Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing
B.4. h Localisation de la protéine Vps13
Dans le but de localiser la protéine Vps13 dans les cellules de D. discoideum, j’ai construit un plasmide permettant d’insérer par recombinaison homologue le gène codant pour la GFP (« Green Fluorescente Protein ») en aval de la séquence codante de vps13, afin de générer des cellules exprimant la protéine de fusion Vps13-GFP. J’ai généré un fragment d’ADN par PCR, contenant les 1000 dernières paires de bases du gène vps13 entourées de part et d’autre par les sites de restriction PstI et BamHI, grâce aux oligos OL7 et OL8 (Figure 29A et B). Ce fragment de PCR est inséré en amont du fragment d’ADN codant pour la GFP dans le plasmide 3’GFP-BSR digéré par PstI et BamHI (Figure 29A). Le plasmide pSP-3’GFP-BSR contient les cassettes de sélection BSR et AMPr, permettant de sélectionner les bactéries ou les cellules de D. discoideum ayant intégré ce plasmide. Le nouveau plasmide nommé pVPS13-GFP est transfecté dans les cellules sauvages de D. discoideum. Les cellules ayant intégré le plasmide pVPS13-GFP par recombinaison homologue sont sélectionnées dans un milieu contenant de la blasticidine et clonées en dilution limite. L’intégration correcte du plasmide est vérifiée par PCR. Les clones 1, 2 et 5 ont intégré le plasmide pVPS13-GFP (Figure 29B et C). Ces trois clones expriment correctement la protéine de fusion Vps13-GFP (Figure 29D).
Figure 29 : Obtention des cellules VPS13-GFP.
A. Schéma montrant comment les cellules VPS13-GFP ont été générées par recombinaison homologue entre le plasmide pVPS13-GFP et l’ADN génomique des cellules sauvages (WT).
B. Description des oligos utilisés pour créer et identifier les cellules VPS13-GFP (références OL7 à OL10B : 250507, et OL2 : 190505).
C. Identification des mutants VPS13-GFP par PCR (30sec à 94°C, 30sec à 58°C, 3min à 65°C, 35 cycles). La table indique les couples d’oligos utilisés et la taille des fragments attendus. A droite, les gels d’agarose 1%
montrent les résultats des PCR avec les couples d’oligos OL9B+OL10A et OL9B+OL2, obtenus avec l’ADN des cellules WT ou des clones transfectés. Les clones 1, 2 et 5 ont intégré le plasmide pVPS13-GFP.
D. Western-blot et immunodétection de la protéine de fusion Vps13-GFP dans un lysat cellulaire, avec les anticorps primaires anti-GFP (Boehringer, dilution 1:500) et les anticorps secondaires anti-souris couplés à la HRP (1:3000), et révélés à l’avidine.
L’intégration du plasmide pVPS13-GFP peut générer une mutation délétère du gène vps13 qui empêcherait la production de la protéine Vps13-GFP ou la rendrait non fonctionnelle. Pour vérifier que la protéine Vps13-GFP est bien fonctionnelle, la capacité des cellules VPS13-GFP à pousser sur B. subtilis a été vérifiée. Les trois clones VPS13-GFP poussent sur B. subtilis de façon similaire aux cellules WT (Figure 30), ce qui montre que la protéine Vps13-GFP est fonctionnelle dans ces cellules puisqu’une protéine non-fonctionnelle induit un défaut de pousse sur B. subtilis (mutant vps13).
Figure 30 : Test de pousse des cellules VPS13-GFP sur B. subtilis.
La pousse des 3 clones VPS13-GFP a été testée sur B. subtilis, et comparée à celle des cellules WT et vps13.
10'000, 1'000, 100 et 10 cellules de D. discoideum ont été déposées sur la couche de bactéries (en noir). Lorsque les cellules sont capables d’ingérer et de tuer les bactéries, elles créent une plage de phagocytose (en blanc). Les 3 clones ne montrent aucune différence de phénotype et sont tous trois capables de pousser sur B. subtilis ce qui indique que la protéine Vps13-GFP est fonctionnelle.
Le but était de déterminer la localisation cellulaire de la protéine Vps13. J’ai donc analysé les cellules VPS13-GFP en microscopie. Malheureusement je n’ai jamais pu observer un signal correspondant à la GFP, même par immunofluorescence avec des anticorps anti-GFP. La protéine n’est peut être pas suffisamment exprimée pour être détectable par ces méthodes. J’ai également testé des anticorps de lapin anti-peptides-Vps13 sur des cellules WT mais sans succès, que ce soit en Western-blot ou en immunofluorescence. Toutefois, la protéine Vps13-GFP est détectable par Western-blot avec des anticorps anti-GFP dans un lysat de cellules VPS13-GFP (Figure 29D). Il serait intéressant de mesurer par Western-blot la présence de la protéine Vps13-GFP au niveau des phagosomes isolés à partir des cellules VPS13-GFP (comme nous l’avons testé pour la protéine Kil2 (Lelong et al., 2011), Chapitre II : B.3.b).
B.4.i Conclusion
Le mutant vps13 présente un défaut d’endocytose de 40% comparé aux cellules WT et un léger défaut de maturation de ses phagosomes. Ce mutant est incapable de pousser sur K.
pneumoniae Kp21 en milieu sans glucose, ainsi que sur S. epidermidis. Le mutant vps13 présente également des défauts de pousse partiels sur B. subtilis, M. luteus et le mutant DP28 (pchH) de P. aeruginosa. A ce stade de caractérisation, aucun lien ne peut être fait entre le défaut d’endocytose et le défaut de pousse sur bactérie et aucune hypothèse ne peut être proposée quant à l’action de la protéine Vps13 chez D. discoideum.
Il est intéressant de constater que le mutant vps13 présente des défauts de pousse assez similaires à ceux du mutant mu3 et dans une moindre mesure à ceux des mutants lvsA et lvsB (Figure 19 p.118 et Chapitre II : B.2). Comme vps13, ces trois mutants sont affectés dans les voies d’endocytose et de phagocytose (voir ci-dessus). Le gène mu3 code pour la sous-unité µ du complexe AP-3 (« clathrin associated adaptator protein ») qui contrôle le transport des protéines dans la voie d’endocytose (Nakatsu and Ohno, 2003). Le mutant mu3 présente des défauts de triage des protéines dans la voie d’endocytose, un important défaut de maturation des phagosomes et une capacité d’exocytose des lysosomes réduite de 64% (Charette et al., 2006, Bennett et al., 2008, Charette and Cosson, 2008). Le mutant lvsA présente un important défaut de phagocytose (diminution de 70%) et une expression anormalement élevée de H+ -ATPase dans les endosomes précoces (Cornillon et al., 2002). Le mutant lvsB quant à lui possède des endosomes de plus grande taille et trois fois moins d’endosomes tardifs, et il montre une sécrétion plus importante de ses enzymes lysosomales en condition induite (milieu SB) (Cornillon et al., 2002, Harris et al., 2002, Charette and Cosson, 2007). Les mutants lvsA, lvsB, mu3 et vps13 ont donc en commun une voie d’endocytose altérée et des défauts de pousse spécifiques des mêmes bactéries. Une des hypothèses possible est qu’un problème de reconnaissance des bactéries et d’activation des cellules soit à l’origine des défauts de pousse observés. Chez D. discoideum, on ne connait rien sur la reconnaissance des bactéries par les cellules. Existe-t-il des récepteurs spécifiques en fonction du type de bactéries rencontrées ? Au cours de ma thèse, j’ai montré que les gènes impliqués lors d’une interaction amibe-bactérie diffèrent en fonction de la bactérie. Ceci suggère fortement qu’il existe des mécanismes de reconnaissance des bactéries mis en œuvre par la cellule. Il est probable qu’il existe par exemple un récepteur spécifique qui permet à la cellule de reconnaitre M. luteus et d’activer les voies de signalisation qui lui sont nécessaires pour
pousser sur cette bactérie. Les défauts dans la voie d’endocytose se traduisant souvent par un mauvais triage des protéines, il est possible que ce récepteur soit mislocalisé dans les mutants lvsA, lvsB, mu3 et vps13.