a Technique : Restriction Enzyme-Mediated Integration (REMI)

La technique de mutagenèse REMI permet d’introduire des mutations dans le génome de D. discoideum de façon aléatoire. Les cellules de D. discoideum sont perméabilisées transitoirement et électroporées en présence d’une enzyme de restriction et d’un plasmide de mutagenèse linéarisé (Figure 12A). L’électroporation permet de faire entrer dans la cellule le plasmide et l’enzyme. L’endonucléase digère l’ADN génomique de D. discoideum et génère des extrémités compatibles avec le plasmide linéarisé afin de favoriser son insertion dans le génome. Cette méthode REMI permet d’augmenter la fréquence de transformation des cellules et assure une insertion aléatoire du plasmide dans le génome (Kuspa and Loomis, 1992, Guerin and Larochelle, 2002, Kuspa, 2006). Les cellules ayant intégré le plasmide dans leur génome sont sélectionnées en utilisant la résistance à la blasticidine portée par le plasmide (Figure 12A). Les cellules mutées sont ensuite clonées individuellement dans des plaques à 96 puits afin d’obtenir pour chaque mutation générée par l’insertion du plasmide une population cellulaire clonale. L’insertion du plasmide dans une séquence codante inactive le gène correspondant. Comme le génome de D. discoideum est compact (62% de séquence

codante) et haploïde (Eichinger et al., 2005), une proportion importante des cellules ainsi transfectées représentent des KO spécifiques de divers gènes.

Cette technique est simple et permet d’obtenir rapidement des KO de D. discoideum.

Le site d’insertion du plasmide de mutagenèse est identifié en purifiant l’ADN génomique, puis en transformant des bactéries par cet ADN génomique préalablement digéré et religué, ce qui permet de séquencer le site d’insertion dans le génome de D. discoideum (www.dictybase.org) (Chapitre II : B.1.c). La mutagenèse par REMI présente toutefois quelques inconvénients. L’insertion du plasmide dans des gènes de grande taille est plus fréquente que dans des gènes de petite taille ce qui biaise l’apparition de mutation au niveau des grands gènes. De plus, il existe des sites préférentiels du génome, que nous avons appelés

« hotspots », dans lesquels le plasmide s’insère très fréquemment (Chapitre II : B.1.e).

L’enzyme de restriction utilisée est également susceptible de créer des mutations, des délétions ou des recombinaisons dans le génome, indépendamment de l’insertion du plasmide.

Ces mutations peuvent être à l’origine du phénotype du mutant, c’est pourquoi il est essentiel de refaire un KO spécifique du gène dans la souche sauvage de D. discoideum après l’identification du site muté (Chapitre II : B.1.f).

Matériels et méthodes

Construction du plasmide de mutagenèse pSC. Le plasmide de mutagenèse pSC a été construit dans notre laboratoire par Sophie Cornillon. Il est dérivé du plasmide pSP73 (Promega, n°P2221). Ce plasmide contient une cassette de sélection codant pour la résistance à l’ampicilline, qui permet la sélection des bactéries ayant intégré le plasmide. Le site de clonage (MCS, « Multi Cloning Site ») de pSP73 a été ouvert par digestion enzymatique par NdeI (site de coupure CA/TATG) et HpaI (GTT/AAC), puis remplacé par le fragment de PCR OL1-OL2 contenant les sites de restriction NotI (GC/GGCCGC) et BamHI (G/GATCC) avec des extrémités compatibles NdeI et HpaI. Ce plasmide intermédiaire a été nommé pSCpre1 (Figure 13A et B). Un deuxième fragment de PCR OL3-OL4 a été ajouté au niveau des sites BamHI et HpaI de pSCpre1 afin d’ajouter un second site de coupure NotI et les sites HindIII (A/AGCTT) et XbaI (T/CTAGA). Ce 2^e plasmide intermédiaire est nommé pSCpre2 (Figure 13A et C). La cassette de sélection BSR (« Blasticidine S Resistance ») a été purifiée par digestion XbaI et HindIII du plasmide pUCBsRBam_new. pSCpre2 a été digéré également par XbaI et HindIII et la cassette BSR a été intégrée dans ce plasmide par ligation, donnant ainsi le plasmide final pSC (Figure 13D). Le plasmide pSC contient donc 2 cassettes de

sélection, une pour la sélection des bactéries (résistance à l’ampicilline 100mg/mL) et l’autre pour la sélection des cellules D. discoideum (résistance à la blasticidine 10µg/mL).

Figure 12 : Obtention de mutants de D. discoideum impliqués dans les interactions avec les bactéries.

A. Schéma des différentes étapes permettant de générer et de sélectionner ces mutants. Les cellules de D.

discoideum sont électroporées en présence de l’enzyme de restriction Sau3A et du plasmide de mutagenèse pSC linéarisé par BamHI (mutagenèse REMI). Les mutants sont sélectionnés grâce à la résistance à la blasticidine apportée par le plasmide de mutagenèse. Après clonage individuel en plaque 96 puits, la capacité de chaque mutant à pousser sur bactéries est testée (C) et les mutants présentant un défaut de pousse sont sélectionnés après avoir confirmé ce phénotype par un test plus précis en plaque 24 puits (D).

B. Test de virulence permettant de tester la pousse de D. discoideum sur une couche de bactéries. 50µL de culture bactérienne sont déposés sur milieu agar et une goutte contenant les cellules de D. discoideum est ajoutée sur cette couche de bactéries. Les cellules de D. discoideum capables d’ingérer et de tuer les bactéries, poussent sur cette couche bactérienne et forment un trou appelé plage de phagocytose.

C. Sélection des mutants défectueux pour la pousse sur bactéries. Grâce à un peigne réplicateur, une goutte de chaque culture de mutant de D. discoideum contenus dans une plaque 96 puits, est transférée sur la couche bactérienne (en noir). Les mutants défectueux pour la pousse sur bactérie sont sélectionnés (flèche blanche).

D. Confirmation du phénotype de pousse des mutants. Les mutants sélectionnés en C sont retestés de façon plus précise, en plaque 24 puits, avec un nombre exact de cellules déposées (100 et 10 cellules par puits), et le phénotype de chaque mutant est comparé à celui du D. discoideum WT.

Figure 13 : Construction du plasmide de mutagenèse pSC.

A. Fragments de PCR utilisés pour créer le plasmide de mutagenèse pSC.

B. Première étape : insertion des sites de restriction NotI et BamHI à la place du MCS dans le plasmide pSP73.

C. Deuxième étape : insertion des sites de restriction NotI, HindIII et XbaI.

D. Troisième étape : insertion de la cassette de résistance à la blasticidine (BSR).

Le plasmide pSC contient 2 cassettes de sélection, l’une permet aux bactéries de résister à l’ampicilline (100mg/mL) et l’autre permet aux cellules de D. discoideum de résister à la blasticidine (10µg/mL).

Purification et digestion enzymatique de pSC. Les bactéries contenant le plasmide pSC sont décongelées sur LB agar avec ampicilline (100mg/mL) et incubées une nuit à 37°C. 8 colonies individuelles sont mises en précultures dans 3mL de LB-Amp et incubées avec agitation pendant 6h à 37°C. 2mL de chaque préculture sont ensuite ajoutés dans 200mL de LB-Amp et cultivés en erlen durant 16h à 37°C avec agitation (200rpm). Les bactéries sont centrifugées à 4000rpm pendant 15min à 4°C, puis le plasmide pSC est purifié grâce au kit de MaxiPrep Endotoxin-free Plasmid DNA de Macherey-Nagel (Nucleobond PC500 EF). Avant la transfection des cellules, le plasmide pSC est linéarisé par l’enzyme de restriction BamHI (G/GATCC). 100µg de plasmide pSC sont digérés par 500 unités d’enzyme BamHI pendant 2h à 37°C. L’ADN est ensuite précipité (1 volume de plasmide, 3 volumes d’éthanol 100%, 1/10 volume d’acétate de sodium 3M pH5,2 ; centrifugation 30min 10’000rpm 4°C). L’ADN est ensuite resuspendu dans l’eau à une concentration de 1µg/µL.

Culture de D. discoideum. Les cellules de D. discoideum utilisées couramment dans le laboratoire sont issues du sous-clone DH1-10 de la souche DH1 (Cornillon et al., 2000, Caterina et al., 1994). Les cellules sont cultivées à 21°C, en milieu HL5 (14,3g de peptone bactériologique, 7,15g d’extrait de levure, 18g de maltose monohydrate, 0,641g de Na₂HPO₄ --2H2O, 0,49g de KH2PO4, pour 1L d’eau distillée, pH ~6,5). Les cellules sont diluées deux fois par semaine quand leur concentration atteint 1.10⁶ cellules/mL.

Transfection de D. discoideum. Les cellules de D. discoideum (100mL de culture à 1.10⁶ cellules/mL) sont incubée à 4°C pendant 10min, centrifugées à 1400rpm 4°C pendant 5min, lavées avec 40mL de tampon d’électroporation (50mM de sucrose, 10mM de NaPO₄, pH 6,1) et enfin resuspendues dans ce même tampon à une concentration de 20.10⁶ cellules/mL.

400µL de cellules sont électroporées comme décrit précédemment (Alibaud et al., 2003), en présence de 20µg de plasmide pSC linéarisé par BamHI (G/GATCC), et de 2 unités de l’endonucléase Sau3A (/GATC).

Sélection et clonage des cellules transfectées. Après l’électroporation, les cellules sont remises en culture : chaque transfection est répartie dans 3 Pétris contenant 12mL de HL5.

24h après, l’agent de sélection blasticidine est ajouté dans le milieu (10µg/mL) et le milieu est changé 7 jours plus tard. Après 14 jours de sélection, les cellules sont clonées individuellement : elles sont distribuées grâce à un cymomètre de flux (FACS-Ventage) dans une plaque 96 puits à raison d’une cellule par puits et cultivées toujours sous sélection blasticidine. Cette étape permet d’obtenir des populations cellulaires clonales : toutes les cellules d’une même population comportent la même mutation.