MATERIEL ET METHODES
R- R-radical libre
3. Production d'oxyde nitrique -NO
.9 .-;:
J j
.:=
=
-60
40
20
*
~ SINlàpH6
-v- SIN 1 àpH7 _ - SIN 1 à pH 7.4
O •• ~----~---r----~---'---~---r---~----~
o
1 2 3 4 5 6SIN 1 (mM)
Figure 26: Piégeage du radical hydroxyle par le SIN 1 à pH 6, 7 et 7.4.
*
p<O.05,**
p<O.Ol,***
p<O.OOl.3. Production d'oxyde nitrique -NO
7 8
L'addition d'une solution aqueuse de ~O à une solution contenant le complexe Fe2+_
MGD à pH 7.4 produit un spectre RPE à 3 raies correspondant au complexe [(MGD)2-Fe2 +-NO] (Komarov et a/1993 ; Obolenskaya et a/1994 ; Zweier et a/1995). Il se caractérise par une valeur de g
=
2.04 et une structure hyperfine avec une constante de couplage de 13.5 G.L'apparition du spin-adduct dérivé de ~O a été étudiée après addition de la solution de spm trap au milieu contenant le NPS, le NaN02, la MLS et le SIN 1 (figure 27).
L'incorporation de NPS à la concentration de 80 ~M à la solution de Fe2+-MGD produit un spin-adduct stable très net. L'adduit [(MGD)2-Fe2+-NO] est également observé en présence de NaN02 mais l'intensité du signal à 1 min est 5 fois plus faible. Elle a tendance à augmenter avec la prolongation de la période d'incubation. Ce signal est aussi retrouvé en présence de SIN 1 ; l'intensité du complexe est comparable à celle obtenue avec NaN02. Par contre, la
MLS à 2 mM ne montre pas dans nos conditions expérimentales une production détectable de
~O.
A
B
c
3340 3360 3380 3400 3420 3440 3460
[G]
Figure 27 : Spectres RPE montrant la production de -NO. Les spectres du spin-adduct [(MGD)1-Fe1+-NO] sont obtenus quand le spin trap Fe1+-MGD est additionné de A) une solution aqueuse contenant -NO, D) le NPS à la concentration de 80 p.M, et C) le SIN 1 à la concentration de 2 mM.
DISCUSSION
1
Notre étude avait pour but d'apprécier les interactions susceptibles d'exister entre les espèces radicalaires oxygénées O2.- et ·OH avec un autre radical libre le ~O, et ceci à différents pH. Des molécules "donneuses" de ~O ont été utilisées comme source potentielle de ce radical. Dans nos conditions expérimentales, les composés donneurs de ~O présentent des propriétés piégeur de O2''' qui ne sont pas identiques pour tous les composés testés. Elles dépendent de la valeur du pH du milieu, de leur structure chimique, et de leur mécanisme de libération de ~O. Nous avons mesuré les concentrations de ~O libéré dans le milieu d'incubation par la teclmique RPE de spin-trapping basée sur la réaction du Fe2+-MGD avec
~O qui produit un spin-adduct stable. Dans nos conditions expérimentales in vitro, la production de ~O a été détectée en présence de NPS, NaN02, et SIN 1 ; en revanche, la MLS ne libère pas de quantité détectable de ~O.
Le NPS présente les propriétés piégeurs de
°
6-- les plus puissantes, avec des ICso de l'ordre du J.1M. Ce sel inorganique complexe, rapidement inactivé in vivo (Wilcox et al 1990), libère spontanément ~O en solution aqueuse à pH neutre (Kreye 1980 et 1984 ; Ignarro et al 1980 et 1981) vraisemblablement par un mécanisme de décomposition par réduction. Dans notre étude in vitro, le NPS libérerait ~O sous l'influence de la lumière, qui ensuite réagirait avec O2--. La présence de la forme réduite "tétra" du NPS (Kruszyna et al 1993) démontre bien l'existence d'un clivage de la molécule avec libération de la partie ~O. Ces données sont confirmées par la détection d'un spectre [(MGD)2-Fe2+-NO] de forte intensité. Les interactions O2--INPS dépendent étroitement du pH du milieu, l'effet piégeur de O2-- augmentant au pH le plus acide. Ainsi, la formation d'anions ONOO-in vivo, résultant de cette interaction, pourrait être responsable de la survenue des effets délétères rencontrés dans des situations physiopathologiques : au cours de l'ischémie, qui se caractérise par des perturbations importantes du pH (Garlick et al 1979) ; ou lors de l'exposition aux radiations ionisantes où laradiosensibilité cellulaire est sous la dépendance de l'état métabolique et énergétique de la cellule (Wood et al 1993).
A pH 7.4, la petite molécule hydrosoluble NaNO~ n'exerce pas d'effet piégeur de O2''', alors qu'elle piège O2.- à pH 6. A pH acide, la présence de
Ir
dans le milieu favorise la formation d'acide nitreux (HONO) puis de ~O (Ignarro et al 1981), qui peut ensuite réagir avec O2 .... Il existe donc une relation entre la capacité de NaN02 à hbérer ~O et ses effets piégeurs de 0/-, le pH du milieu jouant un rôle déterminant dans la faisabilité de l'interaction O2''' / ~O (Feelisch 1991 ; Johnson et al 1991).Le SIN 1 et les autres sydnonimines forment des solutions aqueuses instables, qui libèrent spontanément ~O (Feelisch et al 1989 ; Noack & Feelisch 1989) de manière non linéaire. Deux facteurs essentiels déterminent l'instabilité des solutions de SIN 1 : la teneur en oxygène et le pH de la solution (Wang et al 1994 ; Wilcox et al 1990 ; Bohn & Schônafinger 1989). Les solutions sont stables à pH acide (Foucher-Lavergne et al 1993), et se décomposent spontanément à pH neutre, étape indispensable à la libération de ~O in vivo. A pH physiologique, la dégradation immédiate du SIN 1 conduit à la formation stoechiométrique de O2-- et ~O (Hogg et al 1992 ; Feelisch et al 1989). Mais, de façon surprenante, nous n'avons pas détecté d'interaction entre le SIN 1 et le système générateur de O2.-. Dans notre modèle in vitro simple, à base de tampon phosphate, la libération de ~O à partir du SIN 1 ne constitue pas un processus immédiat. Une période d'incubation d'au moins 5 minutes est nécessaire à la libération de ~O par le SIN 1. Le seul délai d'enregistrement des spectres de 1 minute ne suffit pas pour détecter un effet piégeur de O2''' par le SIN 1. D'autre part, la sensibilité de notre test pourrait être sous-estimée, si l'on tient compte de la production simultanée de O2.-et de ~O à partir du SIN 1. Les essais menés en présence de GSH (10 J.lM) devaient déterminer si le ~O agissait de façon directe, ou s'il devait se lier à des composés thiols pour exercer ses effets. Dans nos conditions expérimentales, la quantité de ~O libérée à partir du SIN 1 est négligeable. Toutefois, après une incubation de 10 min, le SIN 1 montre des effets piégeurs de O2''' qui sont significatifs. Il est donc capable de diffuser, au moins partiellement, dans le milieu (Huie & Padmaja 1993) pour exercer ses actions sans nécessiter l'intervention de transporteurs de type thiols.
Dans notre système in vitro, la molsidomine ne réagit pas avec O2''' quels que soit le pH du milieu et la concentration étudiée. Ce résultat conforte l'idée selon laquelle la capacité des donneurs de ~O à interagir avec O2 •• découle de leur aptitude à libérer ~O dans le milieu réactionnel. In vitro, sans hydrolyse enzymatique possible, la MLS est incapable de libérer ~O
; ce qui est confirmé par notre impossibilité à obtenir des spectres RPE en présence de Fe2+_
MGD.
L'interaction des donneurs de ~O avec ·OH n'est pas ou peu spécifique. Tous les composés, qu'ils soient aptes ou non à libérer ~O dans notre test, montrent des effets piégeurs d'·OH. Ces résultats mettent en évidence le pouvoir puissant de ·OH à réagir avec une large gamme de molécules. Toutefois, dans nos conditions, l'efficacité du piégeage d'·OH par le NPS, le NaN02 et le SIN 1 est similaire à celle observée avec O2 .... Le NPS exprime les propriétés piégeurs d'·OH les plus marquées, mais l'effet du pH est nettement atténué. Dans l'ordre décroissant d'activité, vient ensuite le NaN02, dont l'effet piégeur d'·OH est toujours maximum à pH 6 (avec une ICso 2fois plus faible qu'à pH 7 et 7.4). La capacité de la MLS à piéger ·OH est indépendante du pH et de son mécanisme de libération du ~O. Au même titre que la MLS, le SIN 1 ne se comporte pas comme un piégeur d'·OH très sensible, avec une ICso
égale à 3.4 mM à pH 7.4, et qui atteint pratiquement 6 mM à pH 6.
Finalement, on peut admettre que les interactions entre Oé, ... ou ·OH et les donneurs de
~O dépendent du mode de libération de ~O par ces molécules, et en partie du pH du milieu.
Malgré la faible réactivité chimique de O2''' (Sawyer & Valentine 1981 ; Koppenol 1988 ; Butler et al 1995), les donneurs de ~O sont en mesure de réagir avec O2''', suggérant une relation "privilégiée" entre ces deux radicaux. Dans les conditions physiologiques, l'interaction
O2 •• / ~O jouerait un rôle régulateur important dans plusieurs fonctions biologiques telles que
la vasomotricité, les réactions inflammatoires et immunologiques, la transmission synaptique.
Au contraire, en pathologie, cette interaction pourrait conduire à l'installation d'effets délétères, via la production des peroxynitrites (Radi et al 1991a, 1991b et 1994). L'exposition aux radiations, l'ischémie, le stress oxydatif, les modifications de l'équilibre redox et / ou de l'environnement cellulaire sont des conditions susceptibles de modifier la valeur du pH, les
concentrations respectives de O2-' et de ~O, et donc l'interaction O2-' / ~O. A pH acide, les peroxynitrites résultants (Beckman et al 1990 ; Beckman 1991) sont proto nés en acide peroxynitreux ONOOH, qui se décompose spontanément à pH 7.4 (Beckman et al 1990 ; Saran et al 1990) en produits finaux cytotoxiques (Augusto et al 1994 ; Kooy et al 1994). Les substances capables de modifier et / ou d'altérer l'état redox cellulaire, et ainsi la formation de
~O à partir de précurseurs endogènes ou exogènes, présenteraient un intérêt majeur dans la détermination de la réponse biologique aux atteintes tissulaires et cellulaires. En modulant la libération de ~O par un donneur de ~O : le complexe DE~O ou un inhibiteur des ~O
synthases : la LNA, il est possible de protéger des souris contre les effets d'une irradiation y totale (Liebmann et al 1994). Bien qu'ils exercent leurs effets radioprotecteurs par des mécanismes différents, les modulateurs de ~O diminuent le débit sanguin au niveau de la moelle osseuse, affectant les teneurs de la moelle osseuse en oxygène. L'hypoxie engendrée rend les cellules moins sensibles aux effets délétères de l'irradiation. Par ailleurs, dans les cellules endothéliales, cibles privilégiées des rayonnements ionisants, l'anion ONOO', essentiellement formé à partir de la réaction de O2''' avec ~O, agirait comme un oxydant puissant. Dans les conditions physiologiques, environs 20 % des anions ONOO' sont protonés (Koppenol et al 1992 ; Pryor & Squadrito 1995). L'augmentation cellulaire de la production de O2''' et ~O provoquée par un médiateur de l'inflammation peut conduire à la formation de ONOO', et justifie les effets protecteurs des superoxydes dismutases sur les lésions des cellules endothéliales vasculaires induites par les radicaux libres.
La synthèse de nos résultats expérimentaux présentés figure 28 soulignent l'importance des interactions entre les radicaux libres oxygénés en physiopathologie. L'irradiation y induit des ruptures des brins de l'ADN principalement par l'action de -OH. Ces lésions de l'ADN activent un facteur de transcription nucléaire: le NFKB qui fait parti du gène promoteur codant les ~O synthases inductibles. Elles stimulent l'expression des ~O synthases inductibles et la production de ~O ; ce qui se traduit in vitro par une augmentation de l'activité cytolytique des macrophages (lbuki & Goto 1997). Les conditions redox, facteur déterminant de la survie cellulaire, influencent de façon critique les effets des composés endogènes ou exogènes porteurs du groupement ~O. Mitchell et al (1993) ont montré que l'utilisation du ~O gazeux et sous la forme complexée DE~O administrée en solution, est susceptible de sensibiliser
les cellules hypoxiques aux effets des radiations. Ces résultats, couplés à l'action vasodilatatrice de ~O sur la vasculature tumorale (qui favorise l'oxygénation de la tumeur et augmente sa radiosensibilité), s'avèrent prometteurs en cancérologie.
En conclusion, les actions de ~O seront déterminées principalement par 1) la nature du composé contenant -NO, à savoir sa structure chimique et son mécanisme de libération de NO·, et 2) l'état de la cellule, c'est-à-dire son pH, son caractère ionique, et la présence ou non de protéines ou d'autres molécules susceptibles d'interagir avec le ~O. En agissant sur l'une ou l'autre de ces composantes, l'irradiation pourrait favoriser l'interaction O2.- / ~O, et par la même moduler les niveaux des atteintes toxiques au niveau cellulaire.
if
Interaction combinée de -NO et O2-. fortement envisageable
in vivo
if
Interaction spécifique semblant dépendre de la capacité des substances
à
libérer -NO dans le milieu réactionnell/lfensilé A++++ ++++ +++
~---~~---~
++ + 0 0 + 0 "df! l'interaction
Intensité :le "interaction
libère "NO à pH acide uniquement
quelques minutes
~ieurs minutes in vitlJ!.
INTERACTIONS DES ESPECES RADICALAlRES IN VITRO
NPS NaN02 SIN 1 Molsidomine
·01-1 ·OH ·OH ·011
pH 6. 7
Interaction peu specifique et indépendante de la capacité des substances
à
libérer -NO.(J.
Probablement pas de rôle majeur
in vivo.
~.
J;-l
~~~
~-=
1
~_.
r