~ Evolution des systèmes de défense ulltioxydallts
4. Dosages biochimiques
4.1. Préparation des échantillons
Les animaux des groupes Témoins (13 rats) et l"adiés (15 rats) sont anesthésiés à l'éther. Le sang est prélevé par l'aorte abdominale (en présence de quelques gouttes d'héparine). Après centrifugation à +4°C, le plasma est prélevé, fractionné, et stocké à -70°C.
Le culot globulaire est transféré dans des tubes plastiques fins, et conservé à -70°C.
Le coeur est rapidement excisé de l'animal, qui repose sur une plaque réfrigérée. Il est rincé dans une solution de chlorure de potassium (KCl) à 1.15 % refroidie à O°C, afin de bloquer tout processus enzymatique. Il est débarassé des oreillettes, puis plongé dans l'azote liquide avant d'être stocké à -70°C. Au moment des dosage, le coeur est décongelé, pesé et découpé à O°C. Puis il est broyé à l'ultra-turrax et homogénéisé au Potter toujours à O°C.
L'homogénat cardiaque est réalisé au 1/5 (PoidsNolume), soit dans un tampon phosphate 50 mM à pH 7.8 contenant de l'EDTA (0.1 mM) pour les dosages de lipoperoxydation, des vitamines et des protéines totales, soit dans du sucrose 0.25 M pour les dosages enzymatiques.
Les homogénats cardiaques préparés dans le sucrose sont centrifugés 10 minutes à 6500 g et +4 oC, et seul le surnageant est aliquoté pour les dosages. Les homogénats (préparés dans le tampon phosphate) et surnageants sont conservés à-70°C. Au moment des dosages enzymatiques, tous les échantillons sont décongelés extemporanément.
4.2. Mesure de différents index de peroxydation lipidique
~Principe
Le malonedialdéhyde (MDA) constitue un des pnnClpaux produits résultant de l'oxydation des acides gras polyinsaturés. Sa détermination sert de marqueur de la lipoperoxydation au sein d'un fluide ou d'un tissu. Son dosage est basé sur sa réaction avec l'acide thiobarbiturique (TBA) (figure 30).
° ° rîn
HS'tNrOH
Ir
•S~yOH
+ 2
N~
1~ chauffage N~~
OH OH OH
MDA TBA Chromogène rose
Figure 30 : Principe de dosage du malonedialdéhyde.
En milieu acide, après chauffage, une molécule de MDA se condense avec 2 molécules de TBA pour former un chromogène rose (Sinnhuber & Yu 1957). La formation du complexe est évaluée en spectrofluorescence.
Dans les systèmes biologiques, d'autres substrats peuvent réagir avec le TBA. Il est donc préférable de parler du dosage des substances réagissant avec l'acide thiobarbiturique (SRTBA) plutôt que du dosage du MDA (Barrington et a/1993).
-?-Dosage des SRTBA
Les dosages sont réalisés dans un tampon phosphate 50 mM, à pH 7. L'échantillon de plasma ou d'homogénat cardiaque (au 1/5) est mis en présence du réactif : acide trichloracétique (TCA) + TBA + acide chlorhydrique (13.5 % plv - 0.33 % plv - 0.85 N) préparé extemporanément. Après désoxygénation, les tubes sont incubés 15 minutes à 100°C.
Ils sont ensuite refroidis dans un bain d'eau glacée et additionnés de TCA à 70 %, afin de précipiter les protéines. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, les tubes sont centrifugés et le dosage est réalisé sur le surnageant. La quantité de SRTBA est déterminée par spectrofluorimétrie (Kontron SFM 125) en mesurant l'intensité du chromogène rose formé aux longueurs d'onde d'excitation Â.
=
515 nm, et d'émission Â.=
553 nm.La concentration de SRTBA plasmatique est exprimée en nanomole de MDA par millilitre (nmol MDA.ml-1), et la concentration cardiaque en nanomoles par gramme de tissu frais (nmol MDA.g-l).
-?-Evaluation du pouvoir antilipoperoxydant du plasma
Cette technique, dérivée de la méthode de dosage des SRTBA, est réalisée sur des homogénats de cerveaux de rats que l'on soumet à une peroxydation spontanée ou induite.
L 'homogénat cérébral de rat, riche en lipides, peroxyde spontanément après incubation à 37°C pendant 30 minutes. Ce taux de peroxydation est comparé à celui obtenu après addition d'un volume déterminé de plasma et incubation dans les mêmes conditions. Le plasma, de par ses propriétés antioxydantes, limite le développement de la lipoperoxydation de l'homogénat cérébral. Un pouvoir antilipoperoxydant du plasma peut être ainsi évalué.
Sur le plan expérimental, des rats sont anesthésiés puis sacrifiés par décapitation. Le cerveau est immédiatement prélevé et débarassé de ses méninges à QOC. Les cerveaux sont découpés en morceaux et homogénéisés aux ultrasons dans du tampon phosphate 50 mM pH 7 (1/10, PN) à QOC. Des prises d'essai d'homogénats cérébraux sont incubées 30 minutes à
37°C en présence de l'échantillon de plasma seul (pouvoir antilipoperoxydant spontané) ou additionné d'un système générateur de radicaux libres vitamine C - fer (250 IlM-lO J,lM) (pouvoir antilipoperoxydant induit). A la fin de la période d'incubation, un aliquot est prélevé pour réaliser la détermination des SRTBA, décrite au paragraphe précédent.
Le pouvoir antilipoperoxydant spontané et induit du plasma est exprimé en pourcentage d'inhibition de la peroxydation "contrôle", obtenue en l'absence de plasma.
-9-Evaluation de la peroxydation cardiaque
L'homogénat cardiaque est incubé pendant 30 minutes à 37°C en l'absence (peroxydation spontanée) ou en présence (peroxydation induite) d'un système générateur de radicaux libres. La production de radicaux libres est assurée par le système enzymatique xanthine (2.5 mM) - xanthine oxydase (0.6 UI.ml-1) en présence de fer (Fe)-EDTA 00 IlM- 20 J,lM). Après incubation, une prise d'essai est prélevée du milieu pour le dosage des SRffiA.
4.3. Evaluation du pouvoir antioxydant du plasma par RPE -9-Principe
Ce test consiste à générer in vitro, à l'aide d'un système adapté, des radicaux hydroxyles. Les ·OH sont quantifiés en RPE par la méthode de spin-trapping, utilisant la DMPO. Une quantité donnée de plasma est ajoutée au milieu. La capacité antiradicalaire du plasma vis-à-vis du radical ·OH est évaluée par étude de l'intensité des spectres DMPOrOH avant et après addition de plasma.
-9- Méthode
Comme dans la première partie de la thèse, les radicaux ·OH sont générés in vitro dans un tampon phosphate (50 mM) à pH 7.4, par le système enzymatique xanthine - xanthine oxydase (25 IlM - 2.5 mUI/ml) auquel est additionné le complexe Fe-EDTA (5 IlM - 10 J,lM) et la DMPO (5 mM).
Des prises d'essai de 50 - 100 - 150 J,ll de plasma ont été testées pour chaque échantillon de plasma. Elles sont additionnées au milieu avant la xanthine, qui démarre la réaction enzymatique. Les spectres sont enregistrés 75 secondes après le début de la réaction enzymatique pour le spin-adduct dérivé de ·OH.
Les échantillons sont placés dans une cellule en quartz plate, logée dans une cavité de type TMllO à 37°C (310 K). Les spectres sont enregistrés à partir d'un appareil Bruker ESP 300E à la fréquence de 9.57 GHz avec une modulation de fréquence de 100 kHz, et les paramètres d'acquisition suivants:
Modulation d'amplitude = 0.819 G, Puissance de la micro-onde = 20 mW,
Nombre de scan =1.
Vitesse de balayage
=
1.20 G.s-1, Champ magnétique = 3425 ± 50 G,Le pouvoir antioxydant du plasma est déterminé en calculant le pourcentage de diminution de l'intensité du signal DMPOrOH après ajout de plasma par rapport à celle du signal DMPOrOH sans plasma.
4.4. Evaluation des défenses antioxydantes non enzymatiques
~ Dosage de la vitamine C Principe
La technique de dosage utilisée dérive de celle décrite par Roe et Kuther (1943). La vitamine C ou acide ascorbique est oxydée par le cuivre en acide déhydroascorbique. Cette forme oxydée de la vitamine C réagit avec la diphénylhydrazine en milieu acide pour former une bi-dinitrophénylhydrazone, quantifiable par spectrophotométrie à Â
=
520 nm. Le dosage est réalisé en présence de thio-urée qui diminue les interférences dues aux chromogènes non ascorbiques.Méthode
La vitamine C est extraite du plasma ou de l'homogénat cardiaque par un traitement à l'acide trichloracétique (TCA) à 10 %. Les protéines sont précipitées par centrifugation. Le déféquat obtenu est mis en présence du réactif Dinitrophénylhydrazine + Thio-urée + Cuivre (DTC), préparé extemporanément dans l'acide sulfurique (9N). Après 3 heures d'incubation à 37°C, l'ensemble est additionné d'acide sulfurique froid à 65 %. Après 30 minutes de repos, la vitamine C est quantifiée par spectrophotométrie à Â = 520 nm.
Les résultats sont exprimés en J..lg de vitamine C par millilitre de plasma (J..lg.ml-I plasma) ou en Jlg de vitamine C par g de tissu frais (Jlg. g-I) au niveau cardiaque.
-9-Dosage de la forme radical aire de la vitamine C : le radical ascorbyle.
Principe
Le radical ascorbyle, présent dans le plasma, est formé par réduction de l'acide ascorbique, et dégradé en acide déhydroascorbique. C'est une espèce radicalaire relativement stable, en raison de la délocalisation de son électron libre sur la structure cyclique de la molécule. De ce fait, il peut être directement détecté par RPE.
Méthode
Les échantillons de plasma sont placés dans une cellule en quartz plate, insérée dans la cavité TMllO à 37°C (310 K). Les spectres sont enregistrés à partir d'un appareil Bruker ESP 300E à 9.7 GHz avec une modulation de fréquence de 100 kHz, et les paramètres de détection suivants:
Modulation d'amplitude = 0.5 G, Puissance de la micro-onde = 4 mW, Nombre de scans
=
5.Vitesse de balayage = 0.12 G.s·l,
Champ magnétique = 3460 ± 5 G,
La hauteur du signal est mesurée et les résultats sont présentés sous la forme d'un rapport radical ascorbyle sur vitamine C plasmatique exprimé en unités arbitraires (UA).
-9-Dosage de la vitamine E
Principe
Après déprotéinisation et extraction de l'échantillon, la vitamine E est dosée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à une détection spectrotluorimétrique, en utilisant un standard externe.
Méthode
La vitamine E ou a-tocophérol est extraite du plasma ou de l'homogénat cardiaque d'après la méthode décrite par Burton et al (1985). L'homogénat cardiaque est traité par le dodécyl sulfate de sodium (SDS) 0.1 M, détergent utilisé pour rompre les membranes dans lesquelles sont insérées les molécules d'a-tocophérol. Il est ensuite repris avec l'éthanol absolu, puis l'heptane. Le plasma est traité par l'éthanol absolu puis l'heptane. Les échantillons (plasma et homogénat traités) sont centrifugés à 1000 g et +4°C afin de séparer les phases aqueuse et organique. La phase supérieure (phase organique contenant la vitamine E) est conservée à -70°C jusqu'au moment du dosage.
La colonne utilisée pour la séparation (Hypersyl NH2) est composée de billes de silice d'un diamètre de 5 J.1m sur lesquelles sont greffés des groupements -NH2 • La phase mobile est constituée d'un mélange n-heptane / 2-propranolol en proportion 98:2 (VN). La détection spectrofluorirnétrique (Kontron SFM 125) est réalisée à Î.. excitation = 298 nrn et
Î.. émission = 325 nrn. L'intégration des pics est réalisée par un intégrateur ENI CA 3I.
Les résultats sont exprimés en J.1g de vitamine E par millilitre de plasma (J.1g.rn1-1 plasma) ou en J,lg par g de tissu frais (J.1g. g-I) au niveau cardiaque.
4.5. Evaluation des défenses de nature enzymatigue
~ Dosage des superoxydes dismutases (SODs) Principe
L'activité des SODs est évaluée par leur capacité à inhiber la réduction du ferricytochrome c par le radical superoxyde, généré par un système xanthine / xanthine oxydase (méthode de Mc Cord & Fridowich 1969 modifiée par Flohe & Otting en 1985).
xanthine xanth~ase .. acide urique
ferricytochrome c oxydé
superoxyde dismutase
O2.- - - - -... ~~ H202 '" puis H20 + O2
~
~ ferricytochrome créduit
L'activité des SODs est suivie par l'étude de la réduction du ferricytochrome c, en spectrophotométrle à Î.. = 550 nrn.
Préparation des échantillons
Une partie du surnageant est directement utilisé pour doser les SODs totales cardiaques. L'autre partie est traitée afin d'isoler la Cu/Zn SOD. Pour cela, le surnageant est mis en présence de SDS à 10 % (PN) et incubé 45 minutes à 37°C. Après addition de KCl 3 M, et une nouvelle incubation de 30 minutes à +4 oC, les échantillons traités sont centrifugés à 20 000 g. Le surnageant contient uniquement la Cu/Zn SOD. La Mn SOD est évaluée par différence entre la quantité dosée de SODs totales et celle de Cu/Zn SOD.
Méthode
La solution de réaction est constituée de xanthine (90.88 1lM), de xanthine oxydase (25 mUI.rl), d'azide (10 1lM), de ferricytochrome c (18 1lM) dans du tampon phosphate (50 mM), à pH 7.4, additionné d'EDTA (1.1 mM). Les mesures sont réalisées sur 3 minutes à 37°C.
L'activité enzymatique est exprimée en unités internationales par ml de plasma (UI.mrl) ou en unités internationales par mg de protéines (UI.mg-1 Pt) au niveau du coeur.
~ Dosage des gluthations peroxydases (GSH-Px) Principe
L'activité de la gluthation peroxydase est mesurée par la méthode dérivée de celle de Flohe & Günzler (1984) et Lawrence & Burk (1976). L'activité de la GSH-Px est déterminée de façon indirecte en suivant la consommation de NADPH,W au cours de la cascade réactionnelle suivante :
gluthation peroxydase
2H202
(\~
2 H20 + O22 GSH GSSG
gtKtase
NADP NADPH,If
Le glutathion réduit (GSH) et la gluthation réductase sont ajoutés en excès pour ne pas constituer les facteurs limitants de la réaction.
Méthode
Dans un milieu contenant un tampon phosphate KH2P04 (50 mM) à pH 7.2, l'échantillon (ou un volume équivalent de tampon phosphate pour la cuve témoin) est incorporé en présence d'azide de sodium (1 mM), d'EDTA (1 rnM), de GSH (1 mM), et de gluthation réductase (1 UI.ml-I). Après 5 minutes d'incubation à 37°C, le NADPH,If (0.6 mM) est ajouté et la cinétique est suivie sur 3 minutes. Elle permet de mesurer la consommation de NADPH,W du milieu qui ne dépend pas de la GSH-Px, et doit être négligeable. Enfin, H202 (1.5 mM) , le substrat de la GSH-Px, déclenche la réaction. La cinétique de disparition de NADPH,If est mesurée sur 3 minutes à À = 340 nm et 37°C.
L'activité enzymatique de chaque échantillon est exprimée en UI.ml-1 dans le plasma ou en mUI.mg-1 Pt dans le coeur.
-9-Dosage de la catalase {>rincipe
L'activité de la catalase est évaluée par la méthode dérivée de Clairbome (1985) et Aebi (1984). Elle consiste à suivre la dégradation de son substrat: le peroxyde d'hydrogène (H202), en spectrophotométrie à Â. = 240 nm.
2 H202 ~ 2
catalase H20
+ O
2Méthode
La cinétique de disparition de H202 (12 mM) est mesurée pendant 1 minute à 37°C.
L'activité de la catalase est exprimée en Œ.mg-l Pt dans le coeur. Le plasma ne présente pas d'activité catalasique.
4.6. Evaluation du métabolisme du ~O
Plusieurs voies d'approche sont possibles in vivo : dans le sang, le ~O se lie rapidement à l'hémoglobine, formant un complexe stable, détectable par RPE. La méthémoglobine, qui résulte de la dégradation du complexe [hémoglobine-~O] peut également être mesurée par RPE. Enfin, le métabolisme du ~O conduit à la formation de nitrites et de nitrates que l'on peut quantifier dans le plasma.
-9-Evaluation du complexe hémoglobine--NO
Le complexe [hémoglobine-~O] est détecté par RPE sur le culot globulaire, recueilli après centrifugation du sang à +4
oc.
Les tubes en polyéthylène contenant le culot globulaire à la température de l'azote liquide, sont placés dans la cavité double à -173°C (100 K). Les spectres sont enregistrés à partir d'un appareil Brucker ESP 300E à la fréquence de 9.6 GHz avec une modulation de fréquence de 100 kHz, en tenant compte des paramètres de détection:
Modulation d'amplitude = 5.76 G, Champ magnétique = 3350 ± 150 G, Puissance de la micro-onde = 5 m W, Vitesse de balayage = 3.60 G.s-1, Nombre de scans = 5.
La hauteur du signal mesurée est exprimée en unités arbitraires (UA).
~ Evaluation de la méthémoglobine
Elle est également mesurée sur le culot globulaire dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées pour la détermination du complexe [hémoglobine-~O].
En RPE, seule la valeur du champ magnétique, et le nombre de scans diflèrent par rapport aux paramètres de détection du complexe [hémoglobine-~O] :
Champ magnétique = 2500 ± 1750 G, Vitesse de balayage = 20.86 G.s-1, Nombre de scan = 1.
La hauteur du signal est mesurée et les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).
~ Dosage des nitrites et nitrates pLasmatiques Principe
La quantification des nitrites (N02") est réalisée par la réaction dite de Griess. Les nitrites réagissent avec ce réactif pour former un chromophore rose. L'intensité de la coloration est mesurée par spectrophotométrie à Â
=
546 nm. La limite de détection de la méthode est de l'ordre de la nanomole par millilitre.Les nitrates (N03) sont également quantifiés par la réaction de Griess, après réduction en N02- par la nitrate réductase en présence de NADPH,W.
N03- + NADPH,W ~ N02- + NADP + H20
nitrate réductase
Les nitrites totaux ainsi mesurés ont une double origine : une partie est "naturellement"
présente dans le plasma, et le reste provient de la réduction des nitrates. Les nitrates seront donc évalués par différence entre le dosage des nitrites totaux avec les nitrites mesurés en l'absence de la nitrate réductase.
Mesure
Les échantillons de plasma sont préalablement déprotéinisés par ultrafiltration (sur rnicrofiltres Millipore UFC4TTK), afin d'éviter toute interférence des protéines avec le réactif de Griess.
Le dosage des nitrites est réalisé sur le plasma déprotéinisé dans un tampon imidazole (0.1 M) à pH 7.8 auquel est ajouté le réactif de Griess (N-1 naphtyl éthylènediamine hydrochloride à 0.1 % + para-aminobenzène sulfonilarnide à 1 % dans l'acide phosphorique à 5
%), préparé extemporanément. Après 10 minutes d'incubation à température ambiante, l'intensité de la coloration est évaluée par spectrophotométrie à Â = 546 nrn.
Pour le dosage des nitrates, le plasma déprotéinisé est mis en contact avec la nitrate réductase (0.015 VI.ml"l) en présence de NADPH,W (9.6 ~M). Après 40 minutes d'incubation à température ambiante et à l'obscurité, le réactif de Griess est ajouté. 10 minutes plus tard, l'intensité de la coloration est évaluée par spectrophotométrie à Â. = 546 nm..
Les résultats sont exprimés en micromoles de N02" ou N03" par litre (~M).