Extraction des acides nucléiques du sol

Deux types de méthodes ont été développées pour obtenir de l’ADN bactérien. Une dite d’extraction indirecte, consiste à isoler la fraction bactérienne de la matrice du sol afin de la traiter comme une culture bactérienne en utilisant les méthodes classiques de lyse bactérienne, d’isolement et de purification de l’ADN. L’isolement des micro-organismes du sol débute par leur mise en suspension dans une solution d’un dispersant. Un passage au mixeur (Faegri et al. 1977), le vortexage (Pillai et al. 1991) ou encore une agitation orbitale vigoureuse (Jacobsen & Rasmussen 1992) de la suspension favorisent le décrochage des micro-organismes des particules du sol. Quelle que soit la technique de décrochage employée, l’intensité de son application à l’échantillon de sol doit être adaptée pour éviter une lyse cellulaire excessive durant cette étape. La séparation de la fi-action bactérienne des autres constituants du sol se fait par centrifugation ménagée (Torsvik & Goksoyr 1978), par gradient de densité (Bakken 1985) ou par une résine échangeuse de cations (Jacobsen & Rasmussen 1992).

Par ces façons d’agir, on exclut l’essentiel de la fraction fongique sous forme de mycélium (Faegri et al. 1977) ainsi que la forme filamenteuse des actinomycètes (Hilger & Myrold 1991) de la communauté microbienne car les hyphes précipitent avec les débris inertes. Ajoutant aussi qu’il est impossible d’extraire la totalité des bactéries. Le rendement en bactéries récupérées se situe, selon le type de sol, entre 30 et 80% (Faedri et al. 1977, Bakken 1985, Holben et al. 1988). Toutefois, Ces techniques ont l’avantage de permettre l’obtention d’ADN de bonne qualité et ne considèrent pas l’ADN extracellulaire présent dans le sol.

La seconde stratégie, plus novatrice, consiste à lyser in situ les cellules bactériennes avant d’extraire la totalité des acides nucléiques hors de la matrice sol et leur appliquer des traitements de purification. Le grand défi de ces techniques était de s’affranchir le plus possible de biais méthodologiques afin que les acides nucléiques extraits et purifiés soient les plus représentatifs de la microflore originellement présente dans l’échantillon étudié. Au cours de ces dernières années, de nombreux protocoles ont été développés dans le but d’optimiser le rendement et la qualité de l’ADN extraites.

III. 2. 1. Extraction d’ADN à partir du sol

L’objectif de ces approches est d’avoir une lyse la plus exhaustive possible pour obtenir de l’ADN le plus représentatif des communautés microbiennes réelles. Pour cela, differents protocoles de lyse impliquant des traitements physiques comme le broyage, la sonication ou les chocs thermiques (Picard et al. 1992), ou des traitements chimiques (Zhou et al. 1996) ont été élaborés. Les premiers s’accompagnent généralement d’une dégradation de l’ADN générant des fragments de 5 à 10Kb (Liesack et al. 1991) voire de plus petite taille, 100 à 500 pb (Simonet et al. 1991). Cette dégradation peut représenter un inconvénient si cet ADN est utilisé comme matrice pour des réactions d’amplification par PCR c’est à dire un risque de formation de chimères augmenté par l’abondance de fragments d’ADN de faibles poids moléculaires. (Liesack et stackebrandt. 1992). Cependant, le broyage présente l’avantage de déstructurer le sol entraînant une homogénéisation et permettant d’accéder aux populations localisées à l’intérieur des agrégats. Les méthodes de lyse chimiques et/ou enzymatique donnent un rendement comparable à celui des techniques physiques avec pour avantage une moindre dégradation de l’ADN. Cependant, elles utilisent des détergents qui sont des inhibiteurs de nombreuses réactions enzymatiques et génèrent généralement une coextraction plus importante. Des protocoles peuvent également combiner certains types de ces protocoles (Volossiok et al. 1995, Yeates et al. 1997). Ils doivent prendre en compte :

(i) l’obtention d’ADN le plus représentatif possible de la communauté, (ii) un ADN peu dégradé, (iii) un ADN peu contaminé. Tous ces traitements doivent, néanmoins, être suivis d’une étape de séparation et de purification (phénol, chloroforme, éthanol). Quelle que soit la méthode utilisée, les extraits de d’ADN demeurent contaminés par d’autres composés

(substances humiques) coextraits pouvant réduire l’efficacité des étapes ultérieures de détection et de caractérisation. En effet ces contaminants peuvent :

(i) inhiber l’activité enzymatique de la Taq polymérase dans les réactions

d’amplification par PCR (Smalla et al. 1993. Tsai & Oison 1992) et des enzymes de restriction ( Porteous et al. 1997) (ii) diminuer l’efficacité des hybridations ADN/ADN (Tebbe et Vahjen 1993). Il est donc indispensable de purifier l’ADN extrait.

III. 2. 2. Purification

L’importance de la contamination est intimement liée à la teneur et la nature de la matière organique présente dans les échantillons de sol traités. Différentes méthodes de purification ont été développées pour séparer l’ADN des produits de coextraction. Cette séparation est basée sur la différence de charges ou de taille entre l’ADN et ces substances et fait intervenir des matrices de polymères (Alm &Stahl 1996, Holben et al. 1988, Steffan et Atlas 1988, Young et al. 1993) le conditionnement de ces polymères en minicolonnes a simplifié leur utilisation et a rendu plus rapide cette purification. L’un des polymères le plus utilisé est le Sephadex G-200 (Erb & Wagner-Dôbler 1993, Tsai & Oison 1992, Jackson et al. 1997). Une alternative à cette méthodologie est de purifier l’ADN par migration et extraction à partir de gel d’agarose (Myrold et al. 1995).

HL 3. Caractérisation de la structure de la diversité des bactéries nitrifiantes

L’une des séquences cibles les plus utilisées est le gène codant pour l’ARN ribosomique 16S (ADNr 16S). Ce gène contient une information qui en fait un excellent biomarqueur des bactéries. En effet, il contient des régions hautement conservées trouvés dans toutes les bactéries et des régions variables spécifiques de groupes bactériens phylogénétiquement proches.

La comparaison de la séquence du gène de l’AMO des espèces du genre Nitrosospira ( Rotthauwe et al. 1995) a permis de montrer que ce gène peut être aussi utilisé comme biomarqueur pour différencier les bactéries nitrosantes les unes des autres même celles les plus proches de point de vue phylogénétique. L’utilisation d’amorces PCR spécifique à ce

gène a permis d’analyser la diversité des bactéries nitrosantes dans plusieurs écosystèmes (Rotthauwe et al. 1997). Dernièrement cette approche a été utilisée pour étudier l’effet de la contamination du sol par des métaux lourds sur les bactéries nitrosantes (Stephen et al. 1999).

Grâce à la technique d’amplification par PCR de nouvelles approches ont été développées qui permettent de cibler un biomarqueur pour analyser la structure des communautés bactériennes. L’utilisation d’amorces PCR spécifique d’une région génétique définie a priori, permet d’obtenir rapidement un grand nombre de copies d’une séquence cible au sein d’un mélange complexe d’ADN. Toutefois, les méthodes utilisant la PCR doivent prendre en considération les biais liés à cette technique pour l’analyse des données. Les principaux biais de cette technique sont (i) l’amplification non spécifique, (ii) la création de séquences recombinantes ou chimères et (iii) l’amplification préférentielle.

Les conditions de la PCR (nombre de cycles), l’utilisation d’ADN fortement dégradé (faible poids moléculaire), la quantité d’ADN cible, peuvent fortement influencer la reproductibilité et l’efficacité de la PCR par la formation de molécules chimériques (Liesack et al. 1991, Wison 1997, Chandler et al. 1997). La fréquence de production de ces molécules est approximativement de 10% quand on réalise une amplification par PCR de deux séquences présentant 82% d’homologie, mais peut augmenter jusqu’à 30% de produit final dans une coamplification de séquences très proches (Wang & Wang 1997). L’amplification préférentielle dépend aussi du nombre de cycles d’amplification mais encore de facteurs tels que la nature de l’ADN matrice (% G+C), la nature des amorces et les conditions d’hybridation (Suzuki et Giovannoni 1996, Farrelly et al. 1995, Chandler et al. 1997). Il en résulte que la coamplification par PCR d’un mélange de séquences cibles peut favoriser ou défavoriser l’obtention de certaines séquences présentes dans l’ADN extrait du sol et donc une mauvaise estimation du nombre de cibles relatives à l’origine. Ainsi, il reste indispensable de vérifier la représentativité des séquences obtenues par comparaison avec les bases de données (Larsen et al. 1993), mais aussi de pallier aux problèmes d’amplification préférentielle par l’utilisation de plusieurs cibles ou par dilution de la solution d’ADN de départ. Néanmoins, la technique d’amplification par PCR a permis de pouvoir aborder la diversité microbienne des sols de manière qualitative.

III. 3. 1. Analyse par clonage

L’une des premières approches pour étudier la diversité de la communauté microbienne dans le sol est de construire une banque de clones à partir de séquences d’ADNr 16S obtenue par PCR sur l’ADN extrait du sol. Le clonage permet de séparer les séquences les unes des autres et ainsi de pouvoir les analyser d’une manière individuelle par PCR/RFLP et/ou par séquençage. Les principaux désavantage d’une telle approche sont d’une part son aspect laborieux et d’une part les biais dus à la stratégie de clonage employée influençant directement l’échantillonnage des séquences d’ADNr 16S clonées.

Cette approche a permis en premier lieu d’étudier la diversité des bactéries nitrosantes des eaux marines après enrichissement par incubation de ces eaux amendées par du sulfate d’ammonium, et subculture dans un milieu minéral (McCaig et al. 1994). L’analyse par clonage a permis aussi d’étudier la diversité des bactéries nitrosantes du sol et des eaux marines mais sans passer par des étapes d’enrichissement (Stephen et al. 1996). Cette étude a aussi montré que les séquences des bactéries nitrosantes dérivant des sols et des eaux marines peuvent être subdivisées en 7 groupes (Fig. 10), dont 4 sont nouveaux et qui ne sont pas représentés par des isolats. Ceci suggère que l’emichissement sélectionne certains groupes des bactéries nitrosantes.

S'ilrosomonas curopcea , Nitmxnmnnas euimpha '' Nilrosomonas marina ' SUrvsococoiS mobilis PH-1.2.V23 pH7B/Z: ?H7a37 — Silrtysomonas urtae j pH4.:a,'c: SHtmxattpira sp. AHB 1 pH-t.lVfi ?HiU’ri2 Sitmxnspira sp. T7 Nitmsospira sp. 36 p- 34-3 S'ilrosospira sp. DI l p— tnv.AZ f Sumsnsptra sp. CM4 PJ \\‘ilrosospira sp. -iOKÎ L-PH4.2.V3E (—B4-2 L-34-1 r" pH7C'56 -M— Enr-2D5 ^ pH7C/5ô SitrosQspira hriensis — Nitrososptra mulfi/ormis P-?H4.2A/3F 33*5 —»33-6 -33-4 • 33-3 .33-2 33-1 ?H7B;D3 ^ .Vilmsofpira tenuû NVl Nhrosospira sp. AF ^ Sitmsospira sp. Ll 15 Sitroxospira lenuix NV 12 E.1V.A2-: Alb.M3 Env3M7 HnvC-23 -3X-I Cnmamnnax texinxtcmni — isriovorax paradoxus . A:oarvJS indfgcns - Rhodocyclus puroureus CalUoneila ferrjÿtnca . Zooglea ramigera Alct^li^enes faccalix - Spihllum volulans Cluster 5 Cluster 7 Cluster 6 Cluster 2 J Nitrosomonas and Nitrosomonas-like sequences Cluster 4 Cluster ^ Cluster l Nitrosospira and Nitrosospira-like sequences Ifiethylnprnlux methylntmphux ■■ Miiirylobcdllus jlagellatum Metliylomnnax meihylovnra — TiiiohacUlux thioparux ' Chmmnhacterium violaceum ■ Neisxeria gonorrhucae j ■ Escherichia cnii Other 6-subgroup proteobacteria --- = 1%

Fig. 10. Diversité et relation phylogénétique des bactéries nitrosantes de la

III. 3. 2. Analyse par séparation sur sel avec gradient de dénaturation (DGGE)

Récemment des approches plus rapides, toujours basées sur une amplification par PCR et évitant l’élaboration d’une banque de clones, ont été développées. Ces techniques sont dépendantes des conditions de dénaturation des amplifiats et basées sur l’électrophorèse des produits de la PCR en présence d’un gradient dénaturant. L’agent dénaturant peut être chimique (urée et formamide) DGGE (denaturating gradient gel elelectrphoresis) ou physique TGGE (température gradient gel electrophoresis) (Muyser et al., 1993, 1996).

Le DGGE a été originalement développé et utilisé dans le domaine de recherche biomédicale pour l’analyse des mutations (Borresen et al. 1988 ; Cariello et al. 1988 ; Fischer & Lerman 1983 , Myers et al. 1987).

Dans ce type d’électrophorèse les fragments d’ADN de même taille mais de séquences différentes peuvent être séparés. La séparation dans le DGGE est basée sur la mobilité électrophorétique de l’ADN partiellement dénaturé dans le gel de polyacrylamide contenant un gradient linéaire croissant du dénaturant (urée et formamide). En effet la mobilité de la molécule d’ADN partiellement dénaturée est réduite par rapport à celle d’une molécule entièrement double brin. Au cours de l’électrophorèse de l’ADN dans un gel contenant un gradient linéaire du dénaturant, les fragments d’ADN sont sous forme double brin jusqu’au ce qu’ils rencontrent des conditions dans le gel qui vont permettre la dénaturation en premier lieu des domaines de l’ADN qui ont la plus faible température de fusion (Tm). La variation de séquences au niveau de chaque domaine est la cause de la différence de Tm entre les séquences. Ainsi la variation de séquences entre les fragments donne des vitesses de migration différentes, d’où des positions différentes sur le gel. L’addition d’un fragment riche en GC (40-45 GC) du côté 5’ de l’amorce sens (Fig. 11 A) prévient la dénaturation complète du produit de la PCR et augmente le degré de séparation des séquences (Myers et al. 1987 , Sheffield et al. 1989).

40-GC

16S rDNA

B

C Nitrosomonas Nitrosospira '

Cl.5 Cl.s Cl.7 Cl. 1 Cl. 2^1.3 Clfî

Fig. 11. Représentation schématique du fragment amplifié pour le DGGE (A)

Il y a deux types de gel avec un gradient du dénaturant : gels perpendiculaire et parallèle. Dans le gel perpendiculaire le gradient du dénaturant est perpendiculaire à la direction de l’électrophorèse. Le produit de la PCR est déposé dans un puits formé le long du gel. Le résultat de l’électrophorèse est un motif sigmoigal (Fig. 11 B). Le gel perpendiculaire est utilisé pour la détermination du gradient qui va permettre une séparation optimale des séquences dans un gel parallèle. Dans ce dernier le gradient est parallèle à la direction de l’électrophorèse et le résultat de cette électrophorèse est une multitude de bandes sur le gel qui correspondent à des séquences différentes (Fig. 11 C).

L’analyse de la diversité des bactéries nitrosantes par le DGGE a été testée en premier lieu sur des isolats. L’amplification de l’ADNr 16S est réalisée par des amorces spécifiques pour les bactéries nitrosantes de la subdivision (5 de la classe des protéobactéries (Kowalchuk et al. 1997). L’utilisation de ces amorces et le DGGE, permet la séparation d’un grand nombre de séquences, mais certaines séquences qui sont cormues comme différentes, possèdent la même migration dans ce système. Le couplage de cette technique avec l’hybridation avec des sondes spécifiques pour les groupes des bactéries nitrosantes permet une analyse plus approfondie de la diversité (Stephen et al. 1998 , Kowalchuk et al. 1998). Pour une identification précise il faut que cette technique soit couplée avec le clonage et le séquençge.

Chapitre III

Le rôle des micro-organismes dans la bioremédiation des sols

L Introduction

Malgré que la bioremédiation des sols soit un terme relativement nouveau, elle décrit un phénomène qui a apparu avec le commencement de la vie. Une variété de composés naturels, toxiques et récalcitrants existent dans les sols, et la plupart sont naturellement minéralisés. La formation de la matière organique commence avec les plantes qui sont capables d’exploiter l’énergie solaire. Cette matière organique est une source d’énergie importante pour toute la chaîne alimentaire. Dans les écosystèmes terrestres, les déchets produits par la chaîne alimentaire se retrouvent dans le sol. Dans ces sols la matière organique est recyclée par divers organismes endogènes comme les bactéries, les champignons, les actinomycètes, les protozoaires, et les insectes. Les micro-organismes sont responsables de la minéralisation (transformation en C02) de la plus part de la matière organique. La matière organique résiduelle qui est difficilement minéralisable est incorporée en humus. L’étude de ce système naturel de bioremédiation des sols permettra de l’appliquer à l’assainissement des sols contaminés par des xénobiotiques (Gibson 1984 , Frantz et al. 1987 ; Evan & Fuchs 1988 , Cemiglia 1992 , Chaudhry & Chapalamadugu 1991 , Knackmuss 1996)

L’implantation de la bioremédiation des sols nécessite une coopération interdisciplinaire tel que la biologie des sols, la chimie des sols, et des experts en ingénierie. Malgré que la bioremédiation soit multidisciplinaire, elle nécessite en premier lieu des connaissances approfondies en écologie microbienne (Atlas 1981 ; Sims et al. 1990 ; Song et al. 1990 ; Pritchard & Costa 1991 , Dave et al. 1994 , LaBelle & Hadley 1994, Huesemann 1995).

IL L'activité microbienne dans le sol

Les micro-organismes sont omniprésents, vivent généralement dans des environnements hostiles, et ils ont l’habilité de transformer virtuellement toutes les formes de la matière organique. Ces caractéristiques font d’eux un excellent agent de la bioremédiation. Cependant l’activité microbienne possède certaines exigences, et il y a plusieurs raisons pour que les polluants organiques ne se dégradent pas plus rapidement dans un environnement tel que le sol : des concentrations très élevées en polluants, des quantités limitantes en accepteurs

favorables comme l’humidité, la température, le pH, la salinité, ...

Dans la nature la plupart de la matière organique est minéralisée dans des conditions aérobies, par l’utilisation de l’oxygène comme l’accepteur final des électrons (Alexander 1977 , Brunner & Focht 1983 , Atlas & Bartha 1987). Ce métabolisme est une caractéristique de la zone aérée du sol. Par contre dans les systèmes anaérobies d’autres accepteurs d’électrons interviennent dans le processus de la biodégradation (Casella & Payne 1996 , Young 1984). Les environnement anaérobies sont des conditions optimales pour les dénitrifiants (Berry et al. 1987), les méthanogènes (Healy & Young 1979), et les réducteurs du sulfate (Berry et al. 1987). Cependant, ces processus sont relativement très lents par rapport aux processus aérobies.

Le succès de la bioremédiation dépend d’un certains nombres de facteurs, qui incluent : 1) la concentration, la toxicité, et la bio-disponibilité du polluant au micro­ organismes. 2) la présence des nutriments inorganique indispensables pour la croissance microbienne 3) la présence d’une concentration appropriée en accepteurs d’électrons. 4) des conditions physico-chimiques favorables à la prolifération microbienne (Skladany & Metting

1993).