c Identification du site d’insertion

Une fois les mutants sélectionnés, le site d’insertion du plasmide de mutagenèse doit être identifié. Pour cela, l’ADN génomique de chaque mutant mEL est purifié puis digéré par différentes enzymes de restriction ne coupant pas dans le plasmide de mutagenèse pSC. Ces enzymes coupent le génome de D. discoideum et un des nombreux fragments d’ADN obtenus contient le plasmide pSC entouré des régions flanquantes d’ADN génomique (Figure 15).

L’ADN digéré est ensuite religué puis utilisé pour transformer E. coli. La cassette de sélection ampicilline présente dans le plasmide pSC permet de sélectionner les bactéries transformées

Figure 15 : Identification du site d’insertion de pSC.

Après purification de l’ADN génomique des mutants mEL, l’ADN est digéré par une enzyme de restriction ne coupant pas pSC. Les plasmides ainsi créés sont religués et transformés dans E. coli. Le plasmide d’identification du site d’insertion contient le plasmide de mutagenèse pSC et les régions génomiques situées de part et d’autre du site d’insertion de pSC. Les bactéries contenant ce plasmide d’identification sont sélectionnées en milieu ampicilline. Le plasmide d’identification est purifié, et les régions génomiques flanquantes sont séquencées à l’aide d’oligos s’hybridant sur pSC. Le site d’insertion de pSC est déterminé par l’analyse des séquences et leur comparaison avec la base de données Dictybase.

qui contiennent le plasmide d’identification, c'est-à-dire le plasmide pSC avec les séquences d’ADN génomique situées de part et d’autre du site d’insertion de pSC (Figure 15). Ces régions flanquantes d’ADN génomique sont séquencées avec deux oligos s’hybridant sur le plasmide pSC. Le génome de D. discoideum étant totalement séquencé (Eichinger et al., 2005) et disponible sur Dictybase, le site d’insertion du plasmide de mutagenèse dans le génome est facilement identifiable.

Matériels et méthodes

Extraction de l’ADN génomique. 200mL de culture de mutant mEL à 2.10⁶ cellules/mL sont centrifugés à 3000rpm, 4°C, pendant 15min. Le culot est lavé une fois avec 15mL de NaCl 0.2%, et centrifugé à 2000rpm, 4°C, 10min. Le culot est resuspendu et vortexé pendant 30sec dans 10mL de tampon de lyse (10mM MgOAc/4H2O, 10mM NaCl, 30mM Hepes, 10%

sucrose, 2% NP40, pH7,5). Après 10min sur la glace, le lysat est homogénéisé à l’aide d’une pipette, puis les noyaux cellulaires sont collectés par centrifugation à 5000rpm, 4°C, pendant 15min. Pour lyser un maximum de cellules, ces étapes d’incubation en tampon de lyse à 4°C et de centrifugation sont répétées une fois. Ensuite, les noyaux sont resuspendus dans 3mL de solution HMK (50mM Hepes pH 7,5, 40mM MgOAc/4H2O, 20mM KCl), auxquels sont ajoutés 150µL de SDS 20%. Après avoir mélangé en retournant le tube délicatement plusieurs fois, la suspension est incubée à température ambiante pendant 10min. 150µL de NaCl 4M sont ajoutés et à nouveau, après avoir mélangé délicatement, la suspension est incubée à température ambiante pendant 10min. L’ADN génomique est ensuite extrait avec un volume équivalent de phénol/chloroforme/isoamyl-alcool (25:24:1, pH 8). Après avoir mélangé vivement pendant 15sec, l’ADN est centrifugé à 4000rpm, température ambiante pendant 10min, et récupéré dans le surnageant. Il est ensuite extrait par un volume égal de HCCl₃, à nouveau centrifugé à 4000rpm, température ambiante, 5min. L’ADN génomique contenu dans le surnageant est ensuite précipité avec 1/10^e de volume de NaOAc (3M, pH5,2) et 2,5 volumes d’éthanol 100%. Après centrifugation (4000rpm, 30min), le culot d’ADN est précipité à l’éthanol (voir protocole ci-dessous) et dissout dans 300 à 600µL de tampon TE (pH 8). Puis une incubation à température ambiante pendant 30min est effectuée en présence de RNAse A, pour éliminer les ARN contaminants. L’ADN est à nouveau précipité à l’éthanol puis resuspendu dans du tampon TE.

Digestion enzymatique de l’ADN génomique. L’ADN génomique est digéré par une enzyme de restriction ne coupant pas dans le plasmide de mutagenèse pSC (25µL d’ADN génomique, 30 unités d’enzymes, 10µL de tampon 10X spécifique de l’enzyme, dans l’eau

pour un volume final de 100µL ; incubation 2h à 37°C). Pour chaque ADN génomique purifié, c'est-à-dire pour chaque mutant mEL, différentes enzymes de restriction sont testées : ClaI, BclI, SpeI, EcoRI, EcoRV, SalI, NcoI, NdeI, PstI, HpaI, SphI, StuI. Après la digestion, l’ADN est purifié avec 200µL de phénol/chloroforme/isoamyl-alcool (25:24:1, pH 8), centrifugé à 10000rpm, 3min à température ambiante. L’ADN est récupéré dans la phase aqueuse (~200µL).

Précipitation à l’éthanol. L’ADN (200µL) est précipité avec 1/10^e du volume de NaOAc (3M, pH5,2) (20µL) et 3 volumes d’éthanol 100% (600µL). Après centrifugation (10000rpm, 30min à 4°C), le culot d’ADN est lavé à l’éthanol 70% (1mL), puis à l’éthanol 100% (1mL), séché et resuspendu dans de l’eau (44µL).

Ligation du plasmide. 44µL d’ADN digéré sont incubés avec l’enzyme T4-DNA-ligase (1µL) en présence de son tampon spécifique (5µL de tampon 10X), dans un volume final d’eau de 50µL, à 16°C pendant 16h. Après la ligation, l’ADN est à nouveau précipité à l’éthanol.

Préparation des bactéries électro-compétentes. Une préculture (37°C, 16h) est réalisée à partir d’une colonie bactérienne dans 100mL de milieu Super-broth (1% MOPS, 2% extrait de levure, 3% de bacto-tryptone, pH 7). 1L de milieu Super-broth complémentés par 5mL de glucose 2M et 9mL de glucose 20%, sont inoculés avec la préculture et incubés à 37°C jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne 0,5-0,6. La culture est incubée 15 à 30min dans la glace.

Toutes les étapes suivantes sont réalisées à 4°C. Les bactéries sont centrifugées à 3000rpm, 15min. Le culot est lavé une fois dans 1L de glycérol 10%, puis dans 500mL et enfin dans 50mL de glycérol 10%. Le culot est resuspendu dans 4mL de glycérol 10%. Les bactéries sont réparties dans des tubes Eppendorf de 1,5mL (40µL par tube) et conservées à -80°C.

Transformation des bactéries électro-compétentes. Les bactéries SURE électro-compétentes (40µL) sont électroporées en présence de 10µL d’ADN religué (cuvette d’électroporation 0,1cm, 200 ohms, 25µF, 1,7kV). Les bactéries sont ensuite incubées 1h à 37°C dans 1mL de LB, puis étalées sur boite de Pétri LB ampicilline 100mg/mL et incubées à 37°C pendant la nuit. Les bactéries transformées par un fragment ne contenant que de l’ADN génomique de D. discoideum ne pousseront pas et les bactéries contenant le plasmide d’identification (plasmide pSC + ADN génomique) seront sélectionnées.

Purification et analyse du plasmide par digestion enzymatique. 1 colonie de bactéries transformées est mise en culture dans 3mL de LB, à 37°C pendant 16h. Le plasmide est purifié grâce au kit Fast Plasmid Mini d’Eppendorf, et resuspendu dans 50µL d’H2O. Avant

d’envoyer le plasmide au séquençage, nous vérifions qu’il correspond à ce que l’on attend en le digérant d’une part par l’enzyme de restriction NotI qui sépare le plasmide pSC des régions génomiques flanquantes (2 fragments attendus), et d’autre part par l’enzyme de restriction utilisée pour digérer l’ADN génomique du mutant, qui linéarise le plasmide d’identification (1 seul fragment attendu). L’ADN est déposé sur gel d’agarose 0,8%.

Séquençage du site d’insertion de pSC dans le génome de D. discoideum. L’ADN des clones (ayant donné le résultat attendu au test par digestion enzymatique) est purifié à l’aide du kit de MaxiPrep Nucleobond PC 500 de Macherey-Nagel. L’ADN est séquencé avec les oligos s’hybridant sur le plasmide pSC. Une fois les séquences obtenues, le site d’insertion de pSC est identifié par alignement de séquence dans la base de données Dictybase (www.dictybase.org).