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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Deni, J. (1999). Bioremédiation des sols pollués par les hydrocarbures: étude de l'activité des bactéries nitrifiantes dans les sols pollués par les hydrocarbures (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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y
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Fac)îlté des Sciences
Section Interfacultaire d’Agronomie
Laboratoire de Physiologie et Ecologie Microbienne
Bioremédiation des Sois Poilués par les Hydrocarbures:
Etude de l^\cti^ité des Bactéries Nitrifiantes dans les Sols Pollués
par les Hydrocarbures
Thèse présentée pour l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Jamal DENI
r
^Ufversite Libre de Bruxelles
003212044
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successivement en nitrite et en nitrate. Ces réactions sont catalysées par des bactéries nitrosantes comme Nitrosomonas europaea et des bactéries nitratantes comme Nitrobacter Winogradskyi.
Plusieurs études réalisées in vitro avec une culture pure de N. europaea ont montré que ces bactéries sont capables d’oxyder une variété d’hydrocarbures sous l’action de l’ammoniac monooxygénase, qui est l’enzyme clef dans le processus de la nitrification autotrophe. La transformation des hydrocarbures via cette enzyme est considérée comme une co-oxydation compétitive vis à vis de l’ammonium.
L’oxydation des hydrocarbures constitue l’étape primordiale dans la dégradation des composés organiques en particulier les hydrocarbures. De ce fait les bactéries nitrifiantes constituent des excellentes candidates pour la bioremédiation des environnements pollués. En effet il est possible de stimuler la capacité biodégradative de ces bactéries omniprésentes par simple addition d’ammonium et d’oxygène.
Cependant, s’il est planifié d’utiliser les bactéries nitrifiantes dans les schémas de la bioremédiation des environnements contaminés par les hydrocarbures, il est essentiel d’étudier l’évolution de ces bactéries en présence de ces polluants dans leur milieu naturel. En effet les études in vitro négligent généralement les interactions des micro-organismes avec le milieu, la diversité des micro
organismes et l’état physiologique in situ .
Dans le sol non contaminé, la production du nitrate est fortement affectée par les hydrocarbures. Par contre la consommation d’ammonium n’est pas affectée. Ceci est dû à l’immobilisation de ce dernier par les bactéries hétérotrophes dont l’activité est stimulée par le carbone des hydrocarbures.
Dans le sol contaminé la plus grande partie d’ammonium est transformé en nitrate. Cette transformation se fait avec une vitesse plus importante que celle observé dans le sol non contaminé en absence des hydrocarbures, ceci malgré que le nombre des bactéries nitrifiantes est très faible dans le sol contaminé. La ré-exposition du sol pollué à une nouvelle contamination par les hydrocarbures n’affecte pas directement la nitrification, mais réduit la production du nitrate par consommation d’ammonium par les bactéries hétérotrophes dont l’activité est stimulée par le carbone des hydrocarbures.
Ces résultats montrent que les bactéries nitrosantes du sol contaminé possèdent une grande activité spécifique qui se manifeste par une résistance à l’inhibition par les hydrocarbures.
L’analyse des échantillons du sol contaminé par PCR, DGGE et les techniques conventionnelles nous ont permis de montrer que les bactéries du sol contaminé sont capables d’oxyder en même temps l’ammonium et les hydrocarbures mais dans ces conditions, l’oxydation d’ammonium n’est pas suivie par la prolifération de ces dernières. Ceci est le résultat de la perte de l’énergie générée par l’oxydation de l’ammonium par oxydation des hydrocarbures. L’analyse de la diversité des bactéries nitrosantes du sol contaminé a montré que tous les groupes caractéristiques du sol sont présents. Ceci montre que l’adaptation physiologique des bactéries nitrosante observé dans le sol contaminé n’est pas spécifique à un groupe particulier mais qu’elle est commune pour toutes les nitrosantes du sol.
Enfin une étude de la nitratation dans le sol contaminé nous a permis de montrer que la nitratation n’est pas affectée par les hydrocarbures. Une étude de l’évolution des bactéries nitratantes dans le sol contaminé par les méthodes conventionnelles et moléculaires nous a permis de montrer que les espèces du genre Nitrobacter peuvent proliférer d’une façon mixotrophe et organotrophe en assimilant des métabolites intermédiaires excrétés par les bactéries hétérotrophes aux cours du métabolisme des hydrocarbures.
I- Introduction :
Chapitre I : Aspect physiologique et écologique de la nitrification Autotrophe
I. Introduction... 5
IL Nitrosation... 7
IL 1. Biochimie de la nitrosation... 8
IL 2. Organisation des gènes impliqués dans l’oxydation de l’azote chez Nitrosomonas... 10
IL 3. Ammonium monooxygénase (AMO)... 11
IL 3. 1. Caractéristiques de l’AMO...11
IL 3. 2. Interation avec des hydrocarbures...12
n. 3. 3. Rôle fonctionnel de l’oxydation du méthane par les bactéries nitrosantes ?...15
III. Nitratation... 16
III. 1. Biochimie de la nitratation... 17
III. 2. L’autotrophie de Nitrobacter ?... 17
IV. Phylogénie des nitrifiants... 19
V. Nitrification dans les conditions de stress... 21
V. 1. Nitrification à faible concentration en oxygène... 21
V. 2. Nitrification à pH acide... 22
V. 3. Nitrification dans les sols limités en ammonium...23
Chapitre II : Approches conventionnelles et moléculaires de l’écologie des nitrifiants du sol
I. Introduction... 24
IL Méthodes conventionnelles...25
IL 1. Technique de MPN (Most Probable Number)... 25
LL. 2. L’activité potentielle des nitrifiants du sol...26
LL 3. Nitrification potentielle du sol...26
LLL. Méthodes moléculaires... 27
ni. 1. Introduction... 27
III. 2. Extraction des acides nucléiques du sol...28
ni. 2. 1. Extraction d’ADN à partir du sol... 29
ni. 2. 2. Purification... 30
ni. 3. Caractérisation de la structure de la diversité des bactéries nitrifiantes... 30
ni. 3. 1. Analyse par clonage...32
ni. 3. 2. Analyse par séparation sur gel avec gradient de dénaturation (DGGE)...34
ChKipitre HT ; Bioremédiation I. Introduction... 37
IL L’actiinté microbienne dans le sol...37
IL 1. Co-métabolisme... 38
IL 2. Nutriments...39
IL 3. Les propriétés physiques du sol et l’activité microbienne... 39
III. Les approches de la bioremédiation...40
IV. Rôle de la biologie moléculaire dans
l’évaluation de la bioremédiation...40
Bibliographie...41
II- Résultats
Objectif du travail...63
Chapitre I. Nitrification dans les sols pollués par les hydrocarbures Adaptation des bactéries nitrosantes...64
Chapitre H. Caractérisation des bactéries nitrosantes du sol pollué par les hydrocarbures...88
Chapitre m. La nitratation dans le sol pollué par les hydrocarbures &
Vhétérotrophie de Nitrobacter...102
III- Conclusions & Discussion 128
Le but de ce présent travail est Vétude de Vinteraction des bactéries nitrifiantes et la pollution des sols par les hydrocarbures.
Une combinaison de méthodes conventionnelles et moléculaires est utilisée dans cette investigation.
Pour cela nous allons passer en revue dans cette introduction:
• P aspect physiologique et écologique de la nitrification autotrophe.
• les approches conventionnelles et moléculaires de Vécologie des nitrifiants du soi
• le rôle des micro-organismes dans la bioremédiation des sols pollués.
Chapitre I
'aspect physiologique et écologique de la nitrification autotrophe
I. Introduction
La nitrification est un processus important dans le cycle de l’azote, C ‘est un lien entre les formes les plus réduites (NH4") et les plus oxydés (NO3') de l’azote inorganique (Fig. 1).
FIG. 1. Représentation schématique du cycle de l’azote naturel.
Ce processus biologique a reçu une grande attention, du fait de sa contribution aux problèmes de la pollution, tels : (i) la pollution des eaux par le nitrate produit à partir de l’oxydation de l’ammonium utilisé pour la fertilisation des sols, (ii) la production de gaz, comme le NO et le N2O (Lorgan et al. 1981 , Turco, 1985) qui interviennent dans la destmction de la couche d’ozone, La production de ces gaz peut être soit directe (Goreau et al.
1980 ; Lipschulz et al. 1981) soit indirecte en approvisionnant la dénitrification par le nitrate (Anderson & Levine, 1986). La nitrification intervient aussi dans le processus de biodétérioration des monuments historiques (Meincke et al, 1989).
A l’opposé de ces inconvénients la nitrification est utilisée d'une façon bénéfique dans le domaine d’épuration des eaux usées car elle permet la réduction de la teneur en ammonium de ces eaux dans les stations d’épuration avant leur décharge dans les milieux aquatiques (Painter, 1986).
Certains micro-organismes hétérotrophes peuvent produire de l’azote sous forme oxydée comme le nitrite et le nitrate. Les bactéries nitrifiantes chémo-lithotrophes sont considérées comme le groupe le plus important pour la production de ces formes à partir de l’ammonium dans la majorité des écosystèmes. La contribution à la production du nitrate par des micro- organismes hétérotrophes est essentiellement observée dans des sols acides peu favorables aux bactéries chémo-lithotrophes (Schimel et al. 1984 , Killham, 1986, 1990). La nitrification autotrophe est réalisée en deux étapes par des organismes distincts : les bactéries nitrosantes qui oxydent l’ammonium en nitrite et les bactéries nitratantes qui oxydent le nitrite en nitrate. Malgré que la nitrification autotrophe se fasse en deux étapes et par des organismes distincts, les nitrites s’accumulent rarement dans la nature (Presser, 1989).
Les nitrifiants autotrophes sont des bactéries Gram- négatif de la famille des Nitrobacteraceae (Watson et al. 1989). Tous les organismes de cette famille sont capables d’utiliser l’ammonium ou le nitrite comme source d’énergie et le dioxyde de carbone comme source de carbone suivant les réactions d’oxydoréduction reprises ci-dessous. L’assimilation du CO2 se fait comme chez les bactéries photosynthétiques via le cycle de Calvin Benson.
Nitrosation :
NH3 + O2 + 2Ef + 2 e _________^ NH2OH + H2O NH2OH + H2O --- ► NOî' + 5H" + 4 e
0.1 CO2 + 0.4 îT + 0.4 e--- ► 0.1 HCOH + O.IH2O 0.4 O2+1.6ÎT+1.6e --- ► O.8H2O
Soit :
NH3 + 1.4 O2 + 0.1 CO2 ► N02’ + 0.1 HCOH + 0.9 H2O +îT
Nitratation
NO2 + H2O --- ► N03'+ 2 tr + 2 e
0.01 CO2 + 0.04 It + 0.04 e --- ► 0.01 HCOH + 0.01 H2O 0.49 O2 +1.96 H^+1.96 e ---► 0.98 H2O
Soit
NOî' + 0.49 O2 + 0.01 CO2 + 0.01 H2O --- ► N03'+ 0.01 HCOH
L’assimilation d’une mole d’azote avec le CO2 comme source de carbone, exige l’oxydation d’environ 54 moles d’ammonium et 400 moles de nitrite respectivement pour les bactéries nitrosantes et nitratantes, selon les réactions de nitrification et d’assimilation décrite ci-dessous :
55NH4^ + 7602 + 5CO2 --- ►C5H7O2N + 54N02‘+ 52H2O +109tT
400N02'+ NH4" + 19502 + 2H2O + 5CO2--- ► C5H7O2N + 400N02'+ H'
Sauf l’exception pour certaines espèces du genre Nitrobacter, tous les autres sont strictement chémo-lithotrophes. Certaines peuvent néanmoins proliférer en présence de CO2 et d’une quantité faible de composés organiques. Ces bactéries sont aérobies, mais certaines prolifèrent en présence d’une concentration faible d’oxygène. La sensibilité à des pH faibles est une caractéristique spécifique aux bactéries nitrosantes actuellement qui ont été isolés.
La capacité métabolique limitée des bactéries nitrifiantes chémio-lithotrophes devrait réduire leur nombre d’habitats possibles. Ainsi les nitrifiants doivent coloniser des environnements aérobies avec un pH neutre ou légèrement alcalin où l’ammonium est produit à partir de la matière organique par minéralisation. Cependant, elles sont aussi observées dans des environnements extrêmes tels que les sols acides (Walker & Wickramsinghe, 1979), la surface des monuments historiques (Meincke et al., 1989 ; Spieck et al., 1992), les zones océaniques avec un minimum d’oxygène (Ward, 1986) et enfin dans les réservoirs anaérobies d’eaux usées (Abeliovich, 1987).
II. Nitrosation
La plupart des données physiologiques et écologiques des bactéries nitrosantes, sont basées sur des études menées sur une seule espèce Nitrosomonas'europaea (isolé à partir du sol, elle croit conventionnellement dans les conditions du laboratoire). Les résultats de ces études ont été souvent extrapolés à toutes les bactéries nitrosantes.
ou de l’eau sont souvant considérées comme les dominantes. Etant donné que Nitrosomonas représente le genre le plus souvent isolé des bactéries nitrosantes, on a supposé qu’il est le plus commun et le plus nombreux, les autres genres décrits comme des genres secondaires (Belser, 1979). En utilisant une modification de la méthode du nombre le plus probable (MPN), Belser & Schmidl, (1978) ont montré que plusieurs genres peuvent être isolés ou détectés dans un même sol. Pour plusieurs sols, ils ont conclu que Nitrosospira est le genre le plus nombreux, du fait qu’il est le seul genre présent dans les dilutions élevées (10''‘-10'^).
Alors que dans plusieurs séries de dilution, Nitrosomonas est détecté que dans les faibles dilutions (10'^-10’^ ). Ceci suggère que Nitrosomonas pourrait concurrencer les autres genres dans un milieu liquide de culture , ainsi il sera isolé par enrichissement, bien que sa population initiale soit considérablement moins nombreuse que celle d’autres genres.
IL 1. Biochimie de la nitrosation (Fig. 2)
Les principes biochimiques de la nitrosation sont relativement bien connus.
L’ammonium diffuse du milieu extérieur vers le périplasme où il sera converti en hydroxylamine par une enzyme membranaire : l’ammoniac-monooxygénase (Hollocher et al., 1981). L’hydroxylamine libérée dans le périplasme sera à son tour oxydée en nitrite par une hémoprotéine soluble du périplasme : l’hydroxylamine oxydase. Les 4 électrons (Andersson
& Hooper, 1983) qui sont générés par cette oxydation sont véhiculés par le cytochrome-554 vers rUbiquinone-8 (Yamanaka & Shinra, 1974 , Arciero et al. 1991). De là, deux électrons retournent vers l’ammoniac monoxygénase par des transporteurs inconnus pour la régénération de l’hydroxylamine à partir de l’ammonium (Hyman & Wood, 1985).
Le reste des électrons passe à travers le cytochrome c-552, vers une oxydase terminale, le cytochrome aa3 oxydase (DiSpirito et al., 1986 , Wood, 1988) ou la nitrite réductase dans les conditions d’aérobiose (Miller & Wood 1983 ; DiSpirito et al. 1985).
Périplasme
FIG. 2. Arrangement des enzymes et des transporteurs des électrons intervenant dans la nitrosation chez Nitrosomonas.
AMO-ammoniac monooxygènase , HAO-hydroxylamine oxydase , P460-
cytochrome P460 , Q-Ubiquinone-8 ; CycB-tetraheme membrane c-cytochrome, c552-cytochrome c552 ; ccp-diheme c553peroxidase , NiR-nitrite réductase ; CuCuaa3-cytochrome oxydase. Les flèches continues et discontinues indiquent les voies du transfert d’électron connues et hypothétiques respectivement.
D’autres protéines existent chez les bactéries nitrosantes dont la fonction est inconnue, comme le tétrahéme cytochrome c (CysB) (Bergmarm et al., 1994a). Ce dernier est attaché à la membrane par un segment trans-membranaire du coté N- terminale. La séquence de son gène cycB est homologue à celle des tétrahémes cytochromes présentent dans certains
nitrate réductase (Vanneli et al., 1996). Le cytochrome c peroxydase est présente dans le périplasme (Arciero & Hooper, 1994), il est possible qu’il joue un rôle de protection de l’hydroxylamine oxydase qui est facilement inactivée par le peroxyde d’hydrogène (Hooper
& Terry, 1977). Le cytochrome P-640 qui est une protéine du périplasme, oxyde aussi l’hydroxylamine (Erickson & Hooper, 1978 , Numata et al. 1990 , Bergmann & Hooper 1994). Mais elle est présente en plus faible quantité que l’hydroxylamine oxydase. Son rôle physiologique et sa contribution quantitative à l’oxydation de l’hydroxylamine in vivo sont inconnus.
II. 2. Orsanisation des gènes impliqués dans V oxydation de l’azote chez Nitrosomonas (Fig. 3)
hso cycA cycS
(c5S4) (cS32m)
cyp
(P4S0)
hso cycA cycS cyz
(C552)
hao cycA
amcA amc6 --- 1 kS
dcp
(diheme
amoA amcB
FIG. 3. Organisation des gènes des enzymes de la nitrosation et du transport d’électrons.
hao-hydroxylamine oxydase , cycA-cytochrome c554 ; cycB-tetraheme membrane c- cytochrome , amoA et amoB-sous unités de 1’ ammoniac monooxygènase , cyp- cytochrome P460 , cyt-cytochrome c552 , dcp- diheme c553peroxidase.
Les gènes qui codent pour les deux sous unités amoA et amoB de l’ammoniac monooxygènase sont représentés par deux copies (McTavish et al. 1993a; Bergmann
&Hooper 1994). Les gènes qui codent pour l’hydroxylamine oxydase et le cytochrome c-554 sont représentés dans trois groupes de gènes (IVIcTavich. et al. 1993b , Sayavedra-Soto et al.
1994). Le tétraheme cytochrome (cycB) est représenté par deux copies (Bergmann et al.
1994). Alors que le cytochrome P460, cytochrome c-552 et le cytochrome c peroxydase sont codés respectivement par un seul gène spécifique.
IL 3. Ammoniac monooxveénase (AMO)
IL 3. 1. Caractéristiques de l’AMO
L’AMO purifiée perd son activité ce qui n’a pas permis de la caractériser catalytiquement in vitro. L’AMO est constituée de deux sous unités l’amoA et l’amoB. Par prédiction à partir de la séquence en acides aminés, l’amoA est constituée de 5 segments transmembranaires et d’une boucle périplasmique, alors que l’amoB est constituée de deux domaines transmembranaires et deux domaines périplasmiques. Les données acquises sur les caractéristiques du site actif et les réactions catalysées par AMO sont le fruit des études réalisées sur des cellules intactes (Hooper et al. 1997),
FIG. 4. Cycle catalytique de l’ammoniac monooxygènase.
Lees en 1946 a proposé l’implication du cuivre dans l’oxydation enzymatique de l’ammonium (Lees 1946). La présence du cuivre dans le site actif de l’AMO est proposé pour plusieurs raisons ; (i) les agents qui chélatent les métaux inhibent l’oxydation de l’ammonium par Nitrosomonas europaea (Hooper & Terry 1973 , Lees 1952). (ii) l’oxydation de
l’oxydation de l’ammonium n’a jamais été démontrée) (Loveless & Hooper 1986 ; Ensign et al, 1993). (iii) enfin l’inhibition de l’oxydation de l’ammonium et non l’hydroxylamine par la lumière, suggère la présence d’un stade oxygéné (Shears & Wood 1985) similaire à celui des autres monooxygénases qui contiennent du cuivre (Lerch 1981). Ainsi par analogie avec d’autres monooxygénases, le cycle catalytique peut être schématisé comme dans la figure 4,
IL 3. 2. Interaction avec des hydrocarbures
Les bactéries nitrosantes sont caractérisées par leur capacité de transformer une grande variété de substrats (Table 1). Ces transformations sont catalysées par l’AMO pour différentes raisons (i) elles sont inhibées par des inhibiteurs spécifiques de l’oxydation de l’ammoniac, (ii) la quantité de substrats transformée dépend de la concentration d’ammonium, (iii) enfin l’interaction avec une variété de composés est comparable à celle du méthane monoxygénase (Fox et al. 1990 , Green & Dalton 1989 , Burrows et al. 1984 , Bedard & Knowles 1989).
Tous les substrats et les inhibiteurs compétitifs de l’AMO sont non polaires, ce qui suggère que son site actif est hydrophobe. En effet, l’ammoniac représente le substrat réel de l’AMO au lieu de l’ion ammonium (Suzuki et al. 1974). L’interaction avec une variété de substrats laisse penser que la réaction enzymatique est initialisée par une activation de l’oxygène plutôt que du substrat. Ainsi par analogie avec d’autres monooxygènase, l’oxygène est activé par deux électrons des deux atomes de cuivre localisés au centre de l’AMO. Ceci est suivi par la libération d’une molécule d’eau et la formation d’un intermédiaire enzymatique oxygéné comme dans le cas du cytochrome P-450 et de la méthane monooxygènase. Ce dernier prélève des atomes d’hydrogène ou des électrons du substrat pour donner la forme hydroxy de l’enzyme et un substrat radical. L’AMO peut catalyser des réactions en jouant le rôle d’une monooxygènase ou une déshydrogènase/oxydase ou encore catalyser des réactions de déhalogènation réductrice (Fig. 5).
Tous les substrats transformés par les bactéries nitrosantes agissent comme des inhibiteurs compétitifs vis à vis de l’oxydation de l’ammoniac. L’inhibition se fait à des degrés très variables mais elle est réversible, car en général, l’activité oxydative est récupérée complètement une fois que les bactéries ne sont plus exposées à ces substrats.
Ammoniaque Dimethyl éther' n-alcanes jusqu'à Cg*’
Méthane'^ 1-alcènes jusqu’à C5’’
Méthanor cis- et trans-2-Butene*’
Monooxyde de Carbone* cyclohéxane“
Produits sulfureux :
Methylsulfide' Methylphenylsulfide' Ethylsulfide' Allylmethylsulfide' Tétrahydrothiophène'
Thiophène'
Allylsulfide'
Alcanes halogénés :
Fluorométhane° Chloroéthane 1,1,2-Trichloroéthane^
Chlorométhane*' Bromoéthane’’ 1,1,2,2-Tetrachloroéthane'
Bromoéthane* lodeéthane*" Chloropropane^
Dichlorométhane'' 1,1 -Dichloroéthane' 1,2-Dichloropropane*
Dibromométhane’' 1,2-Dichloroéthane‘ l,2,3-Trichloropropane‘' Trichlorométhane*' l,2-Dibromoéthane‘‘ l,2-Dibromo-3-chloropropane®
Fluoroéthane^ 1,1,1 -Trichloroéthane'' Chlorobutane^
Alcènes halogénés ;
Chloroéthylène Trichloroéthylène^ 2,3-Dichloropropène'"
Gem-Dichloroéthylène'‘ T ribromoéthy lène’' cis-1,3 -Dibromopropène'"
c/5-Dichloroéthylène'‘ 3-Iodopropène"' 1,3-Dibromoproène'"
rranx-Dichloroéthylène’' ci s-1,3 -Dichloropropène™ 1,1,3-Trichloropropène”
c/5-Dibromoéthylène'‘ trans-1,3 -Dichloropropène'"
Aromatiques :
Bsnzèné Bromobenzène^ ortho-Crésol^
Toluène^ lodobenzène^ 2,5-Dimethylphénof
para-xy\ène^ 1,2-Diochlorobenzène^ Acétophénone*^
Ethylbenzène^ Phénof Aniline^
Styrène^ Anisole" Nitrobenène^
Naphtalène" para-Méthylbenzvl Alcoof Benzonitrile“
Fluorobenzène" Phenethyl Alcool^ Nitrapyrine' Chlorobenzène^ jec-Phenethyl Alcoof
“Drozd (1980) ; ^Keener and Arp (1994) ; Vannelli et al. (1990)
'’Hymanetal. (1988) ;*Rascheetal. (1990a) ; ' VaimelliandHooper (1992)
‘Hyman et al. (1994) ; ''Rasche et al. (1990b) ; "* Vannelli ( 1994)
** Jones andMorita (1983) ; ‘Rasche étal. (1991) ;“Vannelli and Hooper (1995) ' Juliette et al. (1993) ;^Tsang and Suzuki (1982) ; "Voysey and Wood (1987)
Table 1. Les différents substrats pour l’ammoniac monooxygènase de Nitrosomonas europaea.
Monoxygenasa
2 H* + 2 a' + bj -f M
H. .a
'*M=0 + -C=C^
a G
Oehydrogenaaa/Oxidaae
-M=0 +
Raductiva Dehaloganation
M + 2 H* + 2 a' +
C3C
H,O + **M=0
2HjO
,C-C^ +. M ^ 3 HCl +
G G Chemical
+ H^O f M
Cî^HC
+ HCl -H M
O OM II
H-C-C-CH
FIG. 5. Les différentes réactions catalysées par l’ammoniac monooxygènase de Nitrosomonas europaea.
La nitrapyrine (2-chloro-6-trichioromethyl-pyridine ou N-serve) représente le composé le plus utilisé pour l’inhibition de la nitrification dans le sol, car il permet l’inhibition de la première étape enzymatique de la nitrification (l’oxydation de l’ammonium en hydroxylamine) (Campbell et al. 1965). Dans les sols, le degré d’inhibition de la nitrification par la nitrapyrine varie avec la nature du sol (Bedard & Knowles 1989 , Bundy &
Bremner 1973). In vitro le degré d’inhibition varie d’une espèce à une autre (Belser &
Schmidt 1981). Dans le sol et en milieu de culture la nitrapyrine est hydrolysée en acide 6- chloropicolonique qui inhibe aussi la nitrification avec un degré comparable à celle de la nitrapyrine (Bremner et al. 1978 , Laskowski et al. 1985 , Powell & Presser 1985). La transformation de la nitrapyrine est attribuée aux bactéries nitrosantes et plus spécifiquement à l’AMO. La figure 6 représente le mécanisme le plus probable de la transformation de la nitrapyrine en acide 6-chloropicolinique par l’AMO (Vannili & Hooper 1995).
Nitrapyrin 6-CI-Picolinic Acid
O2 + 2H* H2O + 2e'
FIG. 6. Mécanisme le plus probable pour la transformation de la nitrapyrine par Nitrosomona eiiropaea.(ymni\\ï 8c Hooper 1993).
IL 3. 3. Rôle fonctionnel de l’oxydation du méthane par les bactéries nitrosantes
Nitrosomonas europaea et Nitrosomonas oceanus peuvent oxyder le méthane en C02 (Jones & Morita 1983). L’oxydation de l’ammoniac par Nitrosomonas est inhibée d’une façon compétitive par le méthane (Suziki et al. 1976). Ce qui suggère que la même enzyme agisse.
La séquence du gène amoA de Nitrosococcus (subdivision y des preotéobactéries) diffère plus de la séquence du gène amoA de Nitrosomonas (subdivision P des protéobactéries) que de la séquence du gène pmmoA (sous unité de la méthane monooxygènase ) des bactéries méthanotrophes de la subdivision y et P (Murrell & Holmes 1996). Par contre, l’AMO de Nitrosomonas a plus d’affinité pour l’ammoniac que le méthane (Hyman & Wood 1983).
Chez Nitrosococcus oceanus il apparaît que l’affinité est similaire pour les deux substrats (Ward, 1987). Ceci suggère que l’AMO et la MMO aient le même gène ancestral (Holmes et al. 1995) et que l’AMO des nitrosantes de la subdivision P a évolué pour se spécialiser dans l’oxydation de l’ammoniac, alors que celle de la subdivision y a évolué pour se spécialiser dans l’oxydation de l’ammoniac et du méthane.
la littérature, l’oxydation d’autres composés que l’ammoniac est considérée comme une perte d’énergie. Cependant, Ward 1987 a montré qu’une fraction du carbone du méthane est incorporée au niveau des cellules de Nitrosococcus. La même observation est faite en cas d’oxydation du CO (Jones & Morita 1983). L’oxydation du méthane en CO2 par l’AMO permet probablement d’approvisionner Mtro5occoc«5 en CO2 pour l’assimilation du carbone.
III. Nitratation
La plupart des études sur le processus de la nitratation ont été réalisées avec des espèces du genre Nitrobacter et plus particulièrement avec N. winograskyi. Les espèces du genre Nitrobacter sont les premières des bactéries nitratantes qui ont été isolées et elles représentent dans les sols le plus important agent microbien responsable de la transformation du nitrite en nitrate (Bock & Koops 1991).
III. 1. Biochimie de la nitratation
Les mécanismes biochimiques de la nitratation ne sont pas encore bien connus. Mais il semblerait que la réaction soit plus directe avec une oxydase et nécessite une chaîne de transport d’électrons localisée au niveau de la membrane cytoplasmique pour la production d’énergie (Bock et al. 1991 , Hooper 1989 ; Yamanaka & Fukumori 1988). Le transfert des électrons du nitrite à l’oxygène passe à travers des composants membranaires : la nitrite oxydoréductase, le cytochrome c et le cytochrome c oxydase (Fig. 7). Ces composés ont été purifiés et caractérisés ( Bock et al. 1991 ; Meincke et al. 1992 ; Nomoto et al. 1993) mais seules la nitrite oxydoréductase et les cytochrome c oxydase ont été clonées et séquencées (Kirstein & Bock 1993, Berben 1996).
Periplasme
Cytoplasme
FIG. 7. Arrangement des enzymes et des transporteurs des électrons
intervenant dans la nitratation chez Nitrobacter. NO-nitrite oxidase.
HL 2. L ’autotrophie de Nitrobacter ?
Les bactéries nitratantes sont des chémolithotrophes : elles utilisent l’énergie d’oxydation des nitrites pour synthétiser leur matière organique à partir du CO2. Cependant l’autotrophie de Nitrobacter est considérée comme facultative du fait qu’il peut croître dans un milieu de culture en absence d’oxydation du nitrite mais en présence de certaines sources de carbone organique comme l’acétate, le glycérol, le pyruvate ou le formate (ida &
Alexander 1965 , Delwiche & Finstein 1965). Nitrobacter peut aussi croître d’une manière mixotrophe en présence de nitrite et d’une source de carbone organique mais sa prolifération est plus rapide en présence du nitrite.
Dans le sol, l’organotrophie de Nitrobacter n’a pas été montrée. Certaines observation montrent cependant que ce processus peut exister dans les milieux naturels. Dans les sols, le nombre des bactéries nitratantes est généralement plus important que celui des bactéries
est plus importante que celle fournie par l’oxydation d’une mole de nitrite.
Dans une culture en continue ( verhagen et al. 1991) et dans une colonne de sol stérile ( verhagen et al. 1992 ) en présence de N. europaea, de N. winogradskyi et d’une bactérie hétérotrophe A. globiformis et dans les conditions limitées en ammonium et des concentrations élevées en glucose, on observe une stimulation de la prolifération de Nitrobacter. Verhagen et al.(1991 et 1992) ont conclu que dans ces conditions limitées en ammonium, le surplus du glucose est utilisé par les bactéries hétérotrophes qui l’excrètent sous une autre forme organique qui est utilisée par Nitrobacter.
Hockerbury et al. (1977) ont rapporté que l’addition du filtrat d’une culture mixte de bactéries hétérotrophes à une culture de Nitrobacter stimule la prolifération de ce dernier. La même observation a été rapportée (Bock et al. 1992) en cas d’addition de 10% du filtrat d’une culture de Pseudomonas sp. Il est probable que dans les milieux naturels comme le sol, Nitrobacter peut croître par l’assimilation de certains composés organiques excrétés par les bactéries hétérotrophes.
V. Phylosènie des nitrifiants
Actuellement on reconnaît une diversité en genres et en espèces des bactéries nitrosantes qui incluent, Nitrosomonas, avec 10 espèces (Jones et al. 1988 , Koops et al.
1991 ; Winogradsky, S. lS92),Nitrosococcus{winogradsky, S. 1892), avec 3 espèces (Koops et al. 1990 , 1976 , Winogradsky, S. 1892), Nitrosospira, avec 1 espèce (Watson 1971 , Winogradsky, S. & Winogradsky, H. 1933) et 4 autres espèces déterminées par homologie de l’ADNr 16S (Koops & Harms 1985), Nitrosovibrio, avec une seule espèce (Harms et al.
1976) et une autre espèce déterminée par homologie de l’ADNr 16S (Koops & Harms 1985), et Nitrosolobus avec une seule espèce (Watson & Mandel 1971) et enfin une autre espèce obtenue par homologie de l’ADNr 16S (Koops & Harms 1985).
Les bactéries nitratantes ont reçu moins d’attention, les genres reconnus sont Nitrobacter (Winogradsky 1892), avec 3 espèces (Book &Koops 1991 ; Book et al. 1990), Nitrospina (Watson & Watebury 1971), Nitrococcus (Watson & Watebury 1971), et Nitrospira (Watson et al. 1986), avec une seule espèce chacun.
Des études comparatives de séquences de TARN 16S ont montré que tous les nitrifiants sont des membres des Protéobactéries et sont dispersées dans ce groupe (Fig. 8) (Teske et al. 1994).
gamma-subOivision bcca-subdivision
Rhodocycius Callioncda «Nitrosomonas purpurcus terruginca marina Ectothiorhodosoira \ I / Nitrosomonas Arhodomonas halophila \ / / euiropha
aquaeolei Nitrococcus
mobiiis Nitrosococcus
oceanus Occanospinllum
linüm Eschcrichia
coli
Nitrosomonas europae Nitrosococcus mobiiis
Nitrosolobus
• ' multiformis Nitrosovibrio br'ensis^^”^'’
tenuis
Nitrosoina, graciiis
ipacific)^. ... .—V iNitro^ina xamhus
^anrio) Wolinella' succinogenes
R^iodopseudomonas marina Agrobactenum
tumcraciens Rhcdopseudomonas
paluscris Nitrobacter haniburgensis Nitrobacter
«ônogradskyi Rhodopscudomonas acidophila
ddia-subdivision epsilon-subdivision alpha-subdivision I
FIG. 8. Localisation des nitrifiants dans la classe des Proteobactéries.
Des analyses phylogénétiques récentes ( Head et al, 1993) recommandent
que les genres Nitrosospira, Nitrosovibrio et Nitrosolobus soient combinés dans un seul genre, le genre Nitrosospira. Cette étude recommande aussi l’affiliation de Nitrosococcus mobilis au genre Nitrosomonas. Les bactéries nitrosantes constituent avec une seule exception {Nitrosococcus ocearrus) une seule lignée phylogénétique de la subdivision bêta de la classe des protéobactéries. Il n’y a pas de bactéries nitratantes affiliées à cette subdivision. L’analyse de la séquence de l’ARN 16S indique un degré élevé d’homogénéité génétique chez les bactéries nitrosantes (Head et al. 1993).
Le genre Nitrobacter constitue dans le sol l’agent microbien le plus important responsable de la transformation du nitrite en nitrate. Ce genre regroupe 3 espèces, Nitrobacter sp, et Nitrobacter winogradskyi qui se distinguent entre eux par un seul nucléotide au niveau de l’ADNr 16S ( E. coli position, C/U) et enfin Nitobacter hamburgensis qui diffère des deux autres par 10 nucléotides. Le faible degré de la diversité génétique à l’intérieur de ce genre suggère qu’il représente un groupe phylogénétique récent (Teske et al.
1994).
Généralement les bactéries nitrifiantes possèdent une membrane intracytoplasmique fortement invaginée ( Watson et al. 1989) (Figures 9). La relation phylogénétique très proche des bactéries photosynthétiques et des bactéries nitrifiantes laisse penser que la structure membranaire de ces dernières proviennent des bactéries photosynthétiques. Ainsi les bactéries nitrifiantes ont évolué à partir des bactéries photosynthétiques comme le cas de la majorité des bactéries chémo-lithotrophes (Head et al, 1993 , Teske et al. 1994).
Fig. 9. Représentation des cellules de Nitrosococcus (A) et Nitrobacter (B)
montrant les invaginations de la membrane intracytoplasmique.
V. Nitrification dans les conditions de stress
V. 1. Nitrification à faible concentration en oxysène
A faible concentration en oxygène, les bactéries nitrifiantes du sol produisent une quantité significative de N2O (Bremner & Blackmer, 1978b), NO (Goreau et al. 1980 , Lipschulz et al. 1981) et probablement N2 (Poth, 1986). Les nitrifiants du sol participent à la production de ces gaz avec une quantité comparable à celle produite par les dénitrifiants (Anderson & Levine, 1986). La production du N2O dans le sol est observée au cours de la nitrification de l’azote utilisé comme fertilisant (Bremner & Blackmer, 1978b). La production
application des inhibiteurs de la nitrification comme l’acétylène ou la nitrapyrine (Bremner &
Blackmer, 1979 , Aulakh et al. 1984)
In vitro, l’oxydation de l’hydroxylamine en NO est catalysée par l’hydroxylamine oxydase (Hooper & terry, 1979), il peut être aussi produit à partir du nitrite (Hooper, 1968) par la nitrite réductase (Miller & Wood 1983 ; Dispirito et al. 1985). Le N2O peut être produit à partir du nitrite au cours de l’oxydation de l’hydroxylamine (Ritchien and Nicholas, 1972).
V. 2. Nitrification à pH acide
Plusieurs études ont suggéré que la faible nitrification dans un sol acide et/ou peu fertilisé soit due à l’effet de ces deux facteurs sur l’activité des bactéries nitrifiantes et non à l’inhibition par la matière organique (Montes & Christensen 1979, Brar & Giddens 1968 ; Sahrawat et al. 1985). Il est connu actuellement que la nitrification diminue avec la diminution du pH du sol (Schmidt 1982 , Dancer et al. 1973 , Hankinson & Schmidt 1984).
Un pH de 4 représente la limite inférieure pour la nitrification dans les sols (Schmidt 1982).
Dans un milieu de culture à pH 5.0, Nitrosomonas europaea peut oxyder l’hydroxylamine et non l’ammonium. Ceci suggère que l’oxydation de l’ammonium en hydroxylamine est l’étape sensible aux pH acides (Frijlink et al. 1992).
Il apparaît qu’au lieu du NHU"^, le NH3 est le substrat de l’AMO, enzyme clef dans le processus de la nitrification autotrophe (Suzuki et al. 1974). Ainsi la nitrification faible dans les sols et les milieux de culture acides est due à la non-disponibilité du substrat du fait que l’ammonium est plus stable dans les conditions acides (pK nh3/nh40h =9.25).
La nitrification dans les sols acides est stimulée par l’amendement avec du CaC03 ou l’urée. L’étude réalisée par Martikainin (1985) montre que la stimulation de la nitrification par l’urée est due à une augmentation du pH et non à l’augmentation de la concentration de l’ammonium par hydrolyse de l’urée du fait que l’addition du NH4NO3 ne stimule pas la nitrification.
Dans les sols acides la nitrification est limitée mais n’est pas absente, peu d’espèces des bactéries nitrosantes ont été isolées à partir de ces sols, mais elles représentent tous les genres dominants dans les sols ( Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosomonas, Nitrosovibrio) (Vitousek et al. 1982 , Hankinson & schmidt 1984 , Bhuiya & Walker 1977 , Martikainen &
Nurmiaho-L 1985). Parmi ces genres Nitrosospira est le plus fréquemment isolé, mais il n’est pas tolérant pour l’acidité (Hankinson & schmidt 1984, Allison & Prosser 1991) du fait qu’il ne prolifère pas dans un milieu de culture à pH < 6.2. Ceci suggère que la nitrification dans les sols acide soit limitée à des micro-niches avec des pH neutres.
V. 3. Nitrification dans les sols limités en ammonium
Dans les sols riches en carbone et limité en ammonium comme c’est le cas des prairies permanentes, on observe généralement une faible production de nitrate (Greenland 1958 , Richardson 1938). Ces sols sont caractérisés généralement par un nombre faible de nitrifiants par rapport à d’autres sols avec une autre végétation (Berlier et al. 1956 , Meiklejohn 1962 , 1968). Une possibilité d’interprétation de ces observations est fournie par l’étude réalisée par Verhagen & Laanbroek (1991). Cette étude a montré que dans un milieu de culture limité en ammonium avec culture mixte de Nitrosomonas europaea, Nitrobacter winogradskyi, et Arthrobacter globiformis, la nitrification est inhibée par l’assimilation de l’ammonium par les
bactéries hétérotrophes qui sont plus compétitives que les nitrifiant pour ce substrat.
Le sort de l’ammonium dépend du rapport C/N utilisé dans le milieu de culture. A un rapport C/N faible, la prolifération des bactéries hétérotrophes est limitée par le carbone, et l’ammonium en surplus est utilisé par la nitrification. Dans un milieu où l’azote est limitant et le rapport C/N est élevé, la nitrification est inhibée par l’épuisement du milieu en ammonium par les hétérotrophes. Ceci suggère que la matière organique n’inhibe pas la nitrification en agissant sur les bactéries nitrifiantes comme on a pensé pendant longtemps, mais elle stimule l’assimilation de l’azote par les bactéries hétérotrophe qui apparaissent plus compétitives pour ce dernier que les nitrifiants.
Chapitre II
Les approches conventionnelles et moléculaires de Vécologie des nitrifiants du sol
/. Introduction
L’écologie microbienne se définie comme la science étudiant les relations des micro
organismes entre eux et avec leur environnement. Deux niveaux d’études peuvent être utilisés : un niveau populationnel cherchant à comprendre l’évolution de ces structures suite à différents types de stimuli d’ordre naturel (la présence et le développement d’une plante par exemple) ou artificiels (l’arrivée de composés xénobiotiques par exemple) et un second niveau correspondant aux activités que vont exercer ces micro-organismes, La connaissance de la structure et de l’activité de ces communautés microbiennes et leur réponse à des stimuli sont indispensables à la compréhension de leur fonctionnement.
Le sol est un environnement complexe qui peut être considéré comme le principal réservoir de la diversité bactérienne. L’étude des communautés microbiennes associées au sol montre que les micro-organismes sont abondamment représentés : 10 bactéries dont 10 actinomycètes, 10^ champignons et 10^ protozoaires par grammes de sol (Robert & Chenu
1992). Cette matrice et aussi un environnement hétérogène constituée de particules minérales et organiques, qui peuvent s’organiser en agrégats de taille et de stabilité variables. Ces matrices de par leur constitution physique, leur composition chimique ou biologique, représentent autant de microhabitats particuliers pour les bactéries indigènes (Hatori 1988 ; Kilbertus 1980 ; Foster 1988 , Ranjard et al. 1997). Cette multitude de microhabitats génère de nombreuses conditions environnementales, contribuant ainsi au maintien et au développement de la diversité bactérienne.
Concernant le second niveau, les activités que ces micro-organismes peuvent réaliser sont extrêmement importantes. Au sein de cette microflore les bactéries sont impliquées dans des processus majeurs tels que la structuration et la fertilité des sols comprenant les cycles de la transformation des éléments (carbone, azote, phosphore, soufre etc.,,,) mais aussi de nombreuses autres fonctions (Brock et al 1984 ; Leung et al. 1994).
La structure des communautés microbiennes naturelles a pendant plusieurs années été étudiée par des méthodologies reposant sur l’isolement et la culture des micro-organismes.
D’autre part, le suivi de l’activité a souvent considéré le sol comme une boite noire. Or il est aujourd’hui bien établi que ces approches ne prennent en considération qu’une infime portion
voire 10% la proportion des cellules cultivables (Alexander 1977 , Amann et al. 1995 , Ward et al. 1990 , Roszack & Colwell 1987 ; Staley et Konopka 1985).
En outre de ces limitations techniques qui s’ofïfent aux investigateurs de l’écologie microbienne du sol en général, les bactéries nitrifiantes ne se prêtent pas facilement à l’examen même par les techniques microbiologique habituelles. L’obtention de colonies sur milieu solide est pratiquement impossible, même sur un milieu strictement minéral, du fait que la matière organique introduite avec l’inoculant permet la croissance des bactéries hétérotrophes. L’isolement est difficile et il est précédé par une série de procédures d’enrichissement. Une fois isolées, les bactéries nitrifiantes croissent lentement et sont susceptibles de contamination (Allison and Prosser 1991). L’exploration de l’écologie des bactéries nitrifiantes du sol et d’autres habitats est limitée par la complexité de ces systèmes et la spécialisation métabolique de ces bactéries. Deux aspects écologiques des nitrifiants du sol restent pratiquement inexplorés : la diversité et l’activité in situ. Actuellement, les techniques de biologie moléculaire se montrent plus prometteuses pour l’exploration de l’écologie des nitrifiants.
II. Méthodes conventionnelles
IL 1. Technique de MPN (Most Probable Number)
Les méthodes microbiologique traditionnelles de dénombrement microbien, tel que le dénombrement sur milieu solide sélectif ne sont pas utilisables pour les bactéries nitrifiantes.
MPN est la méthode la plus utilisée pour le dénombrement des nitrifiants du sol (Alexander &
Clark 1965 , Matulewich et al. 1975). Dans cette méthode les plaques de culture de 24 puits (Rowe et al. 1977) et un milieu minéral (Schmith & Belser 1982) sont utilisées. Une série de dilutions de la suspension du sol, permettent d’inoculer les plaques de culture contenant le milieu minéral avec de l’ammonium ou du nitrite pour le dénombrement respectivement des bactéries nitrosantes et nitratantes. Après incubation on détermine les puits contenant ou non du nitrite respectivement pour les bactéries nitrosantes et nitratantes. MPN est calculé à partir de ces résultats à l’aide d’une table statistique (Cochran 1950).
Le MPN est une méthode indirecte qui permet d’estimer statistiquement le nombre des bactéries nitrifiantes du sol. Le nombre déterminé par cette méthode dépend de deux facteurs : en premier, du milieu et des conditions de culture, qui doivent permettre la prolifération seulement et de toutes les bactéries nitrifiantes. En deuxième lieu les bactéries présentes dans l’échantillon doivent être suffisamment séparées des constituants du sol et individuellement dispersés. Il est pratiquement impossible de mettre en œuvre ces conditions, ce qui donne généralement une sous estimation du nombre de ces bactéries (Alexander & Clark 1965).
V. 2. L'activité potentielle des nitrifiants du sol
La mesure de l’activité potentielle des nitrifiants à été utilisé à l’origine pour l’analyse de la cinétique de la nitrification dans les milieux aquatiques (Knowles et al. 1965). Elle permet en comparant avec la cinétique d’une culture pure d’estimer la biomasse des nitrifiants des milieux naturels. En utilisant une suspension de sol, elle permet aussi pour un sol d’estimer indirectement le nombre des nitrifiants. (Schmidt & Belser 1982). Cette mesure ne représente pas l’activité in situ des nitrifiants mais une mesure du système enzymatique disponible pour l’oxydation de l’ammonium ou du nitrite. Cette méthode implique la mesure de l’activité des nitrifiants endogènes après l’addition du substrat, pendant un temps qui ne permet pas une augmentation significative de la biomasse des nitrifiants et dans les conditions optimales de température, d’humidité et de pH.
V. 3. Nitrification potentielle du sol
Cette procédure consiste à incuber le sol dans des conditions favorables de température, d’humidité, de substrat et la mesure du nitrate produit au cours de l’incubation.
Dans le sol non amendé par l’ammonium la production du nitrate est limitée par la minéralisation de l’azote organique du sol. Dans le sol amendé, le substrat de la nitrification n’est pas le facteur limitant et la population des nitrifiants augmente jusqu'à ce qu’elle soit limitée par d’autres facteurs.
de la nitrification dans des sols de propriétés différentes ou le même sol dans des conditions différentes (Schmith & Belser 1982).
III. Méthodes moléculaires
III. 1. Introduction
Dans un premier temps, la biologie moléculaire appliquée aux isolats bactériens a permis de compléter la caractérisation phénotypique (Watson et al, 1989) par une caractérisation génotypique permettant ainsi la mise en place d’une taxonomie bactérienne plus fiable (Woese et al. 1984). Cette caractérisation repose en général sur l’étude d’une portion de ce génome tel que les séquences de l’ADN ou de l’ARN ribosomiques et plus particulièrement l’ARNr 16S ( Head et al. 1993 ; Orso et al. 1994). Ces derniers ont par ailleurs permis d’aborder un nouveau champ d’investigation celui de la phylogénie et de l’évolution des bactéries (Teske et al. 1994).
Au cours de ces dernières années, l’utilisation conjointe des données sur les séquences d’ADN et les progrès accomplis dans le domaine de la biologie moléculaire (PCR, clonage, séquençage,...) ont permis le développement de méthodologies occultant les étapes d’isolement et de culture des bactéries. Ces nouvelles méthodes d’analyse ayant pour objectifs d’utiliser ces techniques in situ permettent d’affiner nos connaissances sur la structure des communautés bactériennes du sol. Toutefois par le terme in situ sensu lato deux types d’approches ont été développées :
(i) celles visant, par le biais d’hybridation des acides nucléiques à l’intérieur des cellules non lysées, à identifier, quantifier, localiser les micro-organismes dans leur milieu mais aussi à déterminer leurs activités métaboliques. Récemment cette approche à été appliqué pour étudier l’abondance et l’organisation des bactéries nitrifiantes dans les boues activées (Mobarry et al. 1996 , Juretschko et al. 1998 , Wagner et al 1996). Dans des environnements comme le sol, l’application de telles techniques a été longtemps retardée du fait de l’hétérogénéité de ce milieu, de sa complexité en particulier liée à l’autofluorescence
des composés du sol (Amann et al., 1995); les avancées techniques récentes laissent présager qu’elles pourront être employées à très court terme.
(ii) plus facilement réalisables, les techniques visant à extraire directement les acides nucléiques du sol afin de leur appliquer les méthodes moléculaires précédemment réservées aux isolats, sont déjà réalisées. Révolutionnant la microbiologie classique, ces techniques présentent l’avantage de s’affranchir de l’étape d’isolement in vitro des micro-organismes.
III. 2. Extraction des acides nucléiques du sol
Deux types de méthodes ont été développées pour obtenir de l’ADN bactérien. Une dite d’extraction indirecte, consiste à isoler la fraction bactérienne de la matrice du sol afin de la traiter comme une culture bactérienne en utilisant les méthodes classiques de lyse bactérienne, d’isolement et de purification de l’ADN. L’isolement des micro-organismes du sol débute par leur mise en suspension dans une solution d’un dispersant. Un passage au mixeur (Faegri et al. 1977), le vortexage (Pillai et al. 1991) ou encore une agitation orbitale vigoureuse (Jacobsen & Rasmussen 1992) de la suspension favorisent le décrochage des micro-organismes des particules du sol. Quelle que soit la technique de décrochage employée, l’intensité de son application à l’échantillon de sol doit être adaptée pour éviter une lyse cellulaire excessive durant cette étape. La séparation de la fi-action bactérienne des autres constituants du sol se fait par centrifugation ménagée (Torsvik & Goksoyr 1978), par gradient de densité (Bakken 1985) ou par une résine échangeuse de cations (Jacobsen & Rasmussen 1992).
Par ces façons d’agir, on exclut l’essentiel de la fraction fongique sous forme de mycélium (Faegri et al. 1977) ainsi que la forme filamenteuse des actinomycètes (Hilger &
Myrold 1991) de la communauté microbienne car les hyphes précipitent avec les débris inertes. Ajoutant aussi qu’il est impossible d’extraire la totalité des bactéries. Le rendement en bactéries récupérées se situe, selon le type de sol, entre 30 et 80% (Faedri et al. 1977, Bakken 1985, Holben et al. 1988). Toutefois, Ces techniques ont l’avantage de permettre l’obtention d’ADN de bonne qualité et ne considèrent pas l’ADN extracellulaire présent dans le sol.
