lipides lors de la lyse.

4.2.1.1. Déplétion en cholestérol

La molécule, méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), est connue pour extraire le cholestérol des membranes cellulaires [16]. Cette molécule se lie sélectivement aux stérols membranaires pour former des complexes solubles dans l’eau [17,18]. Une étude de l’action de cette molécule sur les GR a été réalisée, montrant une augmentation de la fragilité osmotique des GR avec l’augmentation de la concentration en MβCD [18]. De plus à forte concentration, cette cyclodextrine peut induire de la lyse [18]. L’utilisation du protocole (chapitre 2 page 79) permet une diminution du cholestérol membranaire de 45% sans modification du contenu en phospholipides [15].

Les résultats de la Figure 4-5 illustrent des cinétiques d’hémolyse d’un pool de sangs en absence et en présence de 3 et 5mM de MβCD. La déplétion en cholestérol a été vérifiée par le dosage du cholestérol contenu dans les surnageants, à l’aide de l’automate de biochimie ABX Pentra 400. Les surnageants des pools de sangs incubés dans 0, 3 mM et 5 mM de MβCD ont respectivement 0, 0.04 et 0.29mM de cholestérol.

Figure 4-5 : Cinétique d'hémolyse par 5µM de saponine sur un pool de sangs incubé dans du MβCD. (Htfinale=1%)

Le surnageant des érythrocytes incubés dans 5mM a montré une lyse partielle des cellules. Par rapport à notre courbe témoin (Courbe bleue Figure 4-5), nous remarquons qu’en augmentant la déplétion en cholestérol la lyse est fortement ralentie. Il semblerait que le taux de cholestérol présent dans les GR ait un rôle dans la lyse par les saponines.

La Figure 4-6 illustre les observations réalisées en microscopie en milieu PBS et en milieu MβCD.

Figure 4-6 : Observations microscopiques d'un pool de sangs en milieu PBS (A) et incubé avec 3mM (B)

et 5mM (C) de MβCD (Htfinale = 0.08%). Les flèches vertes indiquent des stomatocytes et les flèches rouges

des sphérocytes.

Nos données microscopiques montrent 45% d’échinocytes en milieu PBS (Figure 4-6 A). Pour des GR ayant subi une incubation dans 3mM de MβCD, nous comptabilisons 34% d’échinocytes et 25% de stomatocytes (flèche jaune Figure 4-6 B). Concernant les GR incubés dans 5mM de MβCD, ils apparaissent tous sous une forme de type sphérocyte (flèches rouges Figure 4-6 C). La déplétion des érythrocytes en cholestérol est connue pour transformer les discocytes en stomatocytes [19]. Hui et al. [20] ont montré qu’à faible ratio cholestérol/phospholipide, les GR étaient de forme sphérocyte. Les maladies liées à la forme sphérocyte seraient dues à une déficience du complexe ankyrine-bande 3

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 200 400 600 800 1000 A⁵⁴ 0n m Temps (secondes) Méthyl-β-cyclodextrine = 0mM Méthyl-β-cyclodextrine = 3mM Méthyl-β-cyclodextrine = 5mM A B C Sphérocytes Stomatocytes

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était nécessaire au maintien de l’activité des protéines. Les récepteurs, les enzymes et les transporteurs sont sensibles à la structure physico-chimique des lipides. Ainsi la déstabilisation des lipides peut induire des perturbations dans le membrane érythrocytaire [22]. De plus, le cholestérol serait fortement lié à la bande 3 [23]. Ainsi, la déplétion en cholestérol par 5mM de MβCD a pu induire un changement lipidique autour de la bande 3 conduisant à la fragilisation du complexe jonctionnel et par conséquent, à la formation de sphérocytes. La Figure 4-7 représente les variations du rayon d’un GR en milieu PBS et d’un GR incubé dans 3mM de MβCD.

Figure 4-7 : Variation moyenne du rayon d’un GR en milieu PBS et incubé dans 3mM de MβCD sous

l'action de 7µM de saponine (Htfinale=0.08%)

Les variations du rayon d’un GR en milieu PBS ou déplété en cholestérol sont du même ordre de grandeur, avec une cinétique de lyse plus lente pour le GR déplété en cholestérol. La déplétion en cholestérol n’a pas d’impact sur la variation du volume des GR.

En résumé, en diminuant le taux de cholestérol la lyse par les saponines est ralentie. L’implication des lipides a également été observée en marquant spécifiquement les lipides de la membrane des GR.

4.2.1.2. Marquage des lipides par PKH26

La molécule fluorescente PKH26 permet de marquer les membranes grâce à l’incorporation de ses longues chaines aliphatiques dans la membrane lipidique. La molécule PKH26 fluoresce dans la région jaune orangé du spectre visible, avec des longueurs d’ondes optimales d’excitation et d’émission, respectives, de 551nm et 567nm. La Figure 4-8 représente une image de GR marquée au PKH26 en milieu PBS, selon le protocole du chapitre 2 pages 80.

0 0,1 0,2 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Δ R /R 0 Temps (secondes) Milieu PBS Milieu 3M MβCD

Figure 4-8 : Marquage des GR au PKH26

En épifluorescence on observe des GR qui émettent un signal lumineux, montrant le marquage des lipides au PKH26. Ainsi nous pouvons suivre la lyse des GR par les saponines en épifluorescence (Figure 4-9).

Figure 4-9 : Lyse d'un GR par la saponine au cours du temps. Les flèches rouges illustrent la formation d’une vésicule à la surface du GR.

Comme nous l’avons vu précédemment, l’érythrocyte passe de sa forme discocyte à échinocyte, suivi d’un gonflement. Suite à la perte de contraste qui définit la libération de l’hémoglobine, des vésicules apparaissent à la surface du GR. La Figure 4-10 A nous montre l’apparition de vésicules en épifluorescence.

Figure 4-10 : Lyse d'un GR en épifluorescence (A) et en transmission (B). La flèche jaune montre la formation d’une vésicule sur la surface d’un GR.

Le GR lysé constitue ce qu’on appelle un GR fantôme visible en transmission. Cette vésicule apparait en gris foncé sur le dessus du GR fantôme (flèche jaune Figure 4-10 B). Ces résultats sont cohérents avec la littérature puisque la présence de vésicules a été confirmée avec les images d’Iglic et al. [24],

A B

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lors d’une étude de vésiculation avec des tensioactifs échinocytogéniques. La formation de vésicules peut s’expliquer par une asymétrie de composition des feuillets de la membrane qui favorise sa courbure. En effet, la perturbation membranaire augmente du fait de l’incorporation des tensioactifs dans la membrane, induisant une pression d’empilement dans cette dernière ou l’un des feuillets de la bicouche. Cette force induit une dissociation des domaines spécifiques de la membrane avec le cytosquelette. Des mouvements latéraux des lipides et des protéines se produisent créant ainsi des vésicules [25]. L’apparition de vésicules pourrait également s’expliquer par une fragilisation du cytosquelette ou d’un lien entre ce dernier et la membrane, créant un bourgeonnement à la surface de la membrane (Figure 4-11).

Figure 4-11 : A) Schéma d’une membrane érythrocytaire avec son cytosquelette. Les ronds noirs représentent les complexes actine-4.1R et les ronds gris, les complexes bande 3-ankyrine. Les lignes

noires reliant les différents complexes illustrent les filaments de spectrines. Les cercles en pointillé montrent les configurations des filaments de spectrine qui contribuent à l’élasticité d’entropique. B) Représentation de la configuration entropique des filaments de spectrines quand le complexe bande

3-ankyrine est dégradé [26].

En effet, la formation de vésicules peut s’expliquer par la dégradation du lien vertical du complexe bande 3-ankyrine, induisant la rigidification du cytosquelette (augmentation de la constante de raideur du ressort entropique) et la compression membranaire. Ainsi, la force exercée par le cytosquelette induit un bourgeonnement à la surface de la bicouche lipidique, qui est le résultat de la formation de vésicules [26]. Les saponines agiraient probablement sur le cytosquelette. Par cette expérience, nous souhaitions vérifier l’intégrité des lipides lors de la lyse par les saponines. La membrane ne semble pas être solubilisée sous l’action des tensioactifs. Nous n’avons pas observé de fluorescence, due à la présence de lipides, dans le milieu extracellulaire. Il semblerait, dans nos conditions, que l’intégrité de la bicouche lipidique soit conservée.

Lors de la lyse des GR par les saponines, nous avons observé un gonflement. Dans le but de déterminer son fonctionnement, nous avons inhibé différents canaux ioniques spécifiques des GR.