L’utilisation de l’amibe D. discoideum comme modèle pour l’étude des interactions hôte-pathogène m’a permis d’explorer les deux aspects de ces interactions en étudiant d’une part la virulence de P. aeruginosa et d’autre part le rôle de différents gènes de D. discoideum dans la confrontation de ces cellules phagocytaires avec des bactéries.
J’ai mis en évidence qu’il existe une évolution de la virulence de P. aeruginosa au cours de l’infection chronique mais pas de l’infection aiguë (Chapitre II : A.2) (Lelong et al., 2010). Il y a diminution de la virulence au cours du temps, chez la moitié des patients atteints de mucoviscidose. Cette évolution a été observée chez l’amibe, mais que vaut le modèle D.
discoideum dans l’étude de la virulence de P. aeruginosa ? Comme je l’ai présenté dans mon introduction (Chapitre I : A.4), l’utilisation de modèles est indispensable pour tester la virulence de nombreuses souches bactériennes. Un avantage indéniable à utiliser D.
discoideum est la quantité importante de tests réalisables, sur un temps court, avec une grande reproductibilité et un coût faible. Dans le cas spécifique de mon étude, la quantité de tests effectués est d’environ 900 tests pour 200 isolats bactériens. L’équivalent en souris nécessiterait l’utilisation d’approximativement 2000 souris, ce qui est impensable tant au niveau éthique, qu’au niveau des moyens à mettre en œuvre et du temps que cela prendrait.
De plus, les résultats seraient plus difficilement quantifiables et présenteraient une variabilité bien plus importante que ceux obtenus avec D. discoideum.
Par ailleurs, différentes études ont montré que la virulence bactérienne est similaire chez l’amibe D. discoideum et chez la souris, modèle mammifère que l’on considère comme très proche de l’homme. P. aeruginosa est une bactérie environnementale qui s’est adaptée au cours de l’évolution aux différents hôtes auxquels elle se trouve confrontée. Les mécanismes de virulence de P. aeruginosa sont donc avant tout adéquats pour permettre à la bactérie de se défendre contre des prédateurs environnementaux comme l’amibe D. discoideum. L’homme est probablement un hôte accidentel pour P. aeruginosa, auquel elle n’est pas spécifiquement adaptée. Ceci explique pourquoi les facteurs de virulence utilisés par P. aeruginosa sont les mêmes chez l’amibe, la souris et l’homme, ce qui permet d’ailleurs de valider l’utilisation de D. discoideum comme modèle pour l’étude des infections à P. aeruginosa. Ceci peut également expliquer pourquoi une évolution de la virulence de P. aeruginosa se produit chez des patients infectés : les bactéries passant de l'environnement au milieu intérieur du corps
humain se retrouvent confrontées à des pressions de sélection très différentes, auxquelles elles s'adaptent au cours de l'infection.
Cependant, la capacité de D. discoideum à pousser sur différentes souches de P.
aeruginosa reflète uniquement la virulence de la bactérie. Lors d’une infection bactérienne chez l’homme, la virulence de la bactérie n’est pas le seul facteur responsable de la pathogénicité. L’état de santé général du patient, indépendamment de l’infection, est lui aussi un facteur primordial. Une bactérie peut avoir un pouvoir pathogène plus important chez un patient dont l’état de santé général est défectueux, ce qui favorise le développement de l’infection. Ce facteur là n’est pas pris en compte dans les tests d’infection chez D.
discoideum, mais aucun autre modèle ne saurait refléter simplement ce paramètre.
Il serait intéressant de savoir si d’une façon générale, la virulence de P. aeruginosa évaluée avec le modèle D. discoideum corrèle avec la gravité des symptômes chez le patient.
Lorsqu’il est observé une diminution de la virulence bactérienne chez D. discoideum (dans le cas des patients atteints de mucoviscidose), y a-t-il une amélioration de l’état de santé du patient, une diminution de la gravité des symptômes, ou une augmentation de la durée des périodes de latence entre deux épisodes d’exacerbation de l’infection ? Malheureusement les informations disponibles sur les souches bactériennes utilisées dans notre étude ne nous permettent pas de répondre à ces questions. Nous ne savons pas non plus quels traitements ont été administrés aux patients (et ils doivent probablement être différents d’un patient à l’autre).
Peut-être existe-t-il un lien entre les traitements antibiotiques utilisés et la virulence de P.
aeruginosa ? Pour tenter d’élucider toutes ces interrogations, il faudrait réaliser des études cliniques prospectives sur des patients atteints de mucoviscidose, au cours desquelles les différents paramètres concernant les patients seraient pris en compte (par exemple : âge, gravité des symptômes, durée de l’épisode infectieux, antibiothérapie ou autres traitements prescrits, durée de latence entre les épisodes infectieux…).
Pour conclure, l’utilisation de l’amibe D. discoideum permet d’évaluer la virulence des souches de P. aeruginosa isolées chez des patients et de mieux comprendre l’évolution des infections à P. aeruginosa chez l’homme. Cela pourrait, à plus long terme, avoir une application directe en médecine, en apportant une aide dans le choix du traitement le mieux adapté pour chaque patient, pour lutter contre les infections à P. aeruginosa.
Dans le but de découvrir de nouveaux gènes de D. discoideum impliqués dans les interactions entre amibes et bactéries, j’ai réalisé une mutagenèse aléatoire de D. discoideum et j’ai sélectionné les mutants présentant des défauts de pousse sur au moins une des trois
bactéries suivantes : B. subtilis, K. aerogenes et P. aeruginosa (Chapitre II : B.1). Chaque cycle de mutagenèse (de la transfection des cellules de D. discoideum à la sélection des mutants de pousse) nécessite au minimum 36 jours. Durant 8 mois, j’ai débuté chaque semaine un nouveau cycle de mutagenèse et j’ai suivi en parallèle jusqu’à 6 cycles. J’ai ainsi obtenus 3618 clones individuels et seulement 36 d’entre eux (1%) ont présenté un défaut de pousse sur bactérie et ont été sélectionnés. La moitié des mutants ont été « éliminés » pour différentes raisons : le site d’insertion du plasmide de mutagenèse n’a pu être formellement identifié, ou le mutant était en fait le clone d’un autre mutant obtenu lors de la même transfection (Table 3). Cela porte à 18 le nombre de mutants susceptibles d’être intéressants à étudier. Lors de cette mutagenèse j’ai mis en évidence un biais d’insertion du plasmide pour des sites préférentiels (hotspots), sites qui sont également le lieu fréquent de remaniements chromosomiques (Chapitre II : B.1.e). Les insertions au niveau des hotspots ont concerné une part importante des mutants sélectionnés (11/36). Ce biais est la conséquence directe de l’utilisation de l’enzyme de restriction Sau3A lors de la transfection des cellules puisque tous les sites préférentiels sont des séquences GATC spécifiques de cette enzyme. Il serait intéressant lors d’une prochaine mutagenèse d’utiliser une autre enzyme de restriction pour éviter de retrouver les mêmes mutants, et aussi pour savoir si le taux de mutants concernés par ce biais varie en fonction de l’enzyme utilisée. Finalement, l’insertion du plasmide de mutagenèse au niveau de la séquence codante d’un gène a été identifiée dans 4 mutants ce qui représente seulement 0,1% des clones obtenus par la mutagenèse. Cette mutagenèse REMI est donc une technique très « lourde », compte tenu du temps et de l’organisation nécessaires, ainsi que du résultat obtenu (taux très faible de mutation au niveau d’un gène).
Cependant elle reste un bon moyen pour découvrir de nouveaux gènes impliqués dans une fonction particulière (ici les interactions amibe-bactéries).
L’idéal pour identifier « tous » les gènes impliqués dans les interactions amibe-bactéries serait de générer une banque de mutants de D. discoideum qui soit facilement testable. Il faudrait tout d’abord trouver le moyen de congeler et décongeler facilement D.
discoideum, dans des plaques 96 puits par exemple. Puis il faudrait générer des KO de chaque gène de D. discoideum. Ainsi il serait possible de créer une banque de mutants disponible pour tous, qui pourrait être facilement et rapidement testée pour la pousse sur un grand nombre de bactéries. Cette banque de mutant serait également utile à tous les chercheurs, quelque soit leur thématique de recherche sur D. discoideum.
La mutagenèse aléatoire sur D. discoideum nous a permis d’identifier un nouveau gène impliqué dans les interactions amibe-bactéries : kil2 (Chapitre II : B.3). D’après sa séquence protéique, Kil2 appartient à la famille des P-ATPases de type V, qui sont des pompes à cations, utilisant l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP pour transférer des cations au travers des membranes et contre le gradient de concentration (Axelsen and Palmgren, 1998, Schultheis et al., 2004). La spécificité ionique de la protéine Kil2 ne peut être déterminée d’après la séquence protéique. Nous avons montré que Kil2 est localisée au niveau de la membrane phagosomale. La caractérisation du mutant kil2 a révélé que la protéine Kil2 est nécessaire pour assurer l’activité protéolytique intraphagosomale et tuer efficacement Klebsiella. La complémentation du milieu en magnésium permet au mutant kil2 de tuer efficacement Klebsiella et de retrouver une activité protéolytique normale dans ses phagosomes. Ces résultats suggèrent que la protéine Kil2 transporte du magnésium dans le phagosome, et que ce magnésium assure une activité protéolytique optimale permettant de tuer efficacement Klebsiella. Pour confirmer cette hypothèse, la spécificité ionique de Kil2 pour le magnésium pourrait être vérifiée in vitro. Après purification de la protéine Kil2 et association avec des liposomes pour mimer les membranes, l’hydrolyse d’ATP radioactif par la protéine Kil2 peut être mesurée en présence de différents cations, comme cela a été fait pour la caractérisation biochimique de la protéine Cod1p, une autre P-ATPase de type V (Cronin et al., 2002, Mandal et al., 2000, Ghosh et al., 1990). Si Kil2 est un transporteur de magnésium, la présence de ce cation devrait induire une augmentation significative de l’hydrolyse de l’ATP par Kil2. Si l’hypothèse du transporteur de magnésium nous semble être la plus probable, il est aussi possible que le mécanisme d’élimination des bactéries dépendant du magnésium soit différent de celui dépendant de la protéine Kil2. La mutation du gène kil2 pourrait avoir mis en évidence ce second mécanisme, redondant avec celui contrôlé par Kil2, et qui ne serait mis en œuvre qu’en l’absence de Kil2 (voir Discussion du papier (Lelong et al., 2011), Chapitre II : B.3.b).
Quel que soit le rôle exact de la protéine Kil2, les résultats que nous avons obtenus montrent que le magnésium stimule l’activité protéolytique intraphagosomale de D.
discoideum. Ce résultat soutient l’importance des ions dans l’élimination des bactéries par les cellules phagocytaires, et en particulier des cations dans l’activation des protéases phagosomales comme cela a été proposé par Reeves et al. (Chapitre I : B.3.d, (Reeves et al., 2002)). Cependant des questions restent sans réponses. Cet effet du magnésium sur les protéases est-il direct ou existe-t-il d’autres intervenants (autres protéines, autres ions) dans la
protéolyse induite par le magnésium ? Quelles sont les protéases spécifiquement activées par le magnésium ? Le magnésium a-t’il un effet dans l’élimination d’autres bactéries que K.
pneumoniae ?
Au début du 20e siècle, le chirurgien Pierre Delbet a étudié la nocivité des antiseptiques pour les cellules du corps humain et il a cherché des traitements alternatifs qui, au lieu de détruire à la fois les bactéries et les cellules humaines, permettrait de stimuler les cellules phagocytaires afin d’éliminer les bactéries plus efficacement, sans léser d’avantage les tissus environnants. En testant différentes solutions sur les soldats blessés de la première guerre mondiale, le Pr Pierre Delbet a mis en évidence l’importance du chlorure de magnésium dans le traitement des plaies infectées (Communication à l’Académie des Sciences, le 6 septembre 1915 : Cytophylaxie, Delbet et Karajanopoulo, http://gallica.bnf.fr/ark:/12148/bpt6k3114b.image.r=delbet.f268). Par la suite, ses travaux ont montré le rôle bénéfique du magnésium dans le traitement et la résistance à de nombreuses infections chez l’homme. Nos résultats impliquent le magnésium dans le(s) mécanisme(s) de destructions des bactéries par les cellules phagocytaires, et il est tentant d'établir un parallèle entre nos résultats et les observations du Pr Delbet. Cependant l’hypothèse de l’implication du magnésium dans l’élimination des bactéries par les cellules phagocytaires humaines reste tout a fait spéculative. Pour aller plus loin sur ce sujet, il serait intéressant d’étudier chez les mammifères, par exemple par des expériences d’ARNi sur des macrophages ou des neutrophiles, le rôle de la protéine ATP13A2 (P-ATPase de type V homologue de Kil2), ainsi que l’implication du magnésium dans la destruction des bactéries par ces cellules.
Pour découvrir plus de gènes impliqués dans les interactions hôte-pathogène, nous avons utilisé les mutants disponibles dans notre laboratoire (obtenus par mutagenèse aléatoire REMI ou par mutagenèse dirigée). Nous avons testé la capacité de 22 mutants différents de D.
discoideum à pousser sur une dizaine de souches bactériennes différentes et sur des mutants de ces souches. Ce faisant, nous avons réalisé une matrice de virulence présentant le phénotype de chaque mutant de D. discoideum sur chaque bactérie (Chapitre II : B.2) (Figure 19). Les résultats obtenus dans cette matrice de virulence montrent une grande variété de phénotypes. Chaque mutant présente des défauts de pousse sur un petit nombre de bactéries, et les bactéries concernées diffèrent d’un mutant à l’autre. Aucun mutant ne présente un défaut de pousse général sur toutes les bactéries ou du moins sur la majorité d’entre elles, à l’exception du mutant mu1 (mais dans ce cas, le défaut n’est pas spécifique à la pousse sur
bactéries puisque la croissance du mutant mu1est également affectée en milieu classique de culture). Cela signifie que les mécanismes mis en œuvre par le phagocyte professionnel D.
discoideum, lors d’une infection bactérienne, sont pour une grande part spécifiques des
bactéries rencontrées.
Certains mutants de D. discoideum présentent une spécificité bactérienne relativement proche. Ce résultat suggère la possibilité que les gènes correspondants puissent être impliqués dans les mêmes mécanismes. Sur la matrice de virulence (Figure 19), nous avons regroupé les mutants en suivant ce critère de ressemblance phénotypique. Deux groupes de mutants se distinguent facilement : le groupe « Klebsiella-E. coli » et le groupe « M. luteus ». Dans le premier groupe, 3 mutants sont aujourd’hui bien caractérisés : phg1a, kil1 et kil2. Les protéines correspondantes sont toutes les 3 impliquées dans l’élimination de Klebsiella.
Phg1a, protéine à 9 domaines transmembranaires, et Kil1, l’unique sulfotransférase de D.
discoideum, sont impliquées dans le même mécanisme. Phg1a contrôle l’expression de Kil1 et la surexpression de la protéine Kil1 dans le mutant phg1a permet de restaurer une élimination efficace de Klebsiella (Chapitre I : B.4.d). Kil2, P-ATPase de type V, intervient dans un mécanisme différent. La protéine Kil2 contrôle la concentration ionique du phagosome et assure une protéolyse efficace dans le phagosome. Bien que les mécanismes d’action sur les bactéries ne soient pas totalement élucidés, la caractérisation de ces 3 mutants a permis d’avancer sur la question de l’élimination des bactéries et en particulier de Klebsiella par les cellules phagocytaires.
La matrice de virulence ouvre des portes vers plusieurs projets de recherche, dont la caractérisation des mutants du groupe « M. luteus » (lvsA, lvsB, mu3, vps13 et mAM4). Les mutants lvsA, lvsB et mu3 ont été bien caractérisés et il a été montré que les trois gènes correspondants sont impliqués dans la voie d’endocytose (Cornillon et al., 2002, Charette and Cosson, 2008). En revanche, les mutants vps13 et mAM4 n’ont jamais été caractérisés auparavant. Mes résultats préliminaires sur vps13 indiquent que ce gène joue un rôle dans la voie d’endocytose, point commun avec les gènes lvsA, lvsB et mu3. Jusqu’à présent, aucune étude n’a montré de lien entre ces gènes et les interactions avec les bactéries. La matrice de virulence a permis de mettre en évidence l’implication de ces cinq gènes (lvsA, lvsB, mu3, vps13 et mAM4) dans les interactions entre D. discoideum et M. luteus (Figure 19). Cette observation amène plusieurs questions. Quel est le rôle de chacun de ces gènes dans les interactions avec M. luteus ? Comment s’expliquent les défauts de pousse sur bactéries observés ? Existe-t-il des liens mécanistiques entre ces gènes comme cela a été montré entre
phg1a et kil1 ? Il serait donc intéressant de caractériser ces différents mutants et des réponses pourraient être apportées plus rapidement par une étude en parallèle des ces mutants, plutôt que la caractérisation individuelle de chacun d’entre eux. La découverte de gènes supplémentaires impliqués dans les relations D. discoideum-M. luteus serait aussi un moyen d’obtenir d’avantage d’informations à ce sujet. Pour cela, une mutagenèse aléatoire de D.
discoideum avec sélection des mutants pour leur défaut de pousse sur M. luteus pourrait être réalisée. De plus, l’identification d’ADNc, dont la surexpression dans les mutants du groupe
« M. luteus » supprimerait les défauts de pousse de ces mutants, permettrait également de cibler de nouveaux gènes impliqués dans les mêmes mécanismes que chacun des gènes lvsA, lvsB, mu3, vps13 ou mAM4.
Pour conclure, nous avons découvert et caractérisé dans notre laboratoire 3 gènes (phg1a, kil1 et kil2) essentiels dans l’élimination des bactéries par D. discoideum. Ces 3 gènes sont impliqués dans des mécanismes qui jusque là n’avaient pas été mis en évidence, ce qui nous montre que nous connaissons encore très peu de choses sur les mécanismes de destruction des bactéries par les cellules phagocytaires. Les fonctions eucaryotes étant extrêmement bien conservées entre les espèces, il est fort probable que les mécanismes découverts chez l’amibe D. discoideum existent également chez les mammifères.
L’utilisation de D. discoideum permet donc, d’une part d’identifier les facteurs spécifiques mis en jeu par les cellules phagocytaires lors d’une infection bactérienne, et d’autre part d’évaluer la virulence bactérienne. L’étude de D. discoideum apporte des éléments de réponse importants au sujet des interactions hôte-pathogène.
ANNEXES
ANNEXES
Les deux articles ci-dessous présentent les résultats de deux études réalisées dans notre laboratoire et auxquelles j’ai participé. Ces deux études ne concernent pas directement mon projet de thèse, c’est pourquoi je les présente en annexe.
Le premier article (Marchetti et al., 2009) décrit l’utilisation de la cytométrie de flux pour mesurer le pH des endosomes de D. discoideum. Deux sondes fluorescentes sont endocytées par D. discoideum. L’une des deux sondes est insensible au pH et permet de mesurer l’endocytose, l’autre sonde est sensible au pH. Le ratio de fluorescence des deux sondes est reporté sur une courbe étalon (ratio de fluorescence en fonction du pH) qui permet de déterminer le pH endosomal correspondant. Nous avons montré que l’utilisation d’une nouvelle sonde sensible au pH, l’Oregon-green, permet de mesurer des pH plus acides que les sondes précédemment utilisées. L’utilisation de cette sonde nous a permis de montrer que les endosomes de D. discoideum sont extrêmement acides (pH < 3,5).
Le deuxième article (Mercanti et al., 2010) est une étude sur la voie d’endocytose et le triages des protéines transmembranaires dans les cellules de mammifère. Les résultats obtenus montrent que le triage des protéines transmembranaires de la surface vers la voie d’endocytose, en l’absence de signal spécifique d’endocytose, est contrôlé par la taille de leur domaine transmembranaire. Une protéine à domaine transmembranaire court (17 ou 18 acides aminés) est internalisée via des vésicules clathrines, alors qu’une protéine à domaine transmembranaire long (21 acides aminés) est exclue des vésicules clathrines et reste à la surface de la cellule. Cette étude montre également que la taille du domaine transmembranaire module l’efficacité d’internalisation des protéines comportant un signal spécifique d’endocytose.
A.1. Article Marchetti et al. : mesure du pH endosomal de D. discoideum par cytométrie de flux
A measure of endosomal pH by flow cytométrie in Dictyostelium
Anna Marchetti, Emmanuelle Lelong, and Pierre Cosson
BMC Research Notes, 2009.
BioMed Central