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UNIVERSITE DE BOURGOGNE UFR MEDECINE

THE SE

présentée à la Faculté de Médecine de DIJON en vue d'obtenir le grade de

Docteur de l'Université de Bourgogne

Spécialité: Physiopathologie - Pharmacologie

Soutenue publiquement le 26 Mars 1998 par

Florence DALLOZ

IMPLICATION DES RADICAUX LIBRES OXYGENES DANS LES INCIDENCES FONCTIONNELLES ET METABOLIQUES D'UNE IRRADIATION CARDIAQUE

SEULE OU ASSOCIEE A UN TRAITEMENT PAR LA DOXORUBICINE CHEZ LE RAT.

JURY: Mme D. FEUVRAY Rapporteur

M. A. ROSSI Rapporteur

M. L.ROCHETTE Directeur

M. A.BRIL

M. F. BRIOT

M. P.MAINGON

28 MAI 1998

[INTRODUCTION

(mSTORIQUE

GENERALITES CONCERNANT LES RAYONNEMENTS IONISANTS

1. Définition et mécanismes d'action des rayonnements ionisants p5

1.1. Principe p 5

1.2. Les différents types de rayonnements p 7

1.2.1. Les rayons X et y p 7

1.2.2. Les autres sources de rayonnement p 7

~ les faisceaux d'électrons p 7

~ l'accélération d'autres particules chargées p 8

~ les neutrons p 8

1.3. Méthodes d'évaluation des rayonnements p 8

1.3.1. Dosimétrie p 8

1.3.2. Energie absorbée par le milieu - notion de Transfert d'Energie Linéaire p8 II. Effets sur la matière vivante

II.1. Effets directs et indirects des radiations

11.2. Facteurs influençant l'action des rayonnements ionisants 11.2.1. Rôle de l'oxygène (02)

II.2.2. L'état redox du milieu cellulaire II.3. Effets biologiques des rayonnements

11.3.1. Au niveau du noyau: effets sur l'ADN

~ Modification de la structure de l'ADN

~ Perturbation de l'activité de l'ADN

~ Altérations des chromosomes et mutations II.3 .2. Au niveau des macromolécules: protéines et lipides

~ Les protéines

p9 p9 plO plO p 12 pl3 pl3 p 13 p 14 P 15 P 16 P 16

11.3.4. Au niveau des voies de transduction et expression génique p 20

~ Voies de transduction induites par l'irradiation p 21

~ Gènes induits par l'irradiation p 21

II.3.5. Irradiation et apoptose p 22

~ Introduction p 22

~ Apoptose due aux rayonnements ionisants p 23

~ Modifications biochimiques caractéristiques de l'apoptose p23

~ Voies de signalisation impliquées dans l'apoptose induite

par l'irradiation p 23

~ Gènes suppresseurs de tumeurs et réponse à l'irradiation p 24

~ Conclusion p 25

11.3.6. Processus de cancérisation p 26

III. Mécanismes de défense contre les effets de l'irradiation III.l. Mécanismes de réparation de l'ADN

III.l.l. Réparation par excision III. 1.2. Réparation par recombinaison m.1.3. Réparation par système SOS

III.2. Défenses contre la production de radicaux hbres III. 2. 1. Systèmes de défense enzymatique

~ Superoxydes dismutases (SODs) -Q- Catalases

-Q- Glutathion peroxydase (GSH-Px) III.2.2. Défenses antioxydantes (non enzymatiques) -Q- Vitamine C ou acide ascorbique -Q- Vitamine E ou tocophérols -Q- Vitamine A ou caroténoïdes -Q- Autres : glutathion, acide urique

IRRADIA TION ET COEUR

p27 p27 p27 p27 p28 p28 p28 p28 p29 p29 p29 p29 p 30 P 30 p 30

1. Introduction p 31

n.

ILL Introduction p 32

II.2. Manifestations cliniques des maladies cardiaques induites par les radiations

(MeIR) p 32

II.2.1. Péricardite aiguë au cours de l'irradiation p 33

II.2.2. Péricardite retardée p 33

II.2.3. Pancardite p 33

II.2.4. Maladies des artères coronaires p 34

II.2.5. Autres symptômes cliniques p 34

II.3.2. Effets tardifs p 35

.ç. le péricarde p 35

.ç. l'épicarde p 35

.ç. le myocarde p 35

.ç. l'endocarde et les valves p 35

.ç. Les vaisseaux sanguins p 36

II.4. Effets de la chimiothérapie p 37

II.5. Conclusion p 38

III. Modèles expérimentaux p 39

IIL!. Introduction p 39

IIL2. Caractéristiques des altérations expérimentales p 39

IIL3. Pathogénèse des MCIR expérimentales p 40

111.3.1. Mécanismes de l'exsudat et de la fibrose péricardique p 40 111.3.2. Mécanismes de la fibrose myocardique p 41

m.4. Autres observations expérimentales p 41

IV. Facteurs de risque: rôle des anthracyclines p 42

IV.1. Introduction p 42

IV.2. Manifestations de la cardiotoxicité aux anthracyclines p 43

IV.2.1. En clinique humaine p 43

.ç. Toxicité aiguë p 43

.ç. Toxicité chronique, cumulée p 43

.ç. Surveillance p 44

.ç. Corrélations anatomo-cliniques p 45

.ç. Conclusion p 45

IV.2.2. Dans les modèles expérimentaux p 45

IV.3. Mécanismes envisageables de la cardiotoxicité aux anthracyclines p 46

IV.3.1. Formation de radicaux libres p 46

.ç. Arguments favorables p 46

.ç. Production d'espèces radicalaires à partir de la DXR p 46

{o- Actions délétères des radicaux libres sur la fonction

cardiaque p 49

IV.3.2. Perturbations des mouvements calciques myocytaires p 49

{o- Rôle des anthracyclines p 49

{o- Rôle des métabolites des anthracyclines p 49

IV.3.3. Autres hypothèses p 50

{o-Hypothèse des prostaglandines p 50

{o- Hypothèse de l'histamine p 50

ESPECES RADICALAIRES SUSCEPTIBLES D'ETRE FORMEES AU COURS DE L'IRRADIATION.

1. Introduction p 51

Il. Matériel et méthodes p 54

11.1. Réactifs p 54

11.2. La technique de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) p 54

11.2.1. Principe p 54

11.2.2. Appareillage p 56

11.2.3. Principales caractéristiques d'un spectre RPE p 56

~ La position des raies p 56

~ Nombre et largeur des raies p 57

~ Quantification p 57

II.2.4.Technique de piégeage de spin ou "spin trapping" p 57 II.2.5. Paramètres de détection RPE utilisés dans la partie expérimentale p 58

~ Détermination par RPE des radicaux O2''' et ·OH p 58

~ Détermination par RPE de "NO p 59

II.3. Protocoles expérimentaux p 59

II.3.!. Systèmes générateurs des radicaux libres O2''' et ·OH p 59

~ Production de O2.- P 59

~ Production des radicaux ·OH p 59

~ Substances étudiées p 60

II.3.2. Système de complexation du "NO p 60

II.4. Expression des résultats et statistiques p 61

III. Résultats p 62

IIL1. Piégeage de l'anion superoxyde p 62

IIL2. Piégeage du radical hydroxyle p 67

IIL3. Production d'oxyde nitrique p 70

IV. Discussion p 72

DEUXIEME PARTIE

ETUDE DES EFFETS A COURT ET MOYEN TERMES DE

L'IRRADIATION SUR UN MODELE D'IRRADIATION CARDIAQUE CHEZ LE RAT IN VIVO.

1. Introduction P 78

II.2. Protocole expérimental p 82 II.3. Etude de la réactivité cardiaque par le modèle de coeur isolé perfusé selon

Langendorff p 82

II.3.1. Principe p 82

II.3.2. Milieu de perfusion p 82

II.3.4. Technique de perfusion p 83

II.3.4. Protocoles expérimentaux p 83

11.3.5. Paramètres mesurés p 84

II.4. Dosages biochimiques p 85

II.4.1. Préparation des échantillons p 85

II.4.2. Mesure de différents index de peroxydation lipidique p 85

-0} Principe p 85

-0} Dosage des SRTBA p 86

~ Evaluation du pouvoir antilipoperoxydant du plasma p 86

~ Evaluation de la peroxydation cardiaque p 87 II.4.3. Evaluation du pouvoir antioxydant du plasma par RPE p 87

~ Principe p 87

~ Méthode p 87

11.4.4. Evaluation des défenses antioxydantes non enzymatiques p 88

-0} Dosage de la vitamine C p 88

-0} Dosage de la forme radicalaire de la vitamine C : le radical

ascorbyle p 89

~ Dosage de la vitamine E p 89

II.4.5. Evaluation des défenses de nature enzymatique p 90

~ Dosage des superoxydes dismutases p 90

~ Dosage des glutathions peroxydases p 91

-0} Dosage de la catalase p 92

11.4.6. Evaluation du métabolisme du ~O p 92

~ Evaluation du complexe hémoglobine-~O p 92

-0} Evaluation de la méthémoglobine p 93

~ Dosage des nitrites et nitrates plasmatiques p 93

11.5. Analyses statistiques p 94

III. Résultats p 95

IlL1. Etude de la réactivité cardiaque par le modèle de coeur isolé perfusé selon

Langendorff p 95

lIL1.1. A 24 heures = à court terme p 95

-0} Paramètres fonctionnels p 95

~ Libération du radical ascorbyle à la reperfusion p 96

-0} Libération de DMPOrOH à la reperfusion p 97 -o}Troubles du rythme à la reperfusion p 97

III. 1.2. A 1 mois = à moyen terme p 100

-0} Paramètres fonctionnels p 100

IIL2. Dosages biochimiques à 24 heures = à court terme p 104

III.2.1. Au niveau du cœur p 104

~ Indices de peroxydation lipidique p 104

~ Evaluation des défenses antioxydantes non enzymatiques p 104

~ Evaluation des défenses antiradicalaires de nature

enzymatique p 105

III.2.2. Au niveau du plasma p 105

~ Indices de peroxydation lipidique p 105

~ Evaluation du pouvoir antioxydant du plasma par RPE p 105

~ Evaluation des défenses antioxydantes non enzymatiques p 107

~ Evaluation des défenses antiradicalaires de nature enzymatique

~ Métabolisme de l'oxyde nitrique

P 107 P 107

IV. Discussion P 109

TROISIEME PARTIE

ETUDES DES EFFETS COMBINES DE L'IRRADIATION +

DOXORUBICINE A COURT ET MOYEN TERMES SUR UN MODELE D'IRRADIATION CARDIAQUE CHEZ LE RAT IN VIVO.

1. Introduction P 120

II. Matériel et méthodes p 123

ILL Méthode d'irradiation p 123

11.2. Protocole expérimental p 123

11.3. Etude de la réactivité cardiaque par le modèle de perfusion selon Langendorff II.4. Dosages biochimiques

n.5.

IILI. Aspect général des animaux

IIL1.1. A 24 heures = à court terme

~ Comportement des animaux

~ Poids des animaux

-} Poids des organes: coeur et poumons III.l.2. A 1 mois = à moyen terme

-} Comportement des animaux -} Poids des animaux

p 125 P 125 P 125 P 126 P 126 P 126 P 126 p 126 p 127 p 127 p 127 p 128

selon Langendorff

III.2.1. A 24 heures

=

-0} Paramètres fonctionnels

-0} Libération du radical ascorbyle à la reperfusion -o}Troubles du rythme à la reperfusion

III.2.2. A 1 mois

=

-0} Paramètres fonctionnels

-0} Libération du radical ascorbyle à la reperfusion -o}Troubles du rythme à la reperfusion

III. 3. Dosages biochimiques

ill.3.l. A 24 heures

=

-0} Au niveau du coeur

-0} Au niveau du plasma III.3.2. A 1 mois

=

-0} Au niveau du coeur

-0} Au niveau du plasma IV. Discussion

[CONCLUSION GENERALE

[BffiLIOGRAPHIE

[PUBLICATIONS et COMMUNICATIONS

p 130 p 130 p 130 P 131 p 132 p 134 p 134 p 135 p 135 p 138 p 138 p 138 p 140 P 143 P 143 p 145 p 148

p 162

1

p 164

1

p 186

1

L'existence des radiations remonte aux origines même de la vie, puisque l'intervention de réactions photochimiques a permis de lier l'azote, l'eau et le carbone. Depuis, les échanges discontinus d'énergie n'ont jamais cessé entre quanta de radiation et de matière. De nombreux systèmes biologiques dépendent des rayonnements naturels : la photosynthèse, au cours de laquelle l'énergie solaire captée détermine l'énergétique des êtres vivants; la vision; ou la radio-mutagénèse, déterminante pour la sélection et l'évolution des espèces. Ces fonctions biologiques majeures sont élaborées au sein de structures biologiques hautement spécialisées.

Les cellules sont généralement pourvues de systèmes capables de prévenir et de réparer les lésions susceptibles de se produire au cours de leur fonctionnement.

Avec la découverte de l'irradiation artificielle, l'homme a perturbé son environnement naturel de radiations, que ce soit par l'utilisation des rayons X et de la radioactivité artificielle, ou plus récemment les tentatives de maîtriser l'énergie des noyaux atomiques. Leur production n'est plus en rapport avec un organite cellulaire specialisé et aucun système de défense spécifique n'est naturellement prévu pour combattre les effets des radio-lésions.

L'utilisation extensive de l'irradiation artificielle et l'ampleur des effets qu'elle engendre chez l'homme a donné naissance à une science nouvelle, la RADIOBIOLOGIE. Son objectif est de déterminer la nature des interactions de l'énergie radiante avec la matière vivante, et d'étudier leurs incidences sur les organismes. La radiobiologie est classiquement subdivisée en 2 grands thèmes: la radiobiologie fondamentale et la radiobiologie appliquée.

- la radiobiologie fOndamentale englobe l'étude: 1) du type de rayonnement, de ses caractéristiques et ses conséquences dans divers systèmes, 2) de la radiochimie des constituants fondamentaux (eau, acides aminés, ... ) et des molécules "nobles" (acides nucléiques, protéines ... ). Elle regroupe ainsi l'étude des radio-lésions subcellulaires et cellulaires.

-la radiobiologie appliquée s'intéresse au maniement des radiations dans des domaines variés: en radiothérapie, en radio-cancérogénèse, en génétique des populations, en stérilisation industrielle, ou en biologie moléculaire ...

Les effets cytotoxiques de l'irradiation sont mis à profit en thérapeutique clinique dans le traitement de certains cancers afin d'éliminer les cellules cancéreuses. Toutefois des effets secondaires graves peuvent survenir et compromettre à plus ou moins long terme la viabilité de

l'organe ou du tissu irradié. Ains~ la radiothérapie préconisée dans le traitement de la maladie de Hodgkin ou de certains cancers du sein ou pulmonaires implique l'irradiation du myocarde et conduit fréquemment à des complications cardiaques. A long terme, cette irradiation peut être tenue pour responsable de la survenue d'une insuffisance cardiaque, qui se caractérise par une dégradation plus ou moins rapide de la fonction de l'organe.

D'un point de vue physico-chimique, lors de l'irradiation d'un tissu ou d'un organe, l'énergie cédée au milieu va être transmise en partie ou totalité aux électrons. Ces électrons accélérés constituent les agents responsables des radio-lésions, qu'ils soient des électrons incidents, ou des électrons arrachés et à nouveau percutants. Les molécules cibles se trouvent ionisées, d'autres brisées. Les principales réactions chimiques qui se produisent sont des réactions d'OXYDATION au cours desquelles interviennent des intermédiaires très réactifs appelés RADICAUX LIBRES. Dans les milieux biologiques, les radicaux libres instables vont immédiatement réagir avec les molécules environnantes et provoquer des lésions graves au sein des tissus. Ces altérations sont exacerbées par la présence de l'oxygène moléculaire, qui exerce une action radio-sensibilisatrice puissante.

L'objectif de notre travail consistera d'une part à apprécier l'implication des radicaux libres oxygénés et des systèmes de défense cardiaque et systémique chargés de les neutraliser, dans la survenue des effets délétères induits par l'irradiation à court et moyen termes ; et d'autre part, à comparer l'évolution de ces systèmes lorsque la radiothérapie est associée à une chimiothérapie par les anthracyclines.

Après quelques rappels concernant la nature et les effets des radiations ionisantes, la première partie de ce travail expérimental a été consacrée à l'étude de certaines espèces radicalaires, qui sont susceptibles d'être générées au cours de l'irradiation. Dans les milieux biologiques, habituellement oxygénés, les principales espèces radicalaires dérivées de l'oxygène : l'anion superoxyde (0/-) et le radical hydroxyle COH), sont générées en quantité importante au cours de l'irradiation. L'irradiation peut également favoriser la formation d'oxyde nitrique CNO), un autre composé radicalaire endogène, qui peut devenir toxique s'il est présent en quantité importante au niveau de certains territoires. La technique de Résonance

Paramagnétique Electronique (RPE), qui permet de détecter de façon directe les radicaux libres, nous a permis d'appréhender les interactions entre différentes molécules capables de libérer du ~O et un système générateur d'anion superoxyde ou de radical hydroxyle. Si l'interaction entre O_2.- et ~O était amplifiée par l'irradiation, elle pourrait contribuer au développement des lésions cellulaires. En effet, elle conduit à la formation d'anions peroxynitrites (ONOO"), source d'oxydants très puissants capables d'attaquer les protéines, les lipides et les acides nucléiques. Les effets délétères résultant de l'interaction O_2- / ~O

viendraient s'ajouter aux actions cytotoxiques des radicaux ·OH générés en grande quantité au cours de l'irradiation.

Dans une deuxième partie basée sur une approche expérimentale, nous nous sommes intéressés aux incidences métaboliques et fonctionnelles à COURT terme (24 heures) et à MOYEN terme (un mois) d'une irradiation LOCALISEE à l'aire cardiaque chez le rat.

Le protocole expérimental d'irradiation a été parfaitement codifié dans notre équipe de recherche en collaboration avec le service de Radiothérapie du Centre G.F. Leclerc (Pr. J.C.

Horiot, Dr. P. Maingon).

Concernant les incidences fonctionnelles, la réactivité de coeurs irradiés de rats a été appréciée in vitro par la technique de coeur isolé perfusé selon Langendorff en mesurant l'évolution des paramètres cardiaques (débit coronaire, fréquence, indices de contraction) au cours d'une séquence d'ischémie globale sans débit résiduel, suivie d'une phase de reperfusion.

Sur le plan métabolique, l'évolution des systèmes de défense antiradicalaires après irradiation cardiaque a été étudiée au niveau systémique (plasma) et au sein de l'organe irradié (le cœur). Notre approche était focalisée d'une part sur l'évaluation de certains éléments des systèmes de défense enzymatique: les superoxydes dismutases (SOD), les catalases et les glutathion peroxydases (GSH-Px) ; et d'autre part sur les teneurs en antioxydants tels que les vitamines C et E. Différents index de peroxydation lipidique ont permis de déterminer le niveau d'altération des lipides plasmatique et cardiaque. Enfin, la voie de l'oxyde nitrique, mise enjeu en particulier dans les états inflammatoires, a aussi été appréciée.

Dans une troisième partie de notre approche expérimentale, nous avons associé à l'irradiation un traitement chimiothérapique par les anthracyclines (par la doxorubicine) qui sont des agents anticancéreux très efficaces, mais dont l'utilisation thérapeutique est limitée du fait de leur toxicité cardiaque. En clinique humaine, la combinaison de la radiothérapie à un traitement par les anthracyclines correspond à une attitude thérapeutique qui peut être adoptée.

Toutefois, il existe un risque de potentialisation des effets secondaires toxiques de chacune des interventions prises isolément. Nous nous sommes proposés d'appréhender les incidences fonctionnelles et métaboliques à COURT et MOYEN termes de cette association, et d'apprécier l'évolution de la réactivité du coeur soumis à ces différents traitements. Ces études ont été conduites expérimentalement chez le rat.

GENERALITES

CONCERNANT LES RAYONNEMENTS IONISANTS

1. DEFINITION ET MECANISMES D'ACTION DES RAYONNEMENTS IONISANTS

1.1. Principe

La lumière, les ultra-violets, les infra-rouges, les rayons X et gamma (y) sont des rayonnements électromagnétiques. Ils représentent une forme d'énergie capable de se propager dans le vide à la vitesse de 300 000 km/s. Considérés sous leur aspect ondulatoire, ils constituent des ondes électromagnétiques, alors que pris sous leur aspect corpusculaire, ils sont symbolisés par des photons.

Un photon se propage en ligne droite jusqu'à la survenue d'une interaction avec l'une des particules du milieu qu'il traverse. Au cours de cette interaction, le photon transfère toute ou une partie de son énergie à la particule heurtée. Ceci se traduira par :

- l'effet photoélectrique, si le photon interagit avec un atome qui absorbe la totalité de son énergie.

- l'effet Compton, lorsque le photon rencontre un électron planétaire. Dans le domaine d'énergie considéré en radiobiologie, l'effet Compton est l'interaction la plus fréquente.

- la formation de paires d'électrons, encore appelées matérialisation. Elle se produit pour des énergies très élevées : si le photon pénètre dans un champ électrique très intense qui règne au voisinage d'un noyau atomique, il peut se matérialiser sous forme d'une paire d'électrons.

Les rayonnements électromagnétiques sont composés d'un faisceau de photons.

Lorsqu'un faisceau de photons traverse un milieu matériel, le nombre de photons primaires, provenant directement de la source, diminue. La décroissance d'énergie qui en découle pour le faisceau s'appelle" l'atténuation". Une partie de l'énergie de ces photons réapparaît sous forme de photons diffusés, qui ont une direction différente de celle des photons primaires et une

énergie inférieure. Une autre partie de l'énergie est absorbée par le milieu, généralement sous fonne d'énergie cinétique, qui est communiquée aux électrons mis en mouvement au cours des interactions.

Ainsi, dans un milieu traversé par les photons, les effets terminaux observés ne sont pas produits directement par les interactions entre les photons et le milieu, mais par l'intennédiaire des électrons secondaires. Les photons constituent uniquement la source d'énergie, les distributeurs d'électrons secondaires. L'énergie des photons conditionne les caractéristiques des électrons : leur énergie donc leur parcours, leur direction, et leur distribution spatiale dans le milieu irradié. Ces électrons secondaires sont responsables des réactions d'ionisation et d'excitation qui sont à l'origine des effets physico-chimiques, biochimiques, et en dernier lieu des effets biologiques (figure 1).

Rayonnement y Milieu traversé Collisions successives

'/ 2aires • 'E <E

~

eectrons ^~ e, ^b a ~ ec

Photons

~.~.

?--:: .. ~

• • • ~ Io~at~ons ----+- Effets

-+-

ExcItations . . .

é E

~

, a , •

e, ~

/ chaleur

Ec«< Ea

Figure 1 : Séquence des événements qui se produisent lors de l'interaction des rayonnements ionisants avec un mileu biologique.

é=électron ; E., Eb' Ec=énergie cinétique de l'électron.

Quand l'électron traverse un milieu matériel, il perd progressivement son énergie cinétique au cours d'interactions avec les particules du milieu. Il termine sa trajectoire lorsque son énergie chute à un niveau correspondant à l'agitation thermique. Le ralentissement de l'électron s'opère par un très grand nombre de collisions avec un électron périphérique d'un atome, au cours desquelles il perd à chaque fois une petite quantité d'énergie.

Lors de chaque collision, l'électron incident communique une partie de son énergie cinétique à l'électron heurté. Lorsque l'énergie transférée atteint l'ordre de grandeur de l'énergie de liaison, l'électron heurté peut être déplacé vers une orbitale plus externe, la molécule subit alors une excitation ; soit extrait de l'atome par rupture de la liaison atome-électron, ce qui correspond à une ionisation de la molécule. Si l'énergie transférée ne suffit pas à déplacer

l'électron heurté, elle est transmise à l'atome ou à la molécule dont elle élève le niveau d'énergie (sous la forme d'énergie de rotation ou de VIbration moléculaire) ou sous forme de chaleur.

1.2. Les différents types de rayonnements

1.2.1. Les rayons X et y

Les rayonnements étudiés en radiobiologie sont de plus en plus nombreux, tant par leur nature que leur gamme d'énergie. Cependant, les rayonnements X et y restent les plus fréquemment utilisés. Les rayonnements y proviennent de la désintégration de corps radioactifs tandis que les rayons X sont obtenus au moyen d'accélérateurs d'électrons. Même s'ils sont produits par des phénomènes différents, les rayons X et y sont tous deux des radiations électromagnétiques qui à énergie égale, donnent lieu aux mêmes interactions.

Dans la partie expérimentale de ce travail, notre modèle d'irradiation utilise un rayonnement de type y émis par une source de 60CO. Les radio-isotopes émetteurs y représentent une source intéressante de radiations électromagnétiques, la qualité du rayonnement étant supérieure à celle des rayons X classiques. Le premier émetteur y dont on a disposé : le radium a été abandonné en raison de sa rareté et de son prix de revient. Il a été remplacé par des isotopes artificiels, essentiellement le cobalt 60 ('oCo) et le césium 137 (I37Cs) :

-le 60Co est produit par irradiation du 59CO naturel, dans un flux de neutrons thermiques.

59CO + ln _~ 60 Co + _y

- le I37Cs est un produit de fission des gros noyaux de combustibles (uranium ou plutonium). Il émet un rayonnement un peu moins énergétique que le 60Co.

137Cs

*

1.2.2. Les autres sources de rayonnement

~ les faisceaux d'électrons

Produits au moyen de générateurs électriques ou par des radio-isotopes émetteurs bêta, seuls les faisceaux d'électrons d'une énergie supérieure à quelques MeV ont un pouvoir de pénétration suffisant pour être utilisables.

~ l'accélération d'autres particules chargées

Sont principalement utilisés les protons, les particules alpha, certains "noyaux lourds"

tels 160, 12C, 14N ... Comme ^la pénétration des particules lourdes pour une énergie donnée est faible comparée à celle des électrons, ces particules devront être accélérées à des énergies très élevées pour présenter un intérêt pratique.

~ les neutrons

En tant que particules non chargées, les neutrons ne sont pas ionisants par eux-mêmes.

Ils provoquent des ionisations de façon indirecte en mettant en mouvement des particules ionisantes, essentiellement les protons. Comme ils ne sont pas arrêtés par des barrières de

potentie~ ils peuvent interagir avec les noyaux, même pour les neutrons lents.

1.3. Méthodes d'évaluation des rayonnements

1.3.1. Dosimétrie

Analyser les effets des radiations nécessite de définir la quantité d'énergie déposée dans un volume donné, donc un champ de radiation. Ce qui impose de connaître la distribution spectrale d'énergie des photons ou tout au moins leur énergie.

La dose absorbée en un point ou "dose" représente une densité d'énergie absorbée par la matière en ce point. Elle s'exprime en joules.kg-^J ou gray (Gy), unité S.I. Elle est encore souvent exprimée en rads, unité telle que 1 rad ⁼ 10-² Gy.

Le débit de dose caractérise l'énergie absorbée à un instant donné. Il est exprimé habituellement en gray par minute ou par heure.

Dans un champ de radiation donné, l'énergie transférée aux électrons secondaires est déterminée par le Kerma (Kinetic Energy Released in Material) et s'exprime en Gy ou Joules.kg-^I. D'une façon générale, l'énergie transférée (Kerma) n'est pas égale à l'énergie absorbée (ou déposée), du fait des pertes d'énergie au cours des différentes interactions.

L'énergie du faisceau transférée au milieu est évaluée en mesurant l'ionisation que ces particules provoquent dans un gaz, l'unité d'exposition étant le Roentgen.

1.3.2. Energie absorbée par le milieu - notion de Transfert d'Energie Linéaire Lors d'une irradiation par des photons, l'énergie n'est pas distribuée de façon uniforme le long de la trajectoire des électrons secondaires. Elle est cédée au milieu par paquets

correspondant à une ou plusieurs excitations ou ionisations, et séparés par des distances variables. Avec les rayonnements de haute énergie, les régions les plus superficielles peuvent être sous-dosées, car le flux des électrons secondaires n'a pas encore atteint sa valeur maximale.

La distribution spatiale de l'énergie le long de la trajectoire d'une particule ionisante s'exprime par la notion de Transfert Linéaire d'Energie (FEL). Le TEL représente l'énergie transférée à la matière par unité de longueur de la trajectoire de l'électron. Elle s'exprime en keV.j.l-I.

II. EFFETS SUR LA MATIERE VIVANTE

11.1. Effets directs et indirects des radiations

Les cellules vivantes contiennent une forte proportion d'eau. Leur exposition à des rayonnements ionisants se traduit par une cession d'énergie au milieu qui se distribue:

- aux composants de la cellule, qui sont soumis aux effets délétères "propres" du rayonnement.

On parlera d'effets directs des radiations.

- aux molécules d'eau du milieu, au cours de réactions groupées sous le terme de radiolyse de l'eau. Au cours de ce processus, les molécules d'eau sont transformées en entités instables très réactives, capables de modifier de façon irréversible les composés du milieu irradié. Cette action des rayonnements sur un composant cellulaire par l'intermédiaire d'un solvant détermine l'effet indirect des radiations. Les cellules contenant environ 70 % d'eau, l'effet indirect participerait pour plus de 80 % aux effets délétères engendrés par l'irradiation.

L'effet indirect débute par l'absorption des rayonnements par les molécules d'eau.

L'énergie cédée va servir à arracher des électrons périphériques aux molécules d'eau, pour créer des ions. La neutralisation de ces ions conduit à la formation de radicaux libres, c'est-à- dire de fragments moléculaires comportant un électron célibataire sur leur couche périphérique externe. La présence de cet électron non couplé confere généralement aux radicaux hbres une grande réactivité chimique. Afin de redevenir stables, les radicaux libres vont attaquer les

composés du milieu et être à l'origine de réactions d' oxydo-réduction qui sont amplifiées en présence de l'oxygène moléculaire.

Si l'énergie d'excitation transmise aux molécules d'eau est suffisante pour rompre une liaison, il Y a formation d'un radical hydrogène (H') et d'un radical hydroxyle rOH), entité chimique extrêmement réactive, à action très oxydante.

Mais dans la plupart des cas, l'énergie transférée va servir à créer un nombre important de paires d'ions (H20+, é) par arrachement d'un électron. Les ions H₂₀₊ et l'électron secondaire instables vont réagir avec d'autres molécules d'eau environnantes pour former respectivement le radical ·OH instable et très actif, et l'électron solvaté (éaq), de demi-vie plus longue que H20+

mais beaucoup moins mobile qu'un électron libre. Toutefois, éaq, pas très stable, finit souvent par provoquer la décomposition de la molécule d'eau à laquelle il est associé, surtout en milieu acide (figure 2).

Ainsi, les radicaux libres résultant de la radiolyse de l'eau instables vont principalement réagir avec des composés cibles du milieu. L'étendue des lésions sera fonction de la quantité de radicaux générés, c'est-à-dire de la dose de rayonnement absorbée par l'eau irradiée.

Voie majoritaire

RAYONNEMENT

r

Uniquement si énergie très élevée (rupture de la liaison covalente)

H₂0 ! ~

J:+:20C_l~ >-_JÛ_+_~. H~

⁺

très réactif H₃0+ +

stable

H- + H₂0 -O~. éaqueux .

très

réàètir··· ... .

... ~ (Molécules cibles du milieu) Figure 2 : Effets indirects des radiations ionisantes via la radiolyse de l'eau.

112. Facteurs influençant l'action des rayonnements ionisants

II.2.1. Rôle de l'OxYgène (O~

L'oxygène moléculaire présente une grande affinité électronique en raison du caractère très électronégatif de l'atome d'oxygène.

Au cours de la radiolyse de l'eau, O2 capte préférentiellement l'électron émis lors de l'ionisation d'une molécule d'eau, et cette réaction qui forme O_{2 .-}semble l'emporter sur presque toutes les autres (Greenstock 1981).

De même, lors de l'interaction entre les rayonnements et les composés organiques (RH), le radical organique R· formé après l'attaque par ·OH va réagir en priorité avec O2 pour former un radical peroxyle : ROO· (figure 3).

R· + O₂ -7 ROO· »» R·

+

ROO· relativement instable, peut commencer des réactions en chaîne avec des composés divers : ROO·

+

+

ROO· + RH -7 ROOR (peroxyde vrai) + ~

ROOH et ROOR relativement instables et capables de produire des oxydations, contribuent au développement des effets prolongés ou tardifs de l'irradiation.

RAYONNEMENT

r

Voie majoritaire

H20 ~ (H

20+ ; é) R-

+

+ ^O

~

))+ ^O

O

V

Formation de radicaux libres secondaires

ROOe

V

Réactions radicalaires en chaîne Figure 3 : L'oxygène, sensibilisateur puissant des effets de l'irradiation.

Composé organique

En définitive, l'oxygène joue un rôle essentiel en permettant la transformation d'un radical R· réducteur en un oxydant puissant. L'oxygène se comporte comme un radiosensibilisateur capable d'augmenter la sensibilité des cellules à l'irradiation d'un facteur 2.5 - 3 (Rojas & Denekamp 1989) pour les rayonnements de TEL faible. La principale cible

serait l'acide désoxyribonucléique (ADN) du noyau, en particulier lorsqu'il est étroitement

"associé" à la membrane nucléaire.

II.2.2. L'état redox du milieu cellulaire

Afin de maintenir un état dynamique ordonné, la cellule est dotée de systèmes redox intégrés finement ajustés. L'état redox:final détermine la viabilité et l'adaptabilité de la cellule à son environnement. La radiosensibilité de la cellule repose sur un équilibre approprié entre espèces réductrices et oxydantes (figure 4). Toute intervention qui déplace l'équilibre redox perturbera la réponse de la cellule aux rayonnements ionisants (Greenstock 1981 ; Rojas &

Denekamp 1989).

Equilibre redox de la cellule

Agents

\ réducteurs /

Agents

\ oxydants /

zs:

radiorésistanç-D,osensibilité

~ ~

(

J

J

'\ Réducteur/-,

\ Oxydants /

\ Rédl~:;mts /

. Â

rlldiOréSjstlln~osensibilité radiorésistanC~(}SellSibilité

Figure 4 Influence du statut redox sur la sensibilité des cellules aux radiations ionisantes.

Deux types d'approches permettent de modifier la radiosensibilité de la cellule:

- une voie exogène, en ajoutant directement des composés réducteurs ou oxydants dans le milieu. Si l'environnement cellulaire évolue vers un état redox plus réducteur (par apport de composés à groupement thiols -SH : glutathion, ou -NH2 : cystéamine ... ), la radiosensibilité cellulaire diminue. A l'inverse, un environnement plus oxydant (engendré par l'addition d'oxygène, de nitro-hétérocycles, ou de composés électrophiles) rend la cellule plus sensible à l'irradiation.

- une voie endogène, en perturbant les conditions physiologiques de fonctionnement de la cellule. De nombreux paramètres sont modulables : l'état métabolique de la cellule (par le jeûne, le déficit en oxygène, le stress, ... ), les conditions environnementales (le pH, la température, la concentration ionique du milieu, ... ), ou l'état de prolifération des cellules (selon la phase du cycle, ... ).

1/.3. Effets biologiques des rayonnements

II.3.1. au niveau du noyau: effets sur l'ADN

La molécule d'ADN, constituant fondamental du patrimoine héréditaire, représente la cible biologique préférentiellement affectée par les radiations. Les effets se traduisent par des perturbations structurales et fonctionnelles de l'ADN, qui engendrent des conséquences génétiques (mutations, aberrations chromosomiques ... ), et éventuellement la mort cellulaire .

.ç:.. Modification de la structure de l'ADN

L'ADN est altéré par effet cible, ou le plus souvent, par effet indirect via les radicaux libres (Van Hemmen & Meuling 1975 ; Nikjoo et a/1994). Les radiations ionisantes de TEL peu élevé tels les rayons y du 60Co, déterminent:

- des ruptures de chaîne. On distingue les ruptures simples qui portent sur un seul des 2 brins d'ADN. Les molécules d'eau rentrent dans la brèche, après rupture des liaisons hydrogènes entre les bases. La double hélice conserve sa structure d'origine, les segments des brins intacts servent, en un point, d'attelle au brin rompu. Si ces ruptures ne sont pas réparées, elles peuvent aboutir à la mort de la cellule. Les sections de la double hélice correspondent à des ruptures des 2 chaînes d'ADN distantes de moins de 3 nucléotides. Elles entraînent une cassure de la double hélice, lésion grave, qui fait suite à la rupture simultanée de 2 liaisons phosphodiesters homologues. Elles sont 10 fois moins fréquentes que les ruptures simples.

- des lésions des bases et des sucres (Singh & Singh 1982). Les bases sont soit détruites, soit modifiées après hydroxylation par les radicaux ·OH ou après formation d'hydroperoxydes en présence d'02. Les bases pyrimidiques (avec une double liaison en 4-5) s'avèrent plus radiosensibles que les bases puriques. L'oxygène exerce une action radiosensibilisatrice, en favorisant la production de radicaux très réactifs. Les lésions des sucres (ribose ou désoxyribose) sont mal connues. Les sucres sont oxydés puis hydrolysés, conduisant le plus souvent à la rupture d'une liaison phosphodiester. Plus rarement, l'attaque des sucres peut aboutir à la rupture d'une liaison base-sucre altéré. A la différence de ce qui est observé sur les bases, l'oxygène n'exerce pas d'action radiosensibilisatrice.

L'attaque des constituants élémentaires des acides nucléiques conduit à la perte progressive de la structure secondaire de l'ADN, et par suite à l'inhibition du transfert des caractères héréditaires. Trois modes d'altérations ont été identifiés:

- les dégradations: elles entraînent la rupture des deux brins polynucléotidiques et aboutissent à la fragmentation de la molécule d'ADN.

- les dénaturations: elles se caractérisent par la perte des liaisons hydrogènes entre bases complémentaires, suite à la rupture d'une liaison phosphodiester ou à la destruction de bases.

- les "crosslinking", où des tronçons de chaînes polynucléotidiques se soudent par des liaisons chimiques et deviennent inséparables.

~ Perturbation de l'activité de l'ADN

La plupart des étapes impliquées dans la réplication et la transcription de l'ADN constituent des cibles potentielles pour les rayonnements ionisants (figure 5). La réplication est cependant la plus radiosensible.

La réplication de l'ADN peut être entièrement bloquée, ou former un primer à séquence anormale qui va élaborer un ADN anormal. L'irradiation est capable d'inhiber l'activité primer de l'ADN, qui sert normalement de modèle pour la réplication. Pour des doses relativement faibles, elle ralentit considérablement la vitesse d'incorporation des désoxyribonucléosides triphosphates, et inactive l'ADN polymérase au cours des stades précoces de l'irradiation.

L'irradiation peut bloquer la transcription de l'ADN en acide ribonucléique (ARN) à différents stades. Dès les faibles doses, elle inhibe l'incorporation des nucléosides triphosphates de l'ADN primer, et perturbe l'activité des ARN messagers très radio sensibles, notamment l'acceptation des acides aminés par les ARN de transfert. En fonction de la dose utilisée, la perte d'activité des ARN de transfert s'accompagne ou non d'une altération de leur structure

secondaire. Lorsque les ahérations de la transcription portent sur l'ADN d'un gène régulateur ou opérateur, l'activité d'un cistron sera affectée, c'est-à-dire l'activité de plusieurs gènes structuraux produisant chacun l'ARN messager d'une protéine. Si l'atteinte se localise à l'ADN d'un gène de structure, elle se traduira par une erreur de séquence de nucléotides dans l'ARN messager transcrit et donc par une anomalie de synthèse d'une protéine qui peut éventuellement être de nature enzymatique.

ADN

'"

,-. ~nscrij7t~

@licatio~ ^{1 ,} ,,~

1 ','

1

,"

1

~utilisant

~

, , 1 ^,

l "

\

.

\ : !._-·----·ICZaduCtiOn~

1

1 ~

Rayonnement r 1

ADN ADN

Fonction Structure Protéines régulatrices Figure 5: Effets des radiations ionisantes sur certaines activités de l'ADN.

~ Altérations des chromosomes et mutations

Si une molécule d'ADN endommagée n'est pas ou mal réparée, elle est responsable d'une perte partielle ou complète de la séquence des bases: elle provoque une mutation.

L'irradiation ne fait pas apparaître de nouveaux types de mutations mais elle augmente leur fréquence de survenue, proportionnellement à la dose administrée (Savage 1989). Ainsi, l'altération de l'ADN de différents gènes augmente la probabilité d'apparition:

- des aberrations chromosomiques, qui correspondent à des ruptures de chromosomes et à un changement de structure,

- des chromosomes dicentriques, c'est-à-dire de chromosomes "doubles", qui sont soudés entre eux au niveau des zones de rupture générées après la perte d'un bras de chromosome,

- des délétions, qui représentent des pertes de fragments de chromosomes suite à une double rupture d'un bras de chromosome,

- des inversions, à savoir un changement d'ordre des fragments distaux qui se produit après une double rupture d'un bras de chromosome.

Lorsque les mutations surviennent dans des cellules somatiques chez l'adulte, elles restent muettes mais peuvent initier une cancérisation. Chez l'embryon, elles peuvent perturber l'organogénèse. Quand les mutations portent sur sur les cellules germinales (mutation génétique), elles sont transmises à la descendance. Elles sont généralement récessives, c'est-à- dire que leur expression nécessite la présence du même gène muté chez les 2 parents.

IT.3.2. au niveau des macromolécules: protéines et lipides

L'irradiation affecte d'autres macromolécules que l'ADN (Cantafora et aI1987). Plus la complexité des molécules du milieu augmente, plus les mécanismes d'attaque de ces molécules par les 3 entités principales issues de la radiolyse de l'eau (éaq, il, ·OH) deviennent compliqués et difficiles à établir. Les constituants cellulaires aliénés sont progressivement éliminés de l'organisme. Pour de fortes doses de radiations ionisantes, les systèmes d'épuration sont très sollicités. Le dépassement ou l'inactivation de ces systèmes, ou la persistance de dégâts trop conséquents peuvent faire évoluer la cellule vers la mort.

~ Les protéines

Si les acides aminés considérés isolément montrent des sensibilités différentes à ·OH, ils ont approximativement tous la même probabilité d'être altérés dans des organisations peptidiques de taille supérieure de type protéine.

Les protéines exhibent de nombreux points d'attaque potentiels (Kempner 1993) et les ruptures se font de manière aléatoire. La majorité des lésions sont provoquées par les produits de la radiolyse de l'eau (Simpson et al 1992). Les groupes sulfurés sont très sensibles aux radicaux libres, tout comme la liaison N - S dont la rupture est facilitée en présence d'oxygène.

L'irradiation d'édifices supramoléculaires n'aboutit pas forcément à la dissociation du complexe.

Ils peuvent maintenir leur organisation conformationnelle jusqu'à la survenue d'un stress.

L'étude des protéines enzymatiques et de leur fonctionnalité a montré qu'elles étaient sensibles à l'action des rayonnements ionisants aux doses classiquement utilisées en radiobiologie. L'irradiation peut stimuler l'activité et/ou la synthèse de certaines enzymes, telles

que les systèmes de réparation enzymatiques de l'ADN. D'autres enzymes ne sont pas affectées par les radiations, ou voient leur activité inhibée. Lors de ces atteintes, O2 peut exercer un rôle radiosensibilisateur.

~ Les lipides

Les rayonnements ionisants provoquent la dégradation des lipides, en particulier des acides gras polyinsaturés (AGPI) fragilisés par l'existence de doubles liaisons C-C au sein de leur structure. L'irradiation opère soit par un effet direct, soit le plus souvent par l'intermédiaire des produits de la radiolyse de l'eau en initiant un processus de réactions en chaîne de la peroxydation lipidique. Celle-ci se déroule en 3 étapes : l'initiation, la propagation et la terminaison (figure 6).

L'initiation de la peroxydation lipidique débute préférentiellement par l'attaque d'une double liaison d'un AGPI par le radical -OH. -OH arrache un atome d'hydrogène à la molécule lipidique (symbolisée par RH) pour générer un radical hbre lipidique R- et une molécule d'eau.

R - subit ensuite un réarrangement de ses doubles liaisons et forme en présence d'oxygène un radical peroxyle (ROO-).

Puis suit la phase de propagation où ROO- va attaquer une chaîne insaturée voisine (R2H). Il est transformé en un hydroperoxyde (ROOH) instable, mais peu réactionnel. Le nouveau radical lipidique R2 - généré va à son tour réagir avec l'oxygène pour former R200- qui peut alors recommencer un nouveau cycle. ROOH peut être converti, en présence de fer Fe2

+,

La terminaison de ces réactions en chaîne survient lorsque 2 radicaux libres interagissent entre eux pour former un produit non radicalaire. Elles sont également freinées par la rencontre d'un radical libre avec une molécule dite "piégeur" de radicaux libres telles les vitamines E et C. Les produits de dégradation résultant de la lipoperoxydation incluent des aldéhydes dont le malonedialdehyde (MDA) et d'autres composés carbonylés.

Les membranes cellulaires sont très sensibles aux effets de l'irradiation, et l'oxygène exerce une action sensibilisatrice puissante. Ce qui se traduit par une désorganisation importante de l'architecture des membranes cellulaires qui perdent leur souplesse et leur solidité. Sur le plan fonctionne~ ces variations de fluidité membranaire se répercutent par des modifications des fonctions de barrière et d'information : apparition de brèches ioniques, de troubles de la perméabilité ou des relations ligand-récepteur, ...

Rayonnement 'Y

~ ~

. .: ...

._0"

voie -:' minoritai~e-"'"

... ..

..

Z':'.

RH

/ V V \

Lipide (AGPI)

(-OH, é. H20+)

}o,~

.'

-OH. O

•

via:2

2 -OH

' ..

'>...

déshydrogénation

/.V V \

0-0·

l

/ \ N

/ \ N _~

Radical peroxy (ROO-)

O

/ " M

o-OH

/ \ N \

peroxyde cyclique hydroperoxyde (ROOH)

+ •

~ r

^{~[RaH 1}

+0²

R200H~

hydrolyse ou chaleur

R₃00· • )

~

(~H)LR300H

+ +02

~

~ ~OO-

-

RnOO

o ) +

0 -

Malonedialdéhyde (MDA)

aldéhydes, ou~

dérivés divers, alcanes,

~OORn + O2

Figure 6 Schéma représentant les principales étapes de la peroxydation lipidique, initiée par l'action des rayonnements ionisants.

1 N 1 T

1 A T 1

o

N

P R

o

P A G A T 1

o

N

T E R M 1 N A 1 S

o

N

II.3.3. Au niveau du cycle cellulaire.

Le cycle de reproduction d'une cellule eucaryote est classiquement divisé en 4 phases G\, S, G2 et M (figure 7a). G1 est la phase de préparation à un cycle: si l'ADN a été lésé, les systèmes de réparation deviennent opérationnels. Sinon, la cellule fonctionne normalement en synthétisant de l'ARN et des protéines. Pendant la phase S, caractérisée par la synthèse de l'ADN, la cellule double la quantité d'ADN contenue dans son noyau. G2 est une phase de latence où la taille des cellules augmente, jusqu'à la survenue de la mitose M, qui aboutit à la formation de deux cellules filles. Lorsque la durée de la phase G1 est très longue, les cellules semblent avoir cessé de progresser dans le cycle de division et s'être installées dans un état de quiescence appelé Go. Les passages en phase S et M du cycle cellulaire sont signalés par l'activation de facteurs cytoplasmiques : l'activateur de la phase S et le facteur promoteur de la phase M (FPM). Ces complexes se composent de protéines kinases de la famille des p34^cdC2 liées à des protéines de la famille des cyclines (figure 7b).

( Entrée en Mitose)

t ^~

G

G

Dégradation de

Phosphate

-r-

. . . Fin de

dq~

^(omose:

~-\o ~?:G'

Cycline mitotique ~

8

Phase de synthèse de l'ADN

~

Activateur de la phase S

f

( Réplication de l'ADN (phase S) )

Figure 7 : Schéma emprunté à Coleman (1993) représentant a) les 4 phases du cycle cellulaire, et h) les facteurs d'activation cytoplasmiques mis en jeu dans la progression du cycle.

La sensibilité des cellules à l'irradiation dépend de l'étape du cycle cellulaire dans laquelle elles se trouvent. L'ADN des cellules en phase de prolifération est plus sensible que l'ADN des cellules au repos, où il est lié aux histones et intégré dans une structure particulaire contenant des protéines: la chromatine, agissant comme une barrière de protection vis-à-vis des effets des radiations (Coleman 1993 ; Hagen 1989).

D'une manière générale, les cellules en mitose M sont les plus radiosensibles, alors que celles qui n'ont pas commencé la synthèse d'ADN (stade GI ) le sont moins. Les cellules qui sont en fin de synthèse d'ADN (phase S tardive, et dans une moindre mesure G2) sont les plus radio résistantes. Les causes de ces variations de radiosensibilité ne sont pas entièrement élucidées. Cependant, la diminution transitoire de l'aptitude à réparer les radiolésions semblerait en partie responsable de ces variations.

Ainsi, l'irradiation retarde la mitose, et interfère dans la progression des cellules en phase S vers G2, et de G2 vers la mitose M, probablement en agissant sur les complexes enzyme-protéine non enzymatique. Le retard de progression 'les cellules en phase S vers G2 est caractéristique des fortes doses de radiation (> 5 Gy). Il résulterait d'un ralentissement de la synthèse de l'ADN, au cours de laquelle interviendrait une protéine kinase. Le blocage transitoire des cellules en phase G2 vers la mitose M se produit dès les faibles doses de radiations. Selon les types cellulaires, ce blocage résulte soit de l'inhibition de la cycline BI, soit de perturbations des étapes de phosphorylation des protéines kinases p34cdc2

. Mais dans les deux cas, l'effet final se traduit par l'inactivation du FPM, empêchant l'entrée en mitose. Si l'arrêt en G2 permet aux cellules de réparer les lésions de l'ADN, alors la durée du blocage est déterminante pour la viabilité cellulaire. Plus l'arrêt en G2 est court, plus la survie cellulaire diminue (Coleman 1993 ; Maity et 0/1994).

Par contre, l'irradiation a peu d'effet sur la progression du cycle de la phase GI vers S et de M vers GI . Dans un nombre restreint de lignées cellulaires, l'irradiation est capable de bloquer les cellules en phase GJ, à condition que le gène suppresseur de tumeur p53 sauvage soit présent. Le gène gadd45 jouerait aussi un rôle dans ce blocage transitoire (Maity et al 1994).

II.3.4. au niveau des voies de transduction et expression génique.

En réponse à l'irradiation, l'expression de différentes familles de gènes et certaines voies de signalisation sont activées ou inhibées (Coleman 1993 - tableau 1).

Tableau 1 : Voies de signalisation activées et gènes induits par l'irradiation (d'après Coleman 1993).

Récepteurs ou senseurs

•

? : signal inconnu tyrosine kinase nucléaire: lésions de l'ADN PKC

cytoplasmique NFKB ou 1 Raf-l kinase modifications de protéines (ser/thr) membranaire : récepteur des GF, 1 MAP Kinase peroxyde lipidique, ou flux ionique

c-fos c-jun EGR-I NFKB

autres réponses au stress:

gènes Gadd

gènes à

..

TGFr3 ILl bFGF

Abréviations: GF = growth factor; MAP = mitogen activated protein; EGR-l = early growth response -1; NFKB = nuclear factor-KB; TNF = , tumor necrosis factor; TGFI3 = transforming growth factor

13;

=

~ Voies de transduction induites par l'irradiation

L'irradiation active la protéine kinase C (PKC) , la tyrosine kinase, et la MAP kinase (enzyme qui active directement les gènes à réponse précoce dans le noyau). Différentes voies de transduction transmettent les signaux de la surface cellulaire ou du cytoplasme vers le noyau. Mais les signaux initiateurs de la réponse restent hypothétiques : il peut s'agir d'un signal d'origine nucléaire émis par l'ADN endommagé, ou d'un facteur cytoplasmique de type NFKB activé indirectement par les intermédiaires réactifs de l'oxygène formés au cours de l'irradiation, ou d'un facteur de nature membranaire sensible à la peroxydation lipidique.

~ Gènes induits par ['irradiation

L'irradiation active l'expression de gènes à réponses précoce et tardive (tableau 1), alors que d'autres sont inactivés, tels ceux régulant le cycle cellulaire. La réponse au signal de l'irradiation varie avec la dose reçue. Différents gènes à réponse précoce ont été identifiés, exemple: API (Activator Protein 1) avec fos et jun, EGRl, NFKB. Ils vont activer d'autres gènes à réponse tardive qui sont des effecteurs importants, susceptibles d'induire une altération

du phénotype cellulaire après irradiation. Parmi eux, se trouvent le TNF, le bFGF et le TGF~

probablement impliqué dans l'apparition de la fibrose pulmonaire post-radique.

11.3.5. irradiation et apoptose . .ç.. Introduction

Selon les cellules réceptrices et les doses reçues, l'exposition aux rayonnements ionisants est susceptible de conduire les cellules vers la mort, soit par la voie de l'apoptose soit par nécrose. Ces deux processus se caractérisent par des modifications morphologiques et moléculaires distinctes (Bromme & Holtz 1996 - tableau 2).

Tableau 2 : Caractéristiques morphologiques et moléculaires distinctives de l'apoptose et de la nécrose.

Caractéristiques nécrose apoptose

processus dégénératif dû à un Processus actif énergie-dépendant définition stimuli nocif: et qui concerne d'autodestruction cellulaire, nécessitant

des groupes de cellules. une expression génique de nova et qui concerne des cellules seules.

mitochondrie défectueuses; déplétion en ATP fonctionnellement intactes perte de l'intégrité membranaire Globalement intacte

membrane plasmique augmentation de la perméabilité formation de bourgeonnements et de à certains ions, surtout Ca²+. corps apoptotiques.

noyau condensé

ADN clivé en fragments de 50 à 300 fragmentation de dégénérescence aléatoire de la kilo de paires de bases ou 180/200

l'ADN chromatine paires de bases.

réduit (rétracté), perte du contact de la volume cellulaire augmenté (gonflement) membrane avec les cellules voisines,

disparition des jonctions serrées.

libéré, lyse des cellules ; phagocyté par les cellules voisines réponse inflammatoire due à la intactes, principalement sous forme de contenu libération de composés corps apoptotiques ;

intracellulaire intracellulaires ; pas de réponse inflammatoire;

71 des transaminases sériques. pas d'71 des transaminases sériques.

~-~ - _ ^{... _ - - - - ~~ ~ .. - - - _ .. _ - - - - - - - - - - - - -}

L'apoptose joue un rôle majeur dans le développement, le "remodeling" tissulaire et dans certaines pathologies telle que l'irradiation. C'est un mécanisme de défense indispensable qui permet d'éliminer les cellules portant des lésions majeures de l'ADN, et qu~ si elles avaient survécu, auraient été porteuses de mutations "tumorigènes".

-?-Apoptose due aux rayonnements ionisants

L'ADN endommagé par les rayonnements ionisants pourrait représenter le facteur déclenchant de l'apoptose. Toutefois, les réponses tissulaires induites par l'irradiation y sont très hétérogènes. La sensibilité des cellules à l'apoptose induite par les radiations dépendra étroitement de l'état de maturation des cellules, et de leur statut fonctionnel. De nombreux paramètres sont à prendre en compte:

- le type de cellules : normales ou tumorales, et leurs caractéristiques intrinsèques, - la phase du cycle cellulaire dans laquelle la cellule se trouve,

- l'intensité des lésions : l'apoptose surviendrait préférentiellement pour les faIbles doses, et les processus nécrotiques prédomineraient pour les fortes doses de radiations,

- la présence ou non de gènes mutés impliqués dans l'apoptose,

-les voies de transduction du signal impliquées dans l'initiation de l'apoptose.

-?-Modifications biochimiques caractéristiques de l'apoptose

L'apoptose se caractérise par l'activation précoce d'une endonucléase Ca ++ - et Mg ++ -

dépendantes, qui clive l'ADN en fragments d'environs 180 paires de bases, au cours des premières heures qui suivent l'irradiation. L'activation pourrait dépendre soit d'une synthèse protéique de novo, soit du clivage protéolytique d'une pro-enzyme, ou alors provenir de la suppression d'un signal inhibiteur non identifié. L'endonucléase présente sous forme latente poly(ADP-ribosylée) serait activée par l'altération de l'ADN.

La chaîne d'événement présumés peut être ainsi schématisée :

Irradiation ^~ ? • influx Ca ++ ., activation endonucléase

t

fragmentation de l'ADN avec mort cellulaire

-?-Voies de signalisation impliquées dans l'apoptose induite par l'irradiation

Elles ont été en partie identifiées à partir d'études avec des facteurs de croissance, et des inhibiteurs de la protéine kinase C (PKC) qui modifient la réponse des cellules à l'apoptose radio-induite (SzumieI1994).

De façon générale, les facteurs de croissance qui agissent comme des mitogènes sur un système cellulaire donné ne modifient pas la sensibilité. Alors que ceux qui ont une activité inhIbitrice ou qui sont sans effet sur la croissance, se comportent comme des radiosensibilisateurs.

Dans le cadre des études avec les inhibiteurs de la PKC, 2 situations se présentent en fonction du type cellulaire considéré. Si le signal médié par la PKC active normalement un groupe de gènes dont les effets conduisent à la récupération cellulaire par la synthèse de protéines gadd et XIP (X-ray induced protein), les inhibiteurs de la PKC agiront comme des sensibilisateurs. Si le signal médié par la PKC active des gènes qui ouvrent les voies de l'apoptose, les inhibiteurs de la PKC auront des effets protecteurs.

Par ailleurs, l'apoptose induite par l'irradiation peut être neutralisée par le trolox, un analogue hydrosoluble de la vitamine E. Le trolox empêcherait la survenue de lésions membranaires, inhibant ainsi l'influx cytosolique d'ions calciques. Ces résultats soulignent l'importance de la membrane cellulaire en tant que cible sensible à l'apoptose. Il est possible également d'envisager sous l'effet du trolox une modification de l'équilibre redox intracellulaire qui joue un rôle majeur dans l'activation de certains facteurs tel que le NF-KB.

~ Gènes suppresseurs de tumeurs et réponse à l'irradiation

L'aptitude des cellules à entrer en apoptose après irradiation est en partie sous contrôle génique.

Certains oncogènes confèrent une sensibilité à l'irradiation. Un des plus importants, le gène suppresseur de tumeur p53 est nécessaire à l'apoptose dans différents types cellulaires.

L'irradiation y induit l'expression de p53 en réponse aux cassures doubles brins de l'ADN. Des taux intracellulaires élevés de la protéine p53 provoquent l'arrêt du cycle cellulaire en G1• Ce blocage transitoire en G1 permettrait aux cellules de réparer les lésions critiques de l'ADN avant le déroulement de la réplication, et éviterait ainsi la propagation des lésions génétiques.

Si les atteintes sont trop sévères, p53 peut orienter la cellule vers la mort par apoptose (Pellegata et al 1996 ; Hale et al 1996). P53 sauvage, couramment décrit comme le "gardien du génôme", a donc pour fonction principale de préserver l'intégrité du génome. Des études récentes (Pellegata et al 1996) ont montré que p53 pouvait également contrôler l'arrêt du cycle à la phase G2 dans certaines lignées cellulaires. Si ces résultats se confirmaient, p53 pourrait