c La pousse sur bactéries

J’ai testé la capacité des 3 clones vps13 à pousser sur K. aerogenes, B. subtilis et la souche permissive de P. aeruginosa, PT531, pour vérifier les phénotypes préalablement observés chez le mutant de mutagenèse aléatoire mEL5. En suivant le protocole du test de virulence (Froquet et al., 2009) (Chapitre II : A.1.b), j’ai déposé sur les bactéries, 10’000, 1’000, 100 et 10 cellules pour évaluer de façon plus précise les défauts de pousse (lors de la sélection après mutagenèse aléatoire, je n’utilisais que 100 et 10 cellules). En comparaison au D. discoideum sauvage (WT), le mutant vps13 est capable de pousser normalement sur K.

aerogenes et P. aeruginosa PT531, mais présente un défaut important de pousse sur B.

subtilis (Figure 24A). Ces phénotypes de pousse sur K. aerogenes et B. subtilis sont équivalents à ceux observés avec le mutant mEL5. Le léger défaut de pousse de mEL5 sur P.

aeruginosa PT531 n’est pas retrouvé chez le mutant vps13. Cela peut être dû à la variabilité du test de virulence, ou à la présence d’une autre mutation que l’insertion de pSC dans le mutant mEL5, qui serait à l’origine du défaut observé sur P. aeruginosa PT531.

J’ai testé la pousse du mutant vps13 sur les autres bactéries disponibles au laboratoire.

Le mutant vps13 présente des défauts de pousse sur seulement 4 bactéries des 16 testées (dont B. subtilis) : absence totale de pousse sur K. pneumoniae KP21 (sur milieu SM sans glucose), défaut important de pousse sur P. aeruginosa DP28 (concentration minimale de pousse : 10’000 cellules), défaut partiel de pousse sur M. luteus (concentration minimale de pousse : 1’000 cellules) (Figure 19, p.118 et Figure 24B). Une autre bactérie Gram positive a été

testée, Staphylococcus epidermidis (souche ATCC 12228), sur laquelle vps13 est incapable de pousser (Figure 24B).

Des expériences préliminaires de pousse sur des couches de bactéries mortes ont été réalisées avec B. subtilis et KP21. Le mutant vps13 présente le même défaut de pousse sur des B. subtilis bouillies que sur des B. subtilis vivantes. En revanche, il est capable de pousser normalement, comme le WT, sur des KP21 bouillies (Figure 24C). Cette expérience suggère que le défaut de pousse de vps13 sur KP21 est susceptible d’être causé par son incapacité à tuer cette bactérie, comme cela est le cas pour les mutants phg1a et kil2 (Lelong et al., 2011) (Chapitre II : B.3.b).

Les défauts de pousse sur bactéries peuvent être la conséquence de dysfonctionnements au niveau de nombreuses fonctions cellulaires comme la phagocytose, l’élimination des bactéries ou la production d’enzymes lysosomales. J’ai donc testé ces différentes fonctions chez le mutant vps13, ainsi que la voie d’endocytose et la morphologie générale des compartiments cellulaires puisque la protéine Vps13 de levure joue un rôle à ce niveau.

Figure 23 : Mutagenèse du gène vps13A.

A. Lors de la mutagenèse aléatoire par REMI, le mutant mEL5 a été créé par insertion du plasmide pSC dans la séquence codante du gène vps13A, 5151 pb après le codon start. Le vecteur d’identification de la mutation a été obtenu après digestion par l’enzyme de restriction ClaI. Il a été utilisé comme vecteur de KO pour générer le mutant vps13A.

B. Description des oligos utilisés pour identifier les cellules mutées dans le gène vps13A (références OL2 : 190505, et OL10A à OL13 : 201006).

C. Identification des mutants vps13A par PCR (30sec à 94°C, 30sec à 58°C, 3min à 65°C, 30 cycles). La table indique les couples d’oligos utilisés et la taille des fragments attendus. A droite, les gels d’agarose 1% montrent les résultats des PCR avec les différents couples d’oligos, obtenus avec l’ADN des cellules WT ou des cellules mutantes mEL5 obtenues par mutagenèse aléatoire. En bas, les gels d’agarose 1% confirment le génotype muté vps13A chez les 3 clones obtenus après mutagenèse dirigée (couple d’oligos 2 : gain de signal, couple d’oligos 5 : perte de signal).

Figure 24 : Pousse du mutant vps13 sur différentes bactéries.

A. La pousse des 3 clones de vps13 a été testée sur K. aerogenes, B. subtilis et P. aeruginosa PT531, les 3 bactéries utilisées pour sélectionner des mutants après la mutagenèse aléatoire REMI. 10'000, 1'000, 100 et 10 cellules de D. discoideum ont été déposées sur une couche de bactéries (en noir). Lorsque les cellules sont capables d’ingérer et de tuer les bactéries, elles créent une plage de phagocytose (en blanc). Les 3 clones ne montrent aucune différence de phénotype. Ils sont capables de pousser sur K. aerogenes et sur P. aeruginosa PT531, et ont un défaut partiel de pousse sur B. subtilis.

B. La pousse du mutant vps13 est défectueuse sur la souche DP28 de P. aeruginosa, sur la souche KP21 de K.

pneumoniae sur milieu sans glucose, sur M. luteus et sur S. epidermidis (ATCC12228). Le clone vps13 de référence utilisé pour toutes les expériences est le clone 1.

C. Une couche de B. subtilis bouillies ne permet pas d’améliorer la pousse du mutant vps13, alors qu’une couche de KP21 bouillies restaure une pousse normale de vps13.

B.4.d La phagocytose

J’ai mesuré la phagocytose de billes de polystyrène de 1 micron de diamètre par les cellules vps13, en milieu HL5 (milieu classique de culture) et en SB (milieu utilisé pour les tests de destruction intracellulaire des bactéries). Le protocole utilisé a été décrit précédemment (Benghezal et al., 2006). Brièvement, les cellules sont incubées en présence des billes fluorescente marquées au FITC, pendant 20 min, à 21°C, en suspension et avec agitation. Ensuite les cellules sont lavées dans leur milieu à 4°C et resuspendues dans du HL5 contenant de l’azide 0,1% 4°C. La quantité de billes phagocytées est déterminée par la

mesure de la fluorescence des cellules par cytométrie de flux avec un FACS-Calibur (« Fluorescent Activated Cell Sorter »). Le mutant vps13 a une efficacité de phagocytose similaire à celle de la souche WT (Figure 25A). Le défaut de pousse sur bactéries ne semble pas être causé par un défaut de phagocytose.

Les deux types de compartiments caractéristiques de la voie de phagocytose sont les phagosomes précoces et les phagosomes tardifs. La souche WT de D. discoideum que nous utilisons a la particularité de posséder de grands compartiments, visibles en microscopie optique et une double immunofluorescence contre la protéine p80 et la protéine H⁺-ATPase nous permet de différencier ces deux types de compartiments. Les phagosomes précoces sont marqués par les deux protéines alors que les phagosomes tardifs sont marqués uniquement par p80 (Figure 11) (Charette and Cosson, 2008). Cette méthode est utilisée pour analyser la vitesse de maturation des phagosomes : après incubation de cellules de D. discoideum avec des billes fluorescentes pendant 30, 60 ou 90 min, une double immunofluorescence est réalisée avec les anticorps spécifiques des protéines p80 et H⁺-ATPase. Le nombre de billes fluorescentes présentes dans les phagosomes tardifs est déterminé par analyse d’images obtenues par microscopie confocale (LSM-510). L’analyse du mutant vps13 montre un léger retard de maturation des phagosomes (20-25% de billes en moins dans les phagosomes tardifs à 60 et 90 min) (Figure 25B).

Figure 25 : La phagocytose chez le mutant vps13.

A. Les cellules WT et vps13 sont incubées avec des billes de polystyrène fluorescentes pendant 20 min, à 21°C, en milieu HL5 ou SB. Après lavage, la quantité de fluorescence internalisée est déterminée par cytométrie de flux.

B. Les cellules sont incubées avec des billes de polystyrène fluorescentes pendant 30, 60 ou 90 min avant d’être fixées sur lame. Les phagosomes tardifs sont marqués par une double immunofluorescence avec des anticorps anti-p80 et anti-H⁺-ATPase, et le pourcentage de billes présentes dans ces compartiments est déterminé par l’analyse des images obtenue au microscope confocal.

Les moyennes et les SEM de 3 expériences indépendantes sont représentées sur chaque graphique.