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Relations entre cellule hôte et bactéries pathogènes : l'amibe Dictyostelium discoideum comme modèle d'étude

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Academic year: 2022

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Thesis

Reference

Relations entre cellule hôte et bactéries pathogènes : l'amibe Dictyostelium discoideum comme modèle d'étude

LELONG-FAVRE ALBORINI, Emmanuelle

Abstract

Ma thèse porte sur l'étude des interactions entre les bactéries pathogènes et l'hôte qu'elles infectent. L'utilisation de l'amibe Dictyostelium discoideum, un phagocyte professionnel, m'a permis d'analyser d'une part la pathogénicité bactérienne, et d'autre part les mécanismes par lesquels une cellule phagocytaire tue les bactéries. J'ai étudié l'évolution de la virulence bactérienne de souches cliniques de Pseudomonas aeruginosa, au cours de l'infection aiguë ou chronique. Mes résultats montrent que la virulence diminue chez environ 50% des patients atteints de mucoviscidose, mais pas chez les patients intubés, et ce indépendamment de l'apparition de mutations dans le gène lasR (un régulateur du quorum-sensing). Par mutagenèse aléatoire de D. discoideum, j'ai dévoilé l'implication de plusieurs nouveaux gènes dans les interactions amibe-bactérie. J'ai montré que la protéine Kil2 est indispensable pour tuer efficacement Klebsiella pneumoniae. Cette P-ATPase semble transporter du magnésium à l'intérieur du phagosome, ce qui active les enzymes protéolytiques responsables de l'élimination des [...]

LELONG-FAVRE ALBORINI, Emmanuelle. Relations entre cellule hôte et bactéries pathogènes : l'amibe Dictyostelium discoideum comme modèle d'étude. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2011, no. Sc. 4319

URN : urn:nbn:ch:unige-173227

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:17322

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:17322

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UNIVERSITE DE GENEVE

Département de biologie cellulaire FACULTE DES SCIENCES

Professeur Didier Picard

Département de physiologie cellulaire FACULTE DE MEDECINE

et métabolisme Professeur Pierre Cosson

Relations entre cellule hôte et bactéries pathogènes : l’amibe Dictyostelium discoideum comme modèle d’étude

THESE

présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biologie

par

Emmanuelle LELONG ALBORINI de

Ambilly (France)

Thèse N°4319

Genève

Atelier de reprographie Repromail 2011

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RESUME

Les infections bactériennes constituent un problème majeur de santé publique aggravé par l’augmentation de la résistance bactérienne aux antibiotiques. Mon projet de thèse a consisté à étudier les interactions complexes entre les bactéries pathogènes et l’hôte qu’elles infectent. Pour cela j’ai utilisé l’amibe Dictyostelium discoideum comme hôte modèle. Cet eucaryote unicellulaire est un phagocyte professionnel qui vit dans les sols, où il se nourrit de microorganismes. D. discoideum représente donc un prédateur naturel pour les bactéries environnementales. En laboratoire, D. discoideum a la capacité de pousser en se nourrissant de bactéries. Ce modèle m’a permis d’analyser d’une part la pathogénicité des bactéries, et d’autre part les mécanismes par lesquels une cellule phagocytaire hôte peut ingérer et tuer des bactéries.

Durant ma thèse j’ai étudié la virulence bactérienne de souches cliniques de P.

aeruginosa, issues d’infections aiguës chez des patients intubés ou d’infections chroniques chez des patients atteints de mucoviscidose. Les études génétiques réalisées préalablement sur ces isolats avaient mis en évidence l’apparition fréquente, au cours de l’infection, de mutations inactivant le gène lasR, un des régulateurs principaux de la virulence de P.

aeruginosa. L’hypothèse suivante avait été émise : l’inactivation du gène lasR pourrait être à l’origine d’une diminution de la virulence de P. aeruginosa au cours de l’infection. Mes résultats suggèrent une vision plus complexe que prévue : la virulence bactérienne diminue chez environ 50% des patients atteints de mucoviscidose, mais pas chez les patients intubés.

Par ailleurs, il n’y a pas de corrélation entre l’inactivation du gène lasR et la diminution de la virulence, ce qui suggère que l’évolution de la virulence bactérienne met en jeu d’autres mutations dans le génome bactérien.

Par ailleurs, grâce à des analyses génétiques, j’ai identifié et caractérisé un mutant de D. discoideum incapable de tuer efficacement les bactéries Klebsiella pneumoniae qu’il ingère. Ceci m’a permis de mettre en évidence le rôle de la protéine Kil2 dans la destruction intracellulaire des bactéries. La protéine Kil2 appartient à la famille des P-ATPases de type V qui transportent des cations au travers des membranes. Elle est localisée au niveau de la membrane des phagosomes, compartiments cellulaires dans lesquels les bactéries sont tuées.

Mes expériences suggèrent que la protéine Kil2 transporte vers l’intérieur du phagosome du magnésium, qui active les enzymes protéolytiques responsables de l’élimination de K.

pneumoniae. Plus largement, mes travaux ont dévoilé l’implication de plusieurs nouveaux gènes dans les interactions amibe-bactérie et représentent un point de départ pour de nouveaux projets de recherche.

En conclusion, l’utilisation de D. discoideum permet, d’une part d’identifier les facteurs spécifiques mobilisés par les cellules phagocytaires pour lutter contre les bactéries, et d’autre part d’évaluer la virulence bactérienne, deux aspects importants des interactions hôte-

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Le chemin qui mène à la paix intérieure consiste à terminer les choses que tu as commencées.

Proverbe chinois

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REMERCIEMENTS

Je commence par les remerciements officiels mais non moins sincères que j’adresse à mon jury de thèse. Merci à Didier Picard, Gilbert Greub et François Letourneur d’avoir accepté de consacrer un peu de leur temps à ma thèse.

Pierre,

Merci de m’avoir guidée tout au long de ma thèse et de m’avoir transmis ta passion pour la recherche. Nos discussions scientifiques, tes « j’ai une nouvelle idée de manip ! » et tes

« alors alors, c’est quoi le résultat ? » me manquent déjà.

Marion,

Tu es sans aucun doute la plus belle rencontre que j’ai faite au cours de ma thèse. Ma voisine de paillasse, ma copine de sudoku, ma confidente, ma jumelle… Je tiens à te remercier du fond du cœur pour ton amitié, ton chaleureux soutien et ta constante bonne humeur.

Jackie,

Notre amitié, qui nous lie depuis les bancs de la fac, a été d’un grand réconfort pour moi tout au long de ma thèse. Le hasard de la vie a fait que, à quelques mois près nous aurions pu partager le même bureau. Dommage, j’aurais adoré. Qui sait, ce n’est peut être que partie remise.

Anna,

Ce fut un plaisir de travailler à tes côtés. Nous avons partagé ensemble la lourdeur de la mutagenèse, les nombreux tests de pousse et killing. Notre plus grand plaisir commun est certainement la publication de notre mutant préféré, Kil2.

Romain, Wanessa, Marco et Cédric,

Les rires, les pauses café et nos innombrables discussions me manquerons.

Et puis parmi tous ces collègues de travail qui ont assuré la bonne ambiance et la cohésion de notre labo, je n’oublie pas les anciens Valentina, Steve, Nathalie, Sophie, Prashant, et les nouveaux ou plutôt les nouvelles, Hajer et Cristiana.

Thierry,

Merci de m’avoir accueillie dans ton labo le temps de quelques manips. Merci beaucoup pour ton aide et pour tes précieux conseils, scientifiques comme personnels, qui m’ont permis d’aller de l’avant.

Monica,

Merci pour le temps que tu as passé à m’apprendre les manips Myco et pour nos nombreuses discussions.

Natascha et Aurélie,

Merci pour votre participation à l’étude Kil2.

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Je remercie aussi toutes les personnes du département qui ont participé de près ou de loin à cette aventure :

Lélio pour ton affection paternaliste,

Anne-Lyse pour les nombreuses connaissances que tu m’as apportées en histologie, Dominique pour tous les mutants que nous avons triés ensemble au FACS,

Hervé, Olivier, Corine, Tamara, Stella, Nathalie, Laurène, Cyril, Perrine, Séverine, Marthino, Christian et Marie-Claude pour votre sympathie et votre bonne humeur.

Et enfin pour terminer le tour des labos, je devrais aussi remercier toutes mes petites bestioles : Dictyo en tête d’affiche du film « Petits killing entre amis », et Pseudo, Klebsiella, Myco et les autres, dans les rôles secondaires.

Beaucoup savent à quel point les amis sont importants pour moi. Merci à Stf, Maude, Julien, Pam, Marc, Gros Julien, Nathalie, Matthieu, Ana, Greg et Fred pour les bouffées d’air pur que vous m’avez apportées tout au long de ma thèse.

Un grand merci du fond du cœur à Christine.

Je garde le meilleur pour la fin… la famille.

Vincent,

Milles mercis ne suffiraient pas pour te dire à quel point je te suis reconnaissante. Ta détermination et ta rigueur ont été un exemple pour moi et m’ont aidé à terminer cette thèse.

Merci du fond du cœur pour ta patience, ton soutien et ta compréhension… et par dessus tout, pour ton amour.

Maman et André,

Vous avez toujours été présents pour moi et c’est grâce à vous que je suis arrivée là où j’en suis aujourd’hui. Merci pour tout ce que vous avez fait pour moi, pour votre soutien et votre éternel amour.

Valérie,

Tu es sans aucun doute la meilleure pom-pom girl du banc de touche de ma thèse. Merci pour tous tes encouragements qui m’ont donné la force de continuer et de terminer ma thèse.

Sabine,

Merci pour ton soutien et ton affection, et les conseils apportés à Vincent en tant que conjoint de thésard.

Et puis il y a aussi ceux qui, par de petites attentions, m’ont beaucoup apporté : Odile et Gé, Lorianne, Eric, Patrice et la tante Dodo...

… sans oublier Antoine et Valentine,

Un grain de malice, un soupçon d’imaginaire et surtout beaucoup de tendresse. Un cocktail parfait pour changer d’air et me réconforter :-)

Je termine ces remerciements par une pensée émue pour mon Gramp, qui m’a toujours encouragée. Tu me manques tellement…

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TABLE DES MATIERES

Index des figures 1

Index des tables 2

Abréviations 3

CHAPITRE I : INTRODUCTION – LES INFECTIONS BACTERIENNES 5

A. La virulence bactérienne chez Pseudomonas aeruginosa 6

A.1. La pathogénicité bactérienne (généralités) 6

A.1.a Etablissement d’une infection bactérienne 6

A.1.b Pathogènes stricts et pathogènes opportunistes 9

A.1.c Bactéries commensales ou pathogènes opportunistes 10

A.1.d Les maladies nosocomiales 11

A.2. Les infections à P. aeruginosa 13

A.2.a Les infections aiguës 13

A.2.b L’infection chronique chez les patients atteints de mucoviscidose 14 A.2.c P. aeruginosa et la résistance aux antibiotiques 15

A.3. Les facteurs de virulence de P. aeruginosa 16

A.3.a P. aeruginosa et la virulence 16

A.3.b Le système de sécrétion de type III 19

A.3.c Le biofilm 21

A.3.d Le quorum-sensing 22

A.4. Les organismes modèles pour l’étude de P. aeruginosa 24

A.4.a La souris 28

A.4.b Zebrafish 29

A.4.c A. thaliana 30

A.4.d D. melanogaster 31

A.4.e C. elegans 33

A.4.f D. discoideum 35

Revue Lima et al. : le modèle D. discoideum dans l’étude de la virulence de P.

aeruginosa 37

(15)

B. Les défenses de l’hôte 46

B.1. L’immunité innée et les cellules phagocytaires 47

B.2. La phagocytose 48

B.2.a La reconnaissance des bactéries 50

B.2.b L’internalisation des bactéries 51

B.2.c La maturation du phagosome 52

B.3. L’élimination des bactéries 53

B.3.a La V-ATPase 53

B.3.b La NADPH oxydase 54

B.3.c Les enzymes lysosomales 55

B.3.d Les flux ioniques 57

B.4. D. discoideum comme modèle d’étude de la phagocytose et de l’élimination des

bactéries 61

B.4.a Le cycle de vie de D. discoideum 61

B.4.b Génétique 63

B.4.c La phagocytose chez D. discoideum 64

B.4.d L’élimination des bactéries chez D. discoideum 69

C. Les objectifs du projet de thèse 72

CHAPITRE II : RESULTATS 73

A. La virulence de souches cliniques de P. aeruginosa 73

A.1. D. discoideum un outil pour mesurer la virulence bactérienne 73

A.1.a Introduction 73

A.1.b Article Froquet et al. : mesure de la virulence bactérienne 74

A.1.c Conclusion 81

A.2. La virulence de P. aeruginosa évolue-t-elle au cours d’une infection ? 82

A.2.a Introduction 82

A.2.b Article Lelong et al. : évolution de la virulence de P. aeruginosa 84

A.2.c Conclusion 93

B. Les mécanismes de défense de D. discoideum 95

B.1. Identification de gènes de défense de D. discoideum par mutagenèse aléatoire 95

(16)

B.1.a Technique : Restriction Enzyme-Mediated Integration (REMI) 95

B.1.b Sélection des mutants 100

B.1.c Identification du site d’insertion 102

B.1.d Les mutants obtenus par mutagenèse REMI 106

B.1.e Biais de la mutagenèse REMI : les « hotspots » 108 B.1.f Confirmation du lien entre génotype et phénotype 110

B.1.g Conclusion 110

B.2. Matrice de virulence 111

B.2.a Les mutants de D. discoideum et les bactéries testées 112

B.2.b Méthode 115

B.2.c Résultats et conclusion 116

B.3. Kil2, une nouvelle protéine impliquée dans l’élimination intracellulaire de

Klebsiella 119

B.3.a Introduction 119

B.3.b Article Lelong et al. : Kil2 et le magnésium dans l’élimination de Klebsiella 120

B.3.c Conclusion 143

B.4. Le mutant vps13 146

B.4.a Introduction 146

B.4.b La mutagenèse de vps13 148

B.4.c La pousse sur bactéries 149

B.4.d La phagocytose 152

B.4.e L’élimination des bactéries 154

B.4.f L’activité et la sécrétion des enzymes lysosomales 155

B.4.g La voie d’endocytose 157

B.4.h Localisation de la protéine Vps13 158

B.4.i Conclusion 161

CHAPITRE III : DISCUSSION ET PERSPECTIVES 163

ANNEXES 171

A.1. Article Marchetti et al. : mesure du pH endosomal de D. discoideum par

cytométrie de flux 171

(17)

A.2. Article Mercanti et al. : triage des protéines via leur domaine

transmembranaire 183

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 195

(18)

INDEX DES FIGURES

Figure 1 : Les facteurs de virulence de P. aeruginosa. 17

Figure 2 : La formation du biofilm par P. aeruginosa. 22

Figure 3 : Le quorum-sensing : système de régulation et de communication inter-bactéries. 24

Figure 4 : Phylogénie des eucaryotes. 27

Figure 5 : La phagocytose : reconnaissance, internalisation et maturation. 49 Figure 6 : Les récepteur PRR de surface reconnaissant les PAMP bactériens. 51 Figure 7 : La production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par la NADPH oxydase. 55 Figure 8 : Modèles de destruction des bactéries dans le phagosomes. 59

Figure 9 : Cycle de croissance de D. discoideum. 63

Figure 10 : Phagocytose de bactéries par D. discoideum. 65

Figure 11 : Les marqueurs de la voie de phagocytose chez D. discoideum. 69 Figure 12 : Obtention de mutants de D. discoideum impliqués dans les interactions avec les

bactéries. 97

Figure 13 : Construction du plasmide de mutagenèse pSC. 98

Figure 14 : Phénotypes de pousse des mutants mEL. 102

Figure 15 : Identification du site d’insertion de pSC. 103

Figure 16 : Les « hotspots », sites préférentiellement mutés lors de la mutagenèse REMI. 109 Figure 17 : Taxonomie des bactéries utilisées dans la matrice de virulence. 114 Figure 18 : Mesure de la pousse de D. discoideum sur des bactéries. 115 Figure 19 : Matrice de virulence : pousse des mutants de D. discoideum sur différentes

bactéries. 118

Figure 20 : Kil2, ATPase de type P, transporte des cations. 143 Figure 21 : Identification du cation transporté par Kil2. 144 Figure 22 : Modèle d’action de la protéine Kil2 dans l’élimination de Klebsiella. 146

Figure 23 : Mutagenèse du gène vps13A. 151

Figure 24 : Pousse du mutant vps13 sur différentes bactéries. 152

Figure 25 : La phagocytose chez le mutant vps13. 153

Figure 26 : Elimination de B. subtilis par le mutant vps13. 154 Figure 27 : L’activité des enzymes lysosomales du mutant vps13. 156

Figure 28 : La voie d’endocytose du mutant vps13. 158

Figure 29 : Obtention des cellules VPS13-GFP. 159

Figure 30 : Test de pousse des cellules VPS13-GFP sur B. subtilis. 160

(19)

INDEX DES TABLES

Table 1 : Comparaison des différents hôtes modèles utilisés pour l’étude des infections à P.

aeruginosa. 27

Table 2 : Les protéines de D. discoideum impliqués dans les interactions hôte-pathogène. 71 Table 3 : Résultats de l’analyse génétique des mutants mEL. 107 Table 4 : Les mutants de D. discoideum testés dans la matrice de virulence. 113 Table 5 : Les bactéries utilisées pour tester la pousse des mutants de D. discoideum. 113

(20)

ABREVIATIONS

ADN Acide DésoxyriboNucléique ADNc ADN codant

ADP Adénosine DiPhosphate AHL AcylHomosérine Lactones AQ 2-alkyl-4-quinolone ARN Acide RiboNucléique ARNi ARN interférence ATP Adénosine TriPhosphate

BPI Bactericidal Permeability-Increasing protein Bs Bacillus subtilis

BSR Blasticidine S Resistance

CHAC CHorée ACanthocytose CR Récepteur du Complément CF Cystic Fibrosis

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulateur CFU Colony Forming Units

CG Cathepsine G

DAG DiAcylGlycérol

DO600 Densité Optique à 600nm

FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting FcR Récepteur Fcγ

GAP GTPase-Inactivating Proteins GDP Guanosine DiPhosphate GEF GDP-GTP Exchange Factors GFP Green Fluorescente Protein GTP Guanosine TriPhosphate

HL5 milieu de culture de D. discoideum HNE Hematopoietic Neutrophil Elastase HRP HorseRadish Peroxidase

IgA, IgG Immunoglobulines A et G IP3 Inositol 1,4,5 TrisPhosphate

Ka Klebsiella aerogenes

KO Knock-Out

Kp Klebsiella pneumoniae

LB milieu de culture Luria Bertani LB-Amp milieu LB contenant de l’Ampicilline LBP LPS-Binding Protein

LPS LipoPolySaccharides

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MBP Mannose-Binding Protein MCS Multi Cloning Site

Ml Micrococcus luteus MPO MyeloPerOxydase

NADPH Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate réduit NK Natural Killer

NOX NADPH Oxydase

PAMP Pathogen Associated Molecular Patterns PCR Polymerase Chain Reaction

PI3-kinase PhosphoInositide 3 kinase

PIP2 PhosphatidylInositol 4,5 DiPhosphate PIP3 PhosphatidylInositol 3,4,5 TriPhosphate PKC Protéine Kinase C

PLC PhosphoLipase C PR3 protéase 3

PRR Pattern Recognition Receptors

QS Quorum Sensing

RE Réticulum Endoplasmique

REMI Restriction Enzyme Mediated Integration ROS Reactive Oxygen Species

Rpm Rotation par minute

SM Standard Medium SOD SuperOxyde Dismutase

SSTT Système de Sécrétion de Type III

TLR Toll-Like Receptor

V-ATPase Vacuolar ATPase

WT Wild-Type (sauvage)

(22)

Chapitre I

INTRODUCTION

(23)
(24)

Chapitre I : Introduction – Les infections bactériennes

Une infection bactérienne est la rencontre entre un hôte et une bactérie pathogène qui induit une maladie chez l’hôte. Les facteurs déterminants de l’infection bactérienne sont d’une part la virulence de la bactérie et d’autre part l’efficacité des défenses de l’hôte. Ma thèse porte sur l’étude des interactions hôte-pathogène en utilisant Dictyostelium discoideum comme hôte modèle. Pour situer mes travaux dans leur contexte biomédical, le premier chapitre de cette thèse a pour objectif de décrire de façon générale la problématique des infections bactériennes. J’aborde dans un premier temps l’aspect bactériologique du problème (Chapitre I : A). Je définis en termes généraux ce qu’est la virulence bactérienne et je décris la mise en place d’une infection (Chapitre I : A.1). Je présente ensuite spécifiquement le cas des infections à P. aeruginosa chez l’homme et les facteurs de virulence connus de cette bactérie (Chapitre I : A.2), (Chapitre I : A.3). Ensuite je décris les systèmes modèles qui sont utilisés pour étudier les infections à P. aeruginosa et qui permettent de découvrir les facteurs de virulence de cette bactérie (Chapitre I : A.4). Dans un second temps, je m’intéresse aux défenses immunitaires de l’homme face aux infections (Chapitre I : B). Ce domaine étant très vaste, je me concentre en particulier sur les cellules phagocytaires qui assurent une large part de l’immunité innée (Chapitre I : B.1). Ces cellules sont la première ligne de défense de l’organisme lorsqu’il est infecté et elles assurent la phagocytose et l’élimination des bactéries (Chapitre I : B.2 et B.3). Pour étudier ces fonctions, nous avons utilisé l’amibe D. discoideum que je décris également dans mon introduction (Chapitre I : B.4). Enfin la dernière partie de ce premier chapitre (Chapitre I : C) précise les objectifs spécifiques de mon projet de thèse.

Dans le second chapitre de ma thèse, je présente les résultats que j’ai obtenus au cours mes travaux de recherche. En suivant le modèle de mon introduction, je présente dans un premier temps les résultats concernant la virulence bactérienne (Chapitre II : A) et dans un second temps ceux relatifs à l’étude des mécanismes de défense chez D. discoideum (Chapitre II : B). Je montre dans la partie A, comment j’ai utilisé D. discoideum pour mesurer la virulence bactérienne (Chapitre II : A.1), et comment la virulence de souches cliniques de P.

aeruginosa évolue au cours de l’infection (Chapitre II : A.2). Dans la partie B, j’explique comment j’ai obtenu et sélectionné des mutants de D. discoideum dont les interactions avec les bactéries sont affectées (Chapitre II : B.1 et B.2), et je décris la caractérisation de deux d’entre eux, les mutants kil2 et vps13A (Chapitre II : B.3 et B.4).

(25)

Le troisième chapitre de ma thèse est consacré à la discussion de ces résultats, ainsi qu’aux conclusions et perspectives ouvertes par mes travaux de recherche.

A. La virulence bactérienne chez Pseudomonas aeruginosa

A.1. La pathogénicité bactérienne (généralités)

La pathogénicité, ou virulence, d’une bactérie est une mesure de sa capacité à provoquer une maladie chez un hôte. La pathogénicité est une notion relative, puisque le développement d’une maladie dépend de la bactérie, mais aussi de nombreux autres facteurs non bactériens, comme l’état général de l’hôte ou l’efficacité de ses défenses. Une bactérie pathogène doit remplir plusieurs conditions essentielles, et souvent étroitement liées, pour infecter un hôte : coloniser l’hôte, altérer ses fonctions et résister à ses systèmes de défense.

Les bactéries possèdent un arsenal de facteurs de virulence leur permettant de remplir ces différentes fonctions.

Dans cette partie, je décris de façon générale les conditions permettant le développement des infections bactériennes (partie A.1.a) et les différents types de pathogènes (pathogènes stricts ou opportunistes) (partie A.1.b). J’évoque également les différences entre bactéries pathogènes et bactéries commensales, et je discute comment une bactérie commensale à l’origine inoffensive peut devenir pathogène pour un hôte (partie A.1.c). Enfin j’aborde le problème des maladies nosocomiales qui sont principalement causées par des bactéries opportunistes (partie A.1.d).

A.1.a Etablissement d’une infection bactérienne

L’infection bactérienne est définie par Salyers et Whitt comme la colonisation d’un hôte par un microorganisme causant des dommages à l’hôte (Salyers and Whitt, 2002). La colonisation bactérienne consiste pour la bactérie à envahir un hôte et à établir une nouvelle niche de reproduction. A l’inverse de l’infection, la colonisation n’est pas synonyme de maladie. Chez l’homme, la colonisation bactérienne peut être externe, c'est-à-dire à la surface de la peau ou des muqueuses, ou interne, ce qui implique le franchissement des barrières physiques que forment la peau et les muqueuses entre l’organisme et l’environnement extérieur. La peau et les muqueuses sont recouvertes d’un épithélium, un tissu cohésif,

(26)

normalement impénétrable par les micro-organismes. De plus les muqueuses des tractus respiratoire, gastro-intestinal et urogénital, ont la capacité de sécréter à leur surface du mucus dont la composition chimique joue un rôle protecteur pour les cellules épithéliales et limite la propagation des bactéries (McGuckin et al., 2009). Lorsque cette barrière externe est rompue par des lésions physiques (plaie, brûlure, acte chirurgical ou détérioration causée par une maladie), les bactéries pénètrent dans l’organisme. Les organes qui le constituent deviennent accessibles aux bactéries qui s’installent alors directement dans les tissus de l’hôte. Le site de colonisation doit représenter un environnement adéquat pour apporter aux bactéries tous les éléments nécessaires à leur survie et à leur développement (acides aminés, sucres…), permettant ainsi leur multiplication. Les bactéries capables de coloniser l’être humain ne sont pas pour autant toutes pathogènes (exemple des bactéries commensales, Chapitre I : A.1.c).

Pour être pathogènes, les bactéries doivent remplir deux autres conditions : altérer les fonctions de l’hôte et résister au système immunitaire (Prescott et al., 2003). Les bactéries pathogènes interfèrent avec les fonctions des tissus et des cellules de l’hôte qu’elles colonisent. Cette altération des fonctions cellulaires ou tissulaires est souvent un bon moyen pour les bactéries de coloniser les tissus de l’hôte, ainsi que de résister au système immunitaire en l’attaquant directement. Un autre moyen pour résister au système immunitaire est d’échapper à son contrôle en passant inaperçu. La résistance au système immunitaire favorise la multiplication bactérienne et la colonisation de l’hôte.

Les mécanismes bactériens mis en place pour remplir ses fonctions sont appelés facteurs de virulence. Le paragraphe suivant présente une liste non-exhaustive de facteurs de virulence bactériens et illustre le fait que les trois fonctions (colonisation, altération et résistance) sont étroitement liées et difficilement dissociables.

Certains facteurs de virulence sont spécifiquement impliqués dans la colonisation via une modification ou une altération des tissus de l’hôte. Ils favorisent la dissémination des bactéries dans le corps humain, et leur installation au niveau tissulaire. Par exemple, certaines bactéries sécrètent des enzymes comme la collagénase, l’élastase, ou encore la protéase alcaline, qui dégradent le collagène et la laminine, deux éléments essentiels pour la cohésion des tissus conjonctifs et épithéliaux (Matsushita and Okabe, 2001, Pruteanu et al., 2010, Kipnis et al., 2006). L’intégrité des tissus est alors altérée et les bactéries peuvent profiter de cette brèche pour accéder directement à d’autres tissus et investir une nouvelle niche de reproduction. Les bactéries attaquent aussi les tissus de l’hôte en rejetant des déchets

(27)

métaboliques toxiques. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’ammoniaque (NH3) endommagent par exemple les tissus épithéliaux, principalement au niveau respiratoire et urogénitale (Prescott et al., 2003).

En plus d’altérer les tissus, les bactéries pathogènes ont la capacité d’attaquer directement les cellules de l’hôte, notamment grâce à des facteurs de virulence spécifiques appelés exotoxines. Ce sont des protéines excrétées par la bactérie, dont l’effet sur la cellule peut être extracellulaire ou intracellulaire. Certaines exotoxines sont sécrétées dans le milieu par les bactéries et attaquent les cellules soit en se fixant à un récepteur membranaire et en induisant une modification des voies de signalisation, soit en perturbant l’intégrité de la membrane plasmique. Par exemple, les hémolysines sécrétées par un grand nombre de bactéries comme les Streptocoques, les Staphylocoques, ou Escherichia coli, lysent les globules rouges (Bhakdi et al., 1986, Prescott et al., 2003). La diminution du nombre d’érythrocytes provoque une anémie qui affaiblit l’hôte. D’autre part, la libération du fer transporté par les globules rouges favorise la croissance bactérienne. La leucocidine est un autre exemple d’exotoxine extracellulaire. Sécrétée entre autres par Staphylococcus aureus, la leucocidine forme des pores dans les membranes plasmiques des leucocytes (Loffler et al., 2010). La fonction des leucocytes est alors altérée et le système immunitaire est affaibli. La leucocidine est un des exemples de facteurs de virulence couplant l’altération des fonctions de l’hôte et la résistance au système immunitaire. Les exotoxines intracellulaires entrent dans la cellule en traversant la membrane plasmique ou en étant injectées directement dans le cytoplasme de la cellule hôte via des systèmes de sécrétion bactériens. C’est le cas des exoenzymes sécrétées via le système de sécrétion de type III que possèdent de nombreuses bactéries (Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Yersinia et Vibrio) (Chapitre I : A.3.b).

Certaines de ces exoenzymes (comme YopE de Yersinia) inactivent les Rho-GTPases impliquées dans l’internalisation des bactéries par les phagocytes (Black and Bliska, 2000).

Les bactéries sont aussi capables d’échapper au système immunitaire adaptatif. Par exemple, S. aureus produit à sa surface la protéine A spécifiquement reconnue par les immunoglobulines G (IgG) (Foster, 2005, Foster, 2009). La fixation des IgG sur la protéine A empêchent l’interaction des IgG avec le système du complément, et bloque l’activation du système immunitaire par le complément. Streptococcus pneumoniae synthétisent la protéase de l’immunoglobuline A (IgA) qui hydrolyse l’IgA et sépare les deux parties Fab et Fc de l’anticorps qui devient non fonctionnel (Kilian et al., 1980). Les bactéries évitent ainsi leur destruction par le système immunitaire via les anticorps. L’attaque (l’altération) du système

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immunitaire n’est pas le seul moyen pour une bactérie de résister aux défenses de l’hôte.

D’autres mécanismes lui permettent de passer inaperçue pour échapper au système immunitaire. Par exemple, S. aureus synthétise la coagulase, une enzyme qui coagule le fibrinogène contenu dans le plasma sanguin (Rivera et al., 2007). Le fibrinogène coagulé forme un caillot autour de la bactérie, ce qui la rend indétectable par le système immunitaire.

La mise en place d’un biofilm est aussi un bon moyen pour la bactérie d’éviter la phagocytose. Le biofilm est une matrice extracellulaire sécrétée par les bactéries (Chapitre I : A.3.c). Cette matrice favorise l’adhésion et la cohésion d’une population bactérienne. Le biofilm joue un rôle de protection en rendant les bactéries inaccessibles aux cellules phagocytaires du système immunitaire (ainsi qu’à de nombreux antibiotiques).

Pour conclure, l’établissement d’une infection par une bactérie pathogène dépend de l’action combinée de nombreux facteurs de virulence bactériens, c’est-à-dire des mécanismes mis en place par les bactéries pour coloniser l’hôte, altérer ses fonctions et résister à son système immunitaire.

A.1.b Pathogènes stricts et pathogènes opportunistes

Parmi les trois points importants conduisant à l’infection d’un organisme par une bactérie, à savoir, la colonisation de l’hôte, l’altération de l’hôte et la capacité à échapper ou résister au système immunitaire, les deux premiers points sont indispensables pour qu’une bactérie soit pathogène. En revanche, le troisième n’est pas crucial et est à l’origine de la distinction entre pathogènes stricts et pathogènes opportunistes (Prescott et al., 2003, Salyers and Whitt, 2002). Les bactéries pathogènes strictes provoquent une maladie chez n’importe quel individu, même sain, car elles sont capables d’échapper ou de résister aux défenses de l’hôte, que ce soit en évitant d’être reconnues par le système immunitaire, ou en l’attaquant directement (paragraphe précédent). Les bactéries pathogènes strictes les plus connues sont Bacillus anthracis et Yersinia pestis, responsables respectivement de la maladie du charbon et de la peste.

Contrairement aux pathogènes stricts, les bactéries pathogènes opportunistes n’induisent pas de maladie chez un individu sain car elles ne sont pas capables de résister au système immunitaire, et sont donc détruites par l’hôte. En revanche elles causent une maladie chez un individu susceptible, dont le système immunitaire est affaibli (Prescott et al., 2003,

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Salyers and Whitt, 2002). Le cas le plus fréquent est celui des patients immunodéprimés qui ne sont pas capables de combattre efficacement les infections. Des infections à pathogènes opportunistes sont également observées chez les jeunes enfants dont le système immunitaire n’est pas encore totalement développé, chez les personnes âgées qui présentent souvent un système immunitaire affaibli, ou chez les personnes fragilisées par une opération chirurgicale ou la présence d’une autre maladie. Les bactéries opportunistes les plus fréquemment rencontrées par l’homme sont S. aureus, P. aeruginosa, E. coli ou encore Listeria monocytogenes.

A.1.c Bactéries commensales ou pathogènes opportunistes

De nombreuses bactéries sont capables de coloniser l’homme sans pour autant être pathogènes. Ce sont des bactéries dîtes commensales. Ces bactéries puisent les éléments nutritifs nécessaires à leur développement dans l’organisme hôte, sans toutefois lui causer de dommages importants. Chez l’homme, elles sont présentes au niveau des tissus cutanés, des muqueuses digestives, génitales ou respiratoires. L’étude de modèles animaux n’ayant jamais été en contact avec des bactéries a montré l’existence d’un mutualisme entre certaines bactéries commensales et l’organisme hôte (Coudeyras and Forestier, 2010). Ce mutualisme est important pour la santé et la survie de l’individu. Par exemple, au niveau de la muqueuse vaginale, les bactéries commensales Lactobacillus sécrètent de l’acide lactique et maintiennent ainsi un pH acide qui empêche l’installation d’autres bactéries (Witkin et al., 2007). Dans un autre exemple, au niveau du tube digestif, dans le colon, les bactéries symbiotiques de la flore intestinale achèvent la digestion de certains aliments et synthétisent des éléments indispensables à l’organisme comme les vitamines K et B12, ou des acides gras absorbables et métabolisables par les cellules de l’hôte (Prescott et al., 2003, Coudeyras and Forestier, 2010). Les bactéries commensales interagissent aussi directement avec les cellules de l’organisme hôte. Elles modulent l’expression de nombreux gènes impliqués entre autres dans l’absorption des nutriments et la sécrétion du mucus (Hooper et al., 2001). Les bactéries commensales contrôlent aussi l’immunité au niveau de l’intestin : elles inhibent des facteurs pro-inflammatoires, ce qui permet une immunotolérance envers la flore commensale (Chow et al., 2010), et d’un autre côté elles assurent une stimulation minimale du système immunitaire dont les cellules sont recrutées par la présence des bactéries commensales. Cette stimulation

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est indispensable à l’organisme pour se défendre des bactéries pathogènes susceptibles de coloniser l’intestin (Rakoff-Nahoum et al., 2004).

Les bactéries commensales peuvent devenir des pathogènes opportunistes lorsque les conditions sont modifiées. Il arrive que les bactéries commensales s’échappent de leur niche et colonisent un autre site de l’organisme, site où ces bactéries ne sont pas tolérées. Par exemple, les bactéries commensales vivant à la surface de l’épiderme peuvent coloniser les parties internes de la peau, suite à une blessure, et créer une infection sous-cutanée (Prescott et al., 2003). Un autre exemple est celui de l’appendicite aiguë : l’éclatement de l’appendice libère des bactéries commensales de l’intestin dans la cavité péritonéale, ce qui peut induire une septicémie. Un déséquilibre de la flore intestinale peut aussi conduire les bactéries commensales à devenir pathogènes. Un traitement antibiotique, pour lutter contre une angine infectieuse par exemple, élimine les bactéries intestinales sensibles à cet antibiotique, ce qui favorise une prolifération excessive des bactéries intestinales insensibles à l’antibiotique. Ce déséquilibre dans la population bactérienne de l’intestin se traduit souvent par des diarrhées aiguës (Coudeyras and Forestier, 2010). D’une façon plus générale, toute altération de l’état de l’hôte (maladie, affaiblissement des défenses immunitaires…) peut amener l’hôte à ne plus contrôler sa flore commensale. L’équilibre qui était établi entre l’hôte et les bactéries commensales est rompu, la population bactérienne augmente et franchit le seuil de tolérance de l’organisme hôte. Les bactéries créent alors des dommages à l’hôte et deviennent des pathogènes opportunistes.

A.1.d Les maladies nosocomiales

Les pathogènes opportunistes sont souvent responsables de maladies nosocomiales, c'est-à-dire d’infections contractées dans un établissement hospitalier. En effet les personnes hospitalisées sont fragilisées et plus susceptibles aux infections. Dans le monde, la prévalence des infections nosocomiales est de 10% des patients hospitalisés (d’après l’OMS, Organisation Mondiale de la Santé, www.who.int). Les bactéries les plus fréquemment mises en cause dans les maladies nosocomiales sont E. coli (dans 25% des cas), S. aureus (19%), P.

aeruginosa (10%) et Klebsiella pneumoniae. En Suisse, les maladies nosocomiales concernent 10,1% des patients hospitalisés et ciblent en particulier les patients des soins intensifs (29,7% des patients atteints d’infections nosocomiales) (Sax and Pittet, 2002). Les infections nosocomiales sont souvent associées à l’introduction accidentelle du pathogène

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dans l’organisme lors d’un geste médical : infections au niveau du site opératoire (29% des infections nosocomiales), pneumopathies causées par l’intubation du patient (20%), infections urinaires dues à la pose d’une sonde (19%), infections vasculaires dues à la pose d’un cathéter (11%) (enquête de prévalence des infections nosocomiales dans les hôpitaux suisses réalisée par Swiss-NOSO en 2005, www.swissnoso.ch). Par exemple, S. aureus infecte fréquemment les personnes opérées pour la mise en place d’une prothèse osseuse et P. aeruginosa est souvent impliqué dans le développement de pneumopathies chez les patients intubés (www.swissnoso.ch). Les maladies nosocomiales sont un sérieux problème de santé publique, d’autant plus que les bactéries responsables des maladies nosocomiales sont de plus en plus résistantes aux antibiotiques ce qui pose d’importants problèmes dans le traitement des malades.

Discussion : la pathogénicité bactérienne est difficile à décrire et à évaluer de façon simple, puisqu’elle relève d’un ensemble de conditions et de facteurs dépendant à la fois de la bactérie et de l’hôte. Aucune classification entre bactéries pathogènes strictes, pathogènes opportunistes, commensales ou non-pathogènes ne peut être parfaite. Chaque bactérie est classée en fonction de la catégorie à laquelle elle correspond dans la majorité des cas observés mais les exceptions sont fréquentes. Dans un sens, toutes les bactéries possèdent un pouvoir pathogène, même des bactéries dites non-pathogènes, comme Lactococcus lactis par exemple.

Cette bactérie est utilisée depuis longtemps dans l’industrie agro-alimentaire pour la fermentation, la conservation et la production de probiotiques (Mofredj et al., 2007).

Normalement inoffensive, L. lactis peut exceptionnellement infecter l’homme. Cette bactérie est responsable de septicémies, d’endocardites, de pneumopathie et de péritonites (Mofredj et al., 2007). Les patients infectés par L. lactis sont généralement très affaiblis par une autre maladie sous-jacente. Des cas d’endocardites à L. lactis ont été rapportés chez des patients présentant une sténose congénitale de l’artère pulmonaire (Von Handrick et al., 1974) ou une glomérulonéphrite (Pellizzer et al., 1996), et un cas de septicémie chez un patient atteint d’une leucémie lymphoïde chronique (Durand et al., 1995). L’exemple de L. lactis illustre le fait que toutes les notions que j’ai tenté de définir dans cette première partie peuvent être sujettes à discussion et à contradiction.

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A.2. Les infections à P. aeruginosa

P. aeruginosa est un pathogène opportuniste capable de générer chez l’homme de nombreux type d’infections : infections cutanées (le plus souvent au niveau d’une plaie opératoire ou d’une brûlure), infections pulmonaires, urinaires, intestinales, ostéo-articulaires, oculaires, ou encore auditives. L’infection peut être aiguë, c’est à dire à limitée dans le temps, ou au contraire chronique, c'est-à-dire persistante. Les patients infectés par P. aeruginosa sont souvent des personnes fragilisées ou immunodéprimées comme les patients en soins intensifs, les grands brûlés, les individus traités par chimiothérapie ou souffrant d’une autre maladie grave comme le sida (Blanc et al., 2007). P. aeruginosa est également un fléau pour les individus atteints de mucoviscidose chez qui cette bactérie provoque des infections pulmonaires chroniques. Les infections à P. aeruginosa représentent un sérieux problème de santé publique : cette bactérie est naturellement résistante à de nombreux antibiotiques, elle atteint souvent des personnes hospitalisées et les traitements antibiotiques qui leur sont prodigués sélectionnent des souches dont la résistance est accrue. Ceci explique pourquoi P.

aeruginosa est la troisième bactérie responsable de maladies nosocomiales après E. coli et S.

aureus.

A.2.a Les infections aiguës

Les infections aiguës à P. aeruginosa interviennent le plus souvent chez des patients déjà hospitalisés pour une autre raison (maladie, opération…). L’infection est favorisée lorsqu’il y a rupture des barrières naturelles de protection, c'est-à-dire des tissus épithéliaux, comme dans le cas de plaie opératoire ou de brûlure sévère. Elle est aussi fréquemment déclenchée par une intrusion extérieure au niveau des organes : outils chirurgicaux, sonde respiratoire, sonde urinaire ou cathéter. Les pneumonies développées par des patients en soins intensifs sont généralement causées par la pose d’une sonde respiratoire. L’étude de Gaines et Edwards sur les maladies nosocomiales a montré que, aux Etats-Unis, P. aeruginosa est responsable de 20% des pneumonies développées dans les unités de soins intensifs (Gaynes and Edwards, 2005) et le taux de mortalité est d’environ 60%. Une autre étude clinique (Valles et al., 2004) a montré que les patients intubés peuvent être colonisés par P. aeruginosa sans pour autant qu’ils développent une infection, c'est-à-dire qu’il y est apparition de symptômes et développement de la maladie. Pour cette raison et parce que P. aeruginosa est

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une bactérie multi-résistante aux antibiotiques, les patients ne sont généralement pas traités avant l’apparition des symptômes.

A.2.b L’infection chronique chez les patients atteints de mucoviscidose

Le cas le plus connu d’infection chronique à P. aeruginosa est l’infection pulmonaire développée chez des patients atteints de mucoviscidose (maladie des mucus visqueux), aussi appelée fibrose kystique (en anglais « cystic fibrosis », CF). La mucoviscidose est une maladie génétique héréditaire, autosomale et récessive (Lyczak et al., 2002). Cliniquement cette maladie se traduit le plus souvent par des troubles pulmonaires et des troubles digestifs.

Les bronchites chroniques sont la cause majeure de mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose dont l’âge moyen de décès est de 27 ans (www.vaincrelamuco.org).

Cependant grâce aux progrès de la recherche et des soins médicaux, l’espérance de vie augmente de jour en jour et est estimée à 46 ans pour un enfant né en 2008.

La mucoviscidose est provoquée par une altération de la protéine CFTR (« Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator ») (Collins, 1992). Cette protéine est principalement exprimée au niveau des épithéliums glandulaires des poumons, de l’intestin grêle, du pancréas, du foie, des reins, des canaux déférents des organes génitaux et des glandes sudoripares de la peau. CFTR est un transporteur membranaire de chlore présent au niveau du pôle apical des cellules épithéliales glandulaires (Li and Naren, 2010). Le transport de chlore par CFTR induit l’activation de tout un ensemble de pompes et de canaux ioniques, ce qui en fait un élément essentiel dans le contrôle de la composition des mucus. L’absence ou le dysfonctionnement de la protéine CFTR chez les individus atteints de mucoviscidose, a pour conséquence un déficit en chlore extracellulaire et un déséquilibre global dans l’homéostasie ionique des mucus (Li and Naren, 2010). Chez une personne saine, le mucus à la surface des bronches est très hydraté (Fahy and Dickey, 2010). Cette caractéristique est nécessaire pour que les cils des cellules épithéliales bronchiques puissent évacuer le mucus sous forme de sécrétions bronchiques vers le système digestif, permettant ainsi l’élimination des poussières et des microorganismes respirés. Les patients atteints de mucoviscidose ont un mucus pulmonaire extrêmement épais et déshydraté qui est donc difficilement éliminé (Fahy and Dickey, 2010, Puchelle et al., 2002). De plus, la composition spécifique du mucus pulmonaire lui confère normalement des propriétés antibactériennes qui sont diminuées chez un patient atteint de mucoviscidose (Bals et al., 2001). Ces deux éléments favorisent la

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colonisation bactérienne et le développement d’infections pulmonaires chroniques. La viscosité importante du mucus des patients souffrant de mucoviscidose pose aussi problème pour le traitement antibiotique des infections puisque les bactéries sont plus difficilement accessibles.

Chez les patients atteints de mucoviscidose, les infections pulmonaires chroniques induisent une inflammation chronique des bronches, qui provoque des lésions irréversibles du système pulmonaire. Ces lésions s’aggravent avec le temps (bronchectasie, formation d’abcès et de kystes) et aboutissent à une insuffisance respiratoire majeure. Le patient ne décède pas de l’infection bactérienne elle-même mais des conséquences de l’inflammation pulmonaire chronique, c'est-à-dire de l’insuffisance respiratoire.

L’un des principaux germes responsable des infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose est P. aeruginosa. 75% des décès sont attribués à une infection pulmonaire chronique à P. aeruginosa (www.vaincrelamuco.org). Malgré différentes antibiothérapies à fortes doses, l’éradication n’est jamais complète et la rémission n’est que temporaire pour le patient. Cependant l’amélioration des traitements médicaux a permis de réduire les épisodes infectieux tant au niveau de leur durée que de leur fréquence et de leur intensité, ce qui se traduit par l’augmentation de la durée de vie des patients. C’est pourquoi il est important de mieux comprendre les mécanismes de l’infection bactérienne chez ces patients.

A.2.c P. aeruginosa et la résistance aux antibiotiques

P. aeruginosa est une bactérie naturellement résistante à de nombreux antibiotiques appartenant à diverses familles : pénicillines G, A et M, céphalosporines de 1e et 2e génération, cotrimoxazole, macrolides, cyclines, phénicolés, quinolones de 1e génération et kanamycine. De plus P. aeruginosa montre une capacité d’adaptation importante (capacité à exprimer rapidement les gènes appropriés aux conditions environnementales) et une grande plasticité génomique qui sont à l’origine d’une résistance dite acquise. Cette résistance acquise aux antibiotiques est la conséquence de mutations génomiques et/ou de transferts horizontaux de plasmides de résistance entre bactéries, et d’une forte pression de sélection en milieu hospitalier (Normark and Normark, 2002). Le pourcentage de P. aeruginosa résistantes aux antibiotiques augmentent d’année en année et concernent en Europe 10 à 25% des souches de P. aeruginosa, dont bon nombre sont multi-résistantes, c'est-à-dire résistante au

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moins à trois classes différentes d’antibiotiques (Souli et al., 2008) (et d’après EARSS

« European Antibiotics Resistance Surveillance System », 2007) .

Les mécanismes de résistance aux antibiotiques de P. aeruginosa sont variés (Lister et al., 2009). Cette bactérie synthétise des enzymes capables d’hydrolyser divers antibiotiques : bêtalactamases à large spectre, pénicillinases, céphalosporinase, carbapénémases… Une surexpression de ces enzymes augmente la résistance à la classe d’antibiotiques correspondante. La résistance peut aussi être le résultat d’une régulation négative des porines de surface par lesquelles les antibiotiques pénètrent dans la cellule (OprD par exemple), ou d’une surexpression de systèmes d’efflux qui permettent d’évacuer les molécules antibiotiques hors de la cellule (pompes RND codées par les gènes mex) (Lister et al., 2009, Mao et al., 2002). Tous ces mécanismes de résistance aux antibiotiques font partie des nombreux facteurs de virulence de P. aeruginosa (voir ci-dessous).

A.3. Les facteurs de virulence de P. aeruginosa

A.3.a P. aeruginosa et la virulence

P. aeruginosa fait partie de la famille des protéobactéries. C’est un organisme aérobique qui vit dans les sols et dans l’eau et est capable de supporter une large gamme de température allant de 4 à 40°C. Le séquençage de la souche PAO1 en 2000 a montré que P.

aeruginosa possède un génome de grande taille avec 6,3 millions de paires de bases et 5570 gènes (Stover et al., 2000) (www.Pseudomonas.com/index.jsp). P. aeruginosa est un pathogène opportuniste qui, grâce à ses nombreux facteurs de virulence (Figure 1), peut infecter l’homme, les animaux et les plantes, et qui, comme je l’ai présenté ci-dessus (Chapitre I : A.2.c), est largement résistant aux antibiotiques.

P. aeruginosa est un bacille à Gram négatif. Sa paroi est composée de deux membranes, une interne et une externe, d’un peptidoglycane situé dans l’espace périplasmique entre les deux membranes et d’une couche externe de lipopolysaccharides (LPS) ancrés dans la membrane externe. Les LPS sont un assemblage de lipides et de glucides. On distingue trois parties : le lipide A, le polysaccharide central et les chaines latérales O (ou antigène O).

Les LPS sont des endotoxines, c'est-à-dire des molécules reconnues par le système immunitaire et capables de déclencher une réponse inflammatoire. L’hôte infecté développe des anticorps spécifiques de l’antigène O, mais la bactérie est capable de contrecarrer le

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système immunitaire en modifiant rapidement la nature de cette chaine latérale (Pier, 2007).

Les LPS font donc partie à double titre des facteurs de virulence de P. aeruginosa, en permettant aux bactéries soit d’échapper au système immunitaire, soit de le suractiver.

Figure 1 : Les facteurs de virulence de P. aeruginosa.

P. aeruginosa possèdent de nombreux facteurs de virulence : les lipopolysaccharides (LPS), le flagelle, les pili de type IV, les exoenzymes injectées directement dans le cytoplasme de la cellule cible via le système de sécrétion de type III (SSTT), les protéines ou molécules sécrétées dans le milieu extérieur : la protéase alcaline, l’élastase, la collagénase, l’hémolysine, l’exotoxine A, les alginates formant le biofilm, les chromophores (pyocyanine, pyoverdine, pyocheline), et finalement le quorum-sensing (QS) qui régule bon nombre de ces facteurs de virulence.

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P. aeruginosa exprime à sa surface deux autres facteurs de virulence : le flagelle et les pili de type IV, impliqués dans 2 types différents de motilité. Le flagelle est présent à l’un des pôles de la bactérie et par des mouvements de rotation, il permet à P. aeruginosa de « nager » dans les milieux liquides (Veesenmeyer et al., 2009). Les pili de type IV sont des extensions développées par la bactérie au niveau de la membrane externe. Il s’agit d’un assemblage de protéines, les pilines, arrangées en hélice et formant un cylindre (Hahn, 1997). Cette structure permet à la bactérie d’adhérer à des surfaces ou à des cellules et de se déplacer sur ce substrat par élongation-rétraction de ces pili (Semmler et al., 1999). Flagelle et pili de type IV jouent un rôle dans la dispersion de la bactérie et son adhésion aux cellules hôtes, des fonctions importantes dans la colonisation bactérienne et la mise en place de l’infection.

Beaucoup de protéines sécrétées par P. aeruginosa ont la capacité d’attaquer les tissus ou les cellules de l’hôte. Les protéases sécrétées dans l’environnement comme la protéase alcaline, les élastases et la collagénase dégradent l’élastine et le collagène et fragilisent les tissus de l’hôte (Holder and Neely, 1989) ce qui favorise l’infection. La phospholipase C est une enzyme qui dégrade les phospholipides présents dans les membranes eucaryotes et l’hémolysine sécrétée par P. aeruginosa induit spécifiquement la lyse des hématies en formant un pore dans leur membrane. Le système de sécrétion de type III (SSTT) permet d’injecter des toxines, appelées exoenzymes, directement dans la cellule hôte (Chapitre I : A.3.b). L’exotoxine A (ExoA) est une autre toxine, sécrétée par P. aeruginosa et impliquée dans la virulence bactérienne. ExoA se lie sur son récepteur spécifique à la surface de la cellule hôte et est endocytée. Une fois dans la cellule le domaine catalytique d’ExoA inactive le facteur d’élongation 2 (eEF-2) ce qui inhibe la synthèse protéique et induit finalement la mort de la cellule (Wolf and Elsasser-Beile, 2009).

P. aeruginosa est capable de sécréter de nombreuses substances. Les exopolysaccharides permettent de créer une matrice extracellulaire englobant les bactéries.

Cet ensemble forme le biofilm, une structure qui protège les bactéries du système immunitaire et des traitements antibiotiques, et qui favorise leur multiplication à l’intérieur de l’hôte (Chapitre I : A.3.c). P. aeruginosa sécrète également différents chromophores : la pyocyanine (pigment bleu-vert) (d’où le deuxième nom donné à P. aeruginosa, bacille pyocyanique), la pyoverdine ou fluorescéine (pigment vert-jaune) et la pyorubine (pigment brun-rouge). La pyocyanine induit une augmentation de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) chez la cellule hôte (Lau et al., 2004a, Liu and Nizet, 2009). Ce stress oxydatif interfère avec de nombreux mécanismes cellulaires comme la croissance, la respiration

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cellulaire, l’homéostasie calcique, et bien d’autres. Les mutants de la souche PA14 défectueux dans la synthèse de pyocyanine ont une virulence diminuée dans le modèle d’infection pulmonaire chez la souris (Lau et al., 2004b). La pyocheline, un autre chromophore sécrété par P. aeruginosa, induit lui aussi un stress oxydatif dans les cellules épithéliales humaines en culture (Britigan et al., 1997). Il a également été montré que la pyoverdine est un facteur de virulence chez la souris, lors d’infection pulmonaire ou au niveau d’une brûlure (Takase et al., 2000, Meyer et al., 1996). Tous ces chromophores sont aussi des sidérophores, c'est-à-dire des chélateurs de fer. P. aeruginosa capte le fer de l’environnement en sécrétant les sidérophores puis en les récupérant grâce à des récepteurs spécifiques (Cornelis, 2010). Le fer étant un facteur de croissance essentiel pour cette bactérie, les sidérophores sont des facteurs de virulence à double titre.

La régulation des facteurs de virulence bactérienne est très importante dans le contrôle de l’infection. Un élément essentiel de cette régulation génétique est le quorum-sensing (QS).

Il s’agit d’un système complexe de communication entre bactéries qui contrôle l’expression de nombreux gènes de virulence. Pour cette raison le QS est lui-même considéré comme un facteur de virulence (Chapitre I : A.3.d).

A.3.b Le système de sécrétion de type III

Le système de sécrétion de type III (SSTT) est un élément important dans la cytotoxicité de P. aeruginosa, comme pour de nombreuses autres bactéries Gram négatives, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia. Cette structure en forme de seringue est assemblée à la surface de la bactérie et possède une organisation similaire à celle du flagelle (Blocker et al., 2003). Le SSTT permet l’injection des toxines bactériennes, aussi appelées effecteurs ou exoenzymes, directement dans le cytoplasme de la cellule cible. Dans le cytoplasme bactérien, ces exoenzymes sont accompagnées de leurs protéines chaperonnes qui les protègent de l’agrégation, de la protéolyse, et les maintiennent en conformation dépliée, conformation nécessaire à leur sécrétion via le SSTT (Ghosh, 2004).

Le SSTT est composé du sécréton, appareil assurant la sécrétion des toxines bactériennes, et du translocon, appareil permettant la translocation des toxines directement dans le cytoplasme de la cellule cible (Figure 1). Le sécréton est formé d’un canal traversant les deux membranes bactériennes, qui est prolongé par une aiguille extracellulaire de 500 Å de long (Blocker et al., 2003). Le translocon est un complexe multiprotéique inséré dans la

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membrane plasmique de la cellule cible. Il est formé, chez P. aeruginosa, par les protéines PopB et PopD (Pop pour « Pseudomonas Outer Protein »). PopB et PopD s’oligomérisent et forment un pore dans la membrane de la cellule hôte. In vivo, l’assemblage du translocon PopB/D fonctionnel dans la membrane de la cellule cible nécessite la présence d’une protéine soluble, PcrV, aussi appelée antigène V (Goure et al., 2004). Les gènes codant pour les protéines translocatrices PopB et PopD, leur chaperonne PcrH, ainsi que PcrV se situent sur le même opéron pcrGVHpopBD. Les mutants de P. aeruginosa déficients en protéines PopB et PopD sont non-cytotoxiques et incapables d’injecter les exoenzymes dans la cellule cible (Dacheux et al., 2001). Le scénario de formation du translocon semble être le suivant : dans le cytoplasme bactérien, les protéines PopB et PopD sont chacune associée à leur chaperonne PcrH. Après contact avec la cellule cible, PopB et PopD sont sécrétées via le sécréton, puis s’oligomérisent et s’insèrent dans la membrane de la cellule cible, probablement grâce à leurs domaines prédits d’interaction protéine-protéine de type « coiled-coil » et leurs domaines hydrophobes (Shoehn et al., 2003). L’injection des toxines directement dans le cytoplasme de la cellule cible est alors possible.

Les exoenzymes (ExoS, ExoT, ExoU et ExoY) interfèrent avec les voies de signalisation de la cellule hôte. ExoU est l’exoenzyme la plus virulente de P. aeruginosa.

Dans la cellule cible, elle est transférée au niveau de la membrane plasmique qu’elle dégrade rapidement grâce à son activité phospholipase A2, ce qui induit une mort nécrotique de la cellule (Sato et al., 2003). De plus ExoU induit une inflammation excessive, via la production d’acide arachidonique et l’induction de l’expression de gènes pro-inflammatoire, ce qui conduit à la dégradation des tissus environnants (Veesenmeyer et al., 2009). Les exoenzymes ExoS et ExoT possèdent une activité ADP-ribosyltransférase et une activité GAP spécifique des protéines G de la famille Rho (Goehring et al., 1999, Liu et al., 1997). L’activité GAP inhibe les protéines Rac, Cdc42 et Rho, ce qui induit une réorganisation du cytosquelette actine et inhibe la mobilité cellulaire et la phagocytose (Krall et al., 2002). L’activité ADP- ribosyltransférase inhibe la division et la différenciation cellulaire et induit l’apoptose (Barbieri and Sun, 2004). ExoY est une adénylate cyclase qui produit de l’AMPc. Son rôle exact dans la virulence de P. aeruginosa reste inconnu (Sayner et al., 2004).

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A.3.c Le biofilm

Les bactéries P. aeruginosa sont capables de se regrouper et d’adhérer entre elles ainsi qu’à une surface (tissu, cathéter, sonde médicale…) pour former des micro-colonies. Les bactéries de ces micro-colonies sécrètent une matrice extracellulaire qui englobe les bactéries et assure leur cohésion entre elles et leur adhésion à la surface. L’ensemble des bactéries de la micro-colonie et la matrice extracellulaire sécrétée forment le biofilm (Figure 2). Dans cette structure, la matrice extracellulaire représente 85% du volume total. Elle est composée principalement de polysaccharides (Pel, Psl, alginates), de protéines d’adhésion (lectines, CdrA, pili de type IV, Cup fimbriae), et d’ADN extracellulaire provenant des bactéries elles- mêmes (Harmsen et al., 2010).

La matrice extracellulaire est suffisamment perméable pour permettre la diffusion des nutriments et assurer une multiplication des bactéries. D’un autre côté, cette même matrice joue le rôle de barrière de protection pour les bactéries, à la fois contre les cellules et les anticorps du système immunitaire qui ne peuvent accéder aux bactéries, et contre la plupart des antibiotiques (Hoiby et al., 2010).

Le biofilm augmente d’une part les interactions bactérie-surface, ce qui participe à la colonisation des tissus de l’hôte, et d’autre part les interactions bactérie-bactérie, ce qui favorise la production d’autres facteurs de virulence grâce au quorum-sensing, système de régulation qui contrôle lui-même la formation du biofilm (Davies et al., 1998) (Figure 2). Le biofilm est un des facteurs de virulence les plus importants dans les infections chroniques à P.

aeruginosa, en particulier les infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose (Hassett et al., 2010).

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Figure 2 : La formation du biofilm par P. aeruginosa.

Les bactéries planctoniques se déplacent à l’aide du flagelle jusqu’à trouver une surface adéquate à laquelle adhérer grâce aux protéines Cup et aux adhésines. Les bactéries se regroupent, adhèrent les unes aux autres grâce aux pili de type IV pour former une micro-colonie. Les bactéries se multiplient et sécrètent la matrice extracellulaire (polysaccharides, molécules d’adhésions et ADN extracellulaire), donnant naissance au biofilm.

D’après (Filloux and Vallet, 2003).

A.3.d Le quorum-sensing

Le quorum-sensing (QS) est un moyen de communication entre bactéries qui leur permet d’exprimer de façon coordonnée un ensemble de gènes au sein de leur population. Ce système repose sur la sécrétion dans l’environnement de molécules diffusibles, qui sont perçues par toutes les bactéries. La quantité de ces molécules sécrétées s’élève lorsque le nombre de bactéries augmente, et permet à la population bactérienne d’ajuster son comportement en fonction de sa densité. Des analyses transcriptomiques ont montré que le QS régule la transcription d’environ 300 gènes, ce qui représente 6% du génome de P.

aeruginosa (Schuster and Greenberg, 2006). Parmi les gènes contrôlés par le QS, il existe de nombreux facteurs de virulence comme entre autres l’élastase, la protéase alcaline, l’exotoxine A, les rhamnolipides et la formation du biofilm (Smith and Iglewski, 2003) (Figure 1). Ce système permet donc d’activer les gènes de virulence de façon simultanée, au sein de la population bactérienne, lorsque le nombre de bactéries est suffisant pour que ces facteurs de virulence aient un effet sur l’hôte.

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Chez P. aeruginosa deux systèmes de QS ont été très bien caractérisés : le système las et le système rhl. Il s’agit de systèmes d’auto-induction, reposant chacun sur un couple de protéines, une protéine régulatrice et une enzyme auto-inductrice : LasR/LasI et RhlR/RhlI.

Les enzymes inductrices LasI et RhlI synthétisent de petites molécules capables de diffuser dans la population bactérienne, les acylhomosérine lactones (AHL) (Lazdunski et al., 2004, Ruimy and Andremont, 2004). Lorsque le taux d’AHL dans l’environnement atteint un seuil critique, reflétant une densité importante de bactéries, les AHL qui traversent la membrane bactérienne se lient aux protéines régulatrices LasR et RhlR qui activent d’une part la transcription des gènes lasI et rhlI, d’où le nom de système d’auto-induction, et d’autre part, la transcription des gènes de virulence (Figure 3). La protéine LasR induit la transcription des gènes de virulence lasA, lasB, aprA et toxA codant respectivement pour les élastases A et B, une protéase alcaline et l’exotoxine A. Le système las est aussi capable d’activer le système rhl en régulant positivement la transcription des gènes rhlR et rhlI. La protéine RhlR active les gènes rhlA et rhlB contrôlant la production des rhamnolipides, ainsi que les gènes lasA, lasB et aprA, comme le fait le système las.

Un troisième système de QS a été découvert plus récemment, le système pqs pour

« Pseudomonas Quinolone Signal », dont les molécules diffusibles sont les 2-alkyl-4- quinolone (AQ) (Dubern and Diggle, 2008) (Figure 3). Ces molécules sont synthétisées à partir de l’opéron pqsABCDE qui est régulé par la protéine PqsR. Comme les systèmes las et rhl, le système pqs est auto-inductible. PqsR induit la synthèse de pyocyanine et de pyoverdine qui sont impliquées dans la virulence de P. aeruginosa (Liu and Nizet, 2009). Le système pqs est étroitement lié aux deux autres systèmes las et rhl puisque la protéine LasR contrôle positivement le gène pqsR et que la protéine RhlR contrôle négativement les gènes pqsR et pqsABCDE. De plus la protéine PqsR régule le système rhl en activant l’expression de rhlI. Le QS forme un réseau de régulation complexe (Figure 3), qui montre l’importance pour la population bactérienne d’activer ses facteurs de virulence de façon contrôlée lors de l’infection.

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