Étude de la flore bactérienne et de sa résistance aux antibiotiques des produits de la pêche et de l'aquaculture

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Submitted on 15 Feb 2019

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antibiotiques des produits de la pêche et de l’aquaculture

Arnaud Briet

To cite this version:

Arnaud Briet. Étude de la flore bactérienne et de sa résistance aux antibiotiques des produits de la pêche et de l’aquaculture. Sciences et techniques des pêches. Université du Littoral Côte d’Opale, 2018. Français. �NNT : 2018DUNK0494�. �tel-02021052�

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Université Littoral Côte d’Opale

Ecole Doctorale des Sciences de la Matière, du rayonnement et de l’Environnement

Thèse de doctorat

Présentée par : Arnaud Briet

Etude de la flore bactérienne et de sa résistance aux antibiotiques des

produits de la pêche et de l’aquaculture

Sous la direction de : Dr. Graziella MIDELET

Soutenue le : 11/12/2018

Devant le jury composé de :

Pr. PILET Marie-France Professeur, Oniris, Nantes Rapporteur

Pr. LINA Gérard Professeur des universités, Université Lyon 1, Lyon Rapporteur

Dr. MADEC Jean-Yves Directeur de recherche, ANSES, Lyon Examinateur

Pr. HOCQUET Didier Professeur des universités, Université de Franche-Comté, Besançon Examinateur

Dr. GRANIER Sophie Chargée de recherche, ANSES, Maisons-Alfort Co-encadrante

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Remerciement

Cette thèse a été possible grâce au soutien financier de l’ANSES et de la région Haut-de-France. Je tiens à remercier Laurent Laloux, directeur du Laboratoire de sécurité des aliments de l’ANSES et Anne Brisabois, directrice adjointe et responsable du département des produits de la pêche et de l’aquaculture de m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire.

Je tiens également à remercier le Pr Marie-France Pilet et le Pr Gérard Lina, d’avoir accepté d’être rapporteur de ces travaux de thèse. Merci également au Dr Jean-Yves Madec et au Pr Didier Hocquet d’être examinateur de mes travaux de thèse.

La thèse quelle aventure ! Je tiens à remercier chaleureusement Graziella Midelet, qui a dirigé cette thèse et qui m’a beaucoup apporté, autant scientifiquement que professionnellement et humainement. Ensuite, merci à Sophie Granier de m’avoir encadré sur la partie antibiorésistance, tes connaissances et ta pédagogie m’ont beaucoup apporté. Vous m’avez, toutes les deux, par votre rigueur et votre complémentarité aidé à faire ce que cette thèse a été : beaucoup de travail, mais toujours dans la bonne humeur.

Je tiens à remercier mes compagnons de thèse, d’abord ceux qui sont passés dans le bureau des doctorants ( THE bureau), Estelle et notre passion commune des bébés goélands, Julia et nos conversation « philosophique » du vendredi matin et surtout Ludo, nous nous sommes supportés pendant ces trois ans, un véritable exploit !

Mes autres compagnons de thèse, Nicolas, Sylvain et Sarah, merci de m’avoir supporté comme maître de stage, toujours un peu désorganisé et dans l’improvisation. Votre travail et votre bonne ont également amené cette thèse où elle est.

Aux membre de l’équipe B3PA, Thomas et tes embuscades à l’Alcazar qui remontent le moral ☺, Mélanie et nos discussions toujours intéressantes (surtout quand tu débarques dans le bureau pour

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te joindre aux débats des doctorants !), Cindy et nos rendez-vous du lundi matin, Sabine et Guylaine et votre bonne humeur (sisi je vous ai vu sourire), Stéphanie, Virginie, Odile et nos conversations autours d’un café ou d’un gâteau je vous remercie tous profondément. Merci également aux membres de l’équipe qui nous ont quittés, Clémence, Régine et Nina vous avez fait vivre ce laboratoire.

Karine, Corinne et Sophie (Z et K), merci pour les discussions que nous avons pu avoir, ça fait toujours du bien de se vider la tête avec vous. Alexandre, une petite kasdédi parce que tu le vaux bien ! Enfin merci à Sylvie, Guillaume, Charlotte, Marie et Gaëlle pour les discussions que nous avons pu avoir au détour d’un couloir.

Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont travaillé de près ou de loin sur ces travaux, vos petites attentions, aides sont toujours agréables.

Mes amis, Mélody, Maleaume, Romain, Anne, Marion, Flavien, Benoit, Alisson, Gaël et Tiphaine vos passages à Boulogne et nos soirées aux quatre coins de la France ont toujours été un plaisirs et ça fait toujours du bien de vous voir et vos petites têtes d’EBIste ( et celles des pièces rapportées :p )

Enfin ma petite famille, mes soutiens de toujours, Maman, Papa, Emilie, Coline merci de m’avoir toujours porté et soutenu, moi le petit dernier de la famille. Merci également à Adrien (mon futur beauf) et William (mon beauf), vous rendez toujours les réunions familliales plus épicées et pétillantes ! Enfin mes petites bouilles de Loris et Malia, mon neveu et ma nièce, vous êtes de vrais rayon de soleil ( et de vrais tempêtes du désert aussi).

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Sommaire

Liste des abréviations ... 7

Liste des tableaux ... 9

Liste des figures ... 13

Introduction ... 17

Étude bibliographique ... 23

I. Consommation, production et commerce international des produits de la pêche et point sur la réglementation ... 24

II. Risques liés à la flore bactérienne présente dans les produits de la pêche ... 27

II.1. Flore bactérienne pathogène alimentaire pour l’homme : Toxi-infections alimentaires et résistance aux antibiotiques... 27

II.2. Flore bactérienne cultivable des produits de la pêche et de l’aquaculture ... 31

II.3. Résistance aux antibiotiques de la flore des produits aquatiques ... 34

II.4. Techniques d’isolement et d’identification de la flore bactérienne des produits aquatiques ... 36

III. La résistance aux antibiotiques : Dissémination et détection ... 39

III.1. Les éléments génétiques mobiles et les intégrons ... 41

III.1.A. Les Plasmides ... 41

III.1.B. Les ilôts génomiques : integrative and conjugative element (ICE) et integrative and mobilisable element (IME) ... 42

III.1.C. Transposon ... 43

III.1.D. Les intégrons ... 44

III.1.E. Imbrication des éléments génétiques mobiles... 45

III.2. La transduction et la transformation ... 46

III.3. Diffusion des bactéries résistantes aux antibiotiques et sureveillance ... 47

III.4. Techniques de détection phénotypique et génotypique de la résistance aux antibiotiques ... 50

III.4.A. Techniques de détection phénotypique ... 50

III.4.B. Interprétation des résultats phénotypiques selon les référentiels du CLSI et EUCAST ... 51

III.4.C. Techniques de confirmation et d’identification des mécanismes de résistance et de leurs supports génétiques ... 55

Chapitre 1 : Isolement et identification de la flore bactérienne mésophile cultivable des produits de la pêche et de l’aquaculture ... 59

I. Contexte ... 60

II. Matériel et méthodes ... 63

II.1. Préparation des broyats ... 63

II.2. Isolement des bactéries ... 64

II.3. Identification bactérienne par la technique MALDI-TOF et par l’amplification et le séquençage de gènes de ménage (ADNr 16S, gyrB, rpoB et tuf) ... 66

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II.3.A. Technique MALDI-TOF ... 66

II.3.B. Techniques d’amplification et de séquençage de gènes de ménage de l’ADNr 16S, gyrB, rpoB et tuf ... 67

III. Comparaison des performances de différentes techniques d’identification bactérienne 70 III.1. Techniques MALDI-TOF vs amplification et séquençage de l’ADNr 16S ... 70

III.2. Complément d’identification par les autres gènes de ménage gyrB, rpoB et tuf .... 74

III.3. Discussion ... 74

IV. Identification des souches isolées des produits de la pêche et performance de la sélectivité des géloses ... 78

IV.1. Identification des isolats ... 78

IV.2. Performance de la sélectivité des géloses ... 79

IV.3. Discussion ... 89

V. Diversité de la flore bactérienne des produits de la pêche et de l’aquaculture ... 91

V.1. Diversité et proportion des bactéries Gram positif isolées des produits de la pêche et de l’aquaculture ... 91

V.1.A. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Bacilliales ... 93

V.1.B. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Lactobacilliales ... 96

V.1.C. Diversité bactérienne des souches appartenant à l’ordre des Micrococcales... 98

V.2. Diversité et proportion des bactéries Gram négatif isolées des produits de la pêche et de l’aquaculture ... 98

V.2.A. Diversité bactérienne des γ-proteobacteria ... 100

V.2.B. Diversité bactérienne des souches appartenant aux α-proteobacteria : Caulobacteriales, Flavobacteriales, Rhizobiales et Sphingobacteriales ... 104

V.3. Discussion ... 104

Chapitre 2 : Étude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des produits marins ... 113

I. Contexte ... 114

II. Antibiorésistance de la flore des produits de la pêche et de l’aquaculture ... 116

II.1. Matériel et méthodes ... 116

II.1.A. Sélection des souches ... 116

II.1.B. Antibiogramme par diffusion ... 117

III. Etude de la résistance aux antibiotiques des bactéries isolées dans les produits de la pêche et de l’aquaculture ... 122

III.1. Contexte ... 122

III.2. Enterococcus ... 123

III.2.A. Contexte ... 123

III.2.B. Panel de souches étudiées ... 123

III.2.C. Détermination de la population non-sauvage ... 123

III.2.D. Multi-résistance ... 127

III.2.E. Discussion ... 128

III.3. Staphylococcus ... 132

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III.3.C. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus coagulase positif

... 133

III.3.D. Détermination de la population non-sauvage des Staphylococcus coagulase négatif ... 134

III.3.E. Multi-résistance ... 136

III.3.F. Discussion ... 137

III.4. Exiguobacterium ... 140

III.5. Pseudomonas ... 145

III.6. Vibrio ... 151

III.6.C. Etude de la résistance aux antibiotiques... 151

III.6.D. Discussion ... 153

III.7. Proteus ... 156

III.7.C. Etude de la résistance aux antibiotiques... 156

III.7.D. Discussion ... 159

IV. Antibiorésistance et produits de la pêche et de l’aquaculture ... 160

IV.1. Contexte ... 160

IV.2. Résultats ... 160

IV.3. Discussion ... 164

V. Bactérie (s) candidate(s) potentielle(s) indicatrice(s) de la résistance aux antibiotiques dans les produits de la pêche et de l’aquaculture ... 167

V.1. Contexte ... 167

V.2. Résultats ... 170

V.3. Discussion ... 171

Chapitre 3 : Étude de la résistance aux antibiotiques de Vibrio parahaemolyticus isolés de produits de la pêche et de l’aquaculture... 179

I. Contexte de l’étude ... 180

II. Définition des seuils épidémiologiques avec la recherche des intégrons/SXT ... 182

II.1. Contexte ... 182

II.2. Matériel et méthodes ... 183

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II.2.A. Sélection des souches ... 183

II.2.B. Antibiogramme par diffusion ... 183

II.2.C. Interprétation des résultats ... 184

II.2.D. Recherche des intégrases des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase des ICE SXT/R391 par PCR... 184

II.3. Résultats ... 187

II.3.A. Origine des souches ... 187

II.3.B. Définition des seuils épidémiologiques expérimentaux (COWT) ... 188

II.3.C. Recherche d’intégrons ... 194

II.4. Discussion ... 195

III. Caractérisation des résistances de la souche V. parahaemolyticus 16-B3PA-006 ... 201

III.1. Contexte ... 201

III.2. Matériel et méthodes ... 202

III.2.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines ... 202

III.2.B. Séquençage et analyse du génome total ... 203

III.2.C. Conjugaison bactérienne ... 203

III.3. Résultats ... 205

III.3.A. Caractérisation du mécanisme de résistance aux β-lactamines ... 205

III.3.B. Séquençage du génome total et analyse bio-informatique ... 206

III.3.C. Conjugaison bactérienne ... 206

III.4. Discussion ... 208

Conclusion et perspectives ... 215

Valorisation des travaux de thèse ... 225

Références bibliographiques ... 227

Annexes ... 255

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Liste des abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique

ALOA : Agar Listeria selon Ottaviani et Agosti ANT : Aminoside nucléotidyltransférase ARNr : Acide ribonucléique ribosomal APH : Aminoside O-phosphotransphérase ATCC: American Type Culture Collection Bla: β-lactamase

BLSE: β-lactamse à spectre étendu BLAST: Basic Local Alignment Search Tool CDC: Centers for Disease Control and prevention CFC: Cephalosporine Fucidine Cetrimide

CGE: Center for genomic epidmemiology

CIPARS: Canadian Integrated Program for Antimicrobial Resistance Surveillance CLSI : Clinical laboratory Standard Institute

CMI : Concentration minimale inhibitrice COWT : Seuil épidémiologique expérimental CXG : Céphalosporine X^ème génération DGAL : Direction générale de l’alimentation

ECOFF: epidemiological cut-off value (seuil épidémiologique) ECV: epidemiological cut off value (seuil épidémiologique) EFSA: European food Safety Authority

EMBL: European Molecular Biology Laboratory EPT : Eau peptonée tamponnée

EPSA : Eau peptonée saline alcaline

EUCAST: European comitte on antimicrobial susceptibility testing FAO: Food and Agriculture Organisation of the United Nations GNS: Gélose nutritive salée

GSP: Glutamate Strach Phenol red

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8 ICE: Integrative and conjugative element

IME: Integrative and mobilizable element IMI: Imipenem-hydrolysing β-lactamase IS: Insertion sequence

Kb: kilobase

Maldi-Tof: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight MCR: plasmid-mediated colistin resistance

MLS: Macrolide lincosamide streptogramine

NARMS : National Antimicrobial Resistance Monitoring System for Enteric Bacteria NCBI: National center for biotechnology information

NDM: New Delhi Metallo-β-lactamase NPP : Nombre le plus probable

OIE : Organisation mondiale de la santé animale OMS : Organisation mondiale de la santé

PEMBA: Polymyxin pyruvate Egg yolk Mannitol Bromothymol blue Agar PCA: Plate count agar

PCR: Polymerase chain reaction PLP : Protéine liant la pénicilline

SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline SCC: Staphylococcal Chromosomal Cassette

SGI: Salmonella Genomic Island ST: Sequence type

TBX : Triptone Bile X-glucuronide TCBS : Thiosulfate itrate bile saccharose TIAC : Toxi-infection alimentaire collective UFC : Unité formant colonie

USD: United States Dollar VIM: Vérona imipénémase

VCC : Vibrio cholerae carbapenemase

VRBG : Milieu glucosé biliées au cristal violet et au rouge neutre

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Liste des tableaux

Tableau 1: Volume de consommation, de production et d'importation des produits aquatiques les

plus consommés par les français (moyenne 2013-2015) (FranceAgrimer, 2016). ... 60

Tableau 2: Conditions d’incubation pour l‘isolement et le repiquage des souches bactériennes. ... 65

Tableau 3:Abbréviation des noms des géloses sélectives. ... 66

Tableau 4: Couples d'amorces utilisés pour la PCR et le séquençage. ... 68

Tableau 5: Conditions de PCR utilisées ... 68

Tableau 6: Comparaison des résultats d’identifications des isolats obtenus par la technique MALDI- TOF et par amplification et séquençage de l'ADNr 16S (n = 501). Gen : identification au genre, Esp : identification à l’espèce, - : aucune identification. Lorsqu’aucune comparaison des résultats n’était possible, les cases ont été grisées. ... 70

Tableau 7: Taux d’identification des genres bactériens principaux (n>10) par la technique MALDI-TOF et de l’amplification et du séquençage de l’ADNr 16S (n= 373). ... 72

Tableau 8: Nombre d'isolats pour chaque genre bactérien identifié par milieux gélosés utilisés (n = 1882). Les cases grises correspondent à l’absence d’isolats, les cases vertes aux genres bactériens ciblés par les géloses sélectives, les cases orange aux genres bactériens non ciblés mais décrits dans les fiches techniques des géloses et les cases blanches aux genres bactériens non décrits dans les fiches techniques des géloses. ... 80

Tableau 9: Nombre d'isolats par gélose des espèces bactériennes. Les espèces présentées appartiennent aux genres bactériens avec plus de 100 isolats et aux genres bactériens dont au moins une espèce est potentiellement un pathogène alimentaire. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments. ... 84

Tableau 10: Proportion des genres bactériens Gram positif dans les produits de la pêche et de l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=978). .... 92

Tableau 11: Bacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes en rouge sont de potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments. ... 94 Tableau 12: Lactobacilliales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases

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blanches représentent l’absence d’isolats. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments. ... 97 Tableau 13: Micrococcales identifiées dans les produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats. ... 98 Tableau 14 : Proportion des genres bactériens Gram négatif dans les produits de la pêche et de l'aquaculture. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence d’isolats (n=640). .... 99 Tableau 15: Enterobacteriales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=

crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches. Les espèces bactériennes en rouge sont les potentiels pathogènes alimentaires. Les espèces bactériennes soulignées sont des marqueurs d’hygiène dans les aliments. ... 101 Tableau 16: Pseudomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr=

crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches. ... 102 Tableau 17: Vibrionales, Aeromonadales, Alteromondales, Oceanospiralles et Xanthomonadales isolées des produits aquatiques. Ca= cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint-Jacques. Les cases blanches représentent l’absence de souches... 103 Tableau 18: α-proteobacteria, Sphingobacteriia et Flavobacteriia isolées des produits aquatiques. Ca=

cabillaud, Pp= poissons plats, Cr= crevettes, Ho= homard, Mo= moules, Hu=huîtres, St=Saint- Jacques. Les cases grisées représentent l’absence de souches. ... 104 Tableau 19: Population bactérienne Enterococcus spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ... 124 Tableau 20 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Enterococcus spp. (n = 38). ... 127 Tableau 21 : Population bactérienne Staphylococcus aureus (n=8) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil

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S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ... 133 Tableau 22 : Population bactérienne de Staphylococcus spp. coagulase négatif (n=35) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. ECOFF : seuil épidémiologique définit dans l’EUCAST ; COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ... 134 Tableau 23 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Staphylococcus spp. (n = 29). ... 136 Tableau 24: Population bactérienne Exiguobacterium spp. (n=40) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ... 141 Tableau 25: Cumul de phénotype-non sauvage pour Exiguobacterium spp. (n = 22) ... 142 Tableau 26 : Population bactérienne Pseudomonas spp. (n =54) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ... 146 Tableau 27 : Cumul de phénotype-non sauvage pour Pseudomonas spp. (n = 27). ... 148 Tableau 28: Population bactérienne Vibrio spp. (n=46) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ... 152 Tableau 29: Population bactérienne Proteus spp. (n=32) ayant acquis des résistances selon les seuils épidémiologiques et cliniques. COwt : seuil épidémiologique expérimental, ND : non déterminé car la distribution ne suivait pas une loi normale, SP : plusieurs sous-populations observées, EC : écart-type > 3,35 mm. Seuil S/IR : seuil délimitant les populations cliniquement sensibles (S) des populations cliniquement intermédiaires (I) et résistantes (R). Les cases bleues foncées sont pour une absence de données. ... 157

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Tableau 30: Caractéristiques des genres bactériens dont la résistance aux antibiotiques a été étudiée selon les critères pour être une bactérie indicatrice de la résistance aux antibiotiques. ECOFF=

seuils épidémiologiques définis pas EUCAST. ... 170 Tableau 31: Amorces pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et l’intégrase des ICE SXT/R391 et la confirmation de l’espèce V. parahaemolyticus. ... 185 Tableau 32: Conditions de PCR pour la détection des intégrons de type 1, 2 et 3 et de l’intégrase SXT.

... 186 Tableau 33: Définition des COwt de V. parahaemolyticus et des populations non-sauvages(n = 384).

ND non déterminé... 189 Tableau 34: Phénotypes non-sauvages des souches de V. parahaemolyticus (n = 60). ... 191 Tableau 35: Comparaison des COWT et seuils cliniques du CLSI pour V. parahaemolyticus (CLSI 2015).

ND : COWT non déterminé, S : sensible, I : intermédiaire, R : résistant. Les cases bleues représentent l’absence de seuil. ... 193 Tableau 36: Comparaison des COWT pour Vibrio spp. et pour V. parahaemolyticus. ND : COWT non déterminé, SP : présence sous-population dans la distribution, EC : écart-type non validé. Les cases vertes montrent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V.

parahaemolyticus étaient identiques ou avaient une différence inférieure à l’incertitude de mesure (±2 mm). Les cases roses représentent les antibiotiques pour lesquels les COWT de Vibrio spp. et V. parahaemolyticus avaient une différence supérieure à l’incertitude de mesure (±2 mm). ... 194 Tableau 37: Concentrations d'antibiotiques utilisées pour la conjugaison bactérienne. ... 204

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Liste des figures

Figure 1: Le poisson comme aliment : apport par habitant (moyenne 2011-2013) (FAO 2016) ... 24

Figure 2: Principaux flux commerciaux des produits de la pêche dans le monde (2016)(EUMOFA 2016) ... 26

Figure 3: Lieu de vie des produits de la pêche ©IFREMER. ... 32

Figure 4: Structure mosaïque du plasmide R100. En jaune les gènes de résistance aux tétracyclines, en jaune-orangé le gène de résistance aux aminosides (aadA1), en orange le gène de résistance aux désinfectants (qacE), en rose vif le gène de résistance aux sulfamides (sul1) et en rose pâle le gène de résistance aux phénicolés (cat). En marron rayé verticalement l’opéron de résistance au mercure (mer). Les différents bleus montrent les différentes structures portant les gènes de résistance (Gillings et Stokes). ... 45

Figure 5: Distribution des diamètres d’inhibition de souches d’E. coli pour la ciprofloxacine. Les barres bleues représentent les souches sensibles cliniquement, en vert les souches intermédiaires et en rouge les souches résistantes cliniquement (Kronvall et al. 2011). ... 52

Figure 6: Distribution des bactéries de l’espèce E. coli selon les diamètres d’inhibition de la ciprofloxacine. Le seuil épidémiologique est 25 mm. Les barres noires représentent la population bactérienne sauvage et les barres blanches la population non sauvage ... 53

Figure 7:Antibiogramme des bactéries Gram positif. ... 119

Figure 8 : Antibiogramme des bactéries Gram négatif. ... 120

Figure 9:Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la rifampicine. ... 126

Figure 10: Distribution des diamètres d'inhibition Enterococcus spp. pour la vancomycine. ... 126

Figure 11: Antibiogramme d'une souche de S. aureus ATTC 25923 présentant un phénotype sauvage à gauche et d’une souche de S. haemolyticus AF16-62-CCCH3 à droite présentant un phénotype MLSB (en rouge). Pénicilline (PEN), céfoxitine (FOX), sulfamides (SSS), triméthoprime (TMP), linézolide (LZD), vancomycine (VAN), acide fusidique (FUS), tétracycline (TET), kanamycine (KAN), tobramycine (TOB), gentamicine (GEN), chloramphénicol (CHL), ciprofloxacine (CIP), érythromycine (ERY), clindamycine (CLI) et rifampicine (RIF). ... 135

Figure 12 : Distribution des diamètres d'inhibition de Staphylococcus spp. pour a) la pénicilline, b) le triméthoprime. ... 136

Figure 13 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour la pénicilline. La ligne rouge représente le COWT... 141

Figure 14 : Distribution des diamètres d’inhibition pour Exiguobacterium pour le triméthoprime. La ligne rouge représente le COWT. ... 142

Figure 15:Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’ampicilline ... 147

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Figure 16 : Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour la tétracycline ... 147 Figure 17: Distribution des diamètres d'inhibition de Pseudomonas pour l’acide nalidixique ... 148 Figure 18: Antibiogrammes des souches de Pseudomonas spp. présentant un phénotype d’induction de résistance à la ceftazidime. a) Souche AF16-309PEPE3. b) Souche AF16-280PECF1. Les antibiotiques écrits en rouge sont ceux impliqués dans le phénotype. Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST)... 149 Figure 19: Distribution des diamètres d'inhibition de Vibrio spp pour l'ampicilline. ... 153 Figure 20 : Distribution des diamètres d’inhibition de Vibrio spp. a) amoxicilline/clavulanate, b) céfalotine. ... 153 Figure 21 : Distribution des diamètres d’inhibition de Proteus spp. pour l’ampicilline. ... 158 Figure 22 : Distribution des diamètres d'inhibition du chloramphénicol pour Proteus spp ... 158 Figure 23: Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés en fonction du mode de production des matrices d’isolement. Les produits issus de la pêche sont les cabillauds, poissons plats, noix de Saint-Jacques et homards. Les produits issus d’aquaculture sont les crevettes, moules et huîtres. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Pr=Proteus, Ps=Pseudomonas, Vr=Vibrio. ... 161 Figure 24 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par genres bactériens étudiés selon le lieu de production. Les produits importés sont les crevettes, Saint-Jacques et homards. La production Européenne comprend les cabillauds, poissons plats, moules et huîtres.

St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio. ... 162 Figure 25 : Proportion de souches résistantes aux antibiotiques par matrice alimentaire et par genres bactériens étudiés. St=Staphylococcus, En=Enterococcus, Ex=Exiguobacterium, Ps=Pseudomonas, Pr=Proteus, Vr=Vibrio. ... 163 Figure 26: Matrices d'origine des souches des souches de V. parahaemolyticus... 187 Figure 27: Origines géographiques des matrices dans lesquelles les souches de V. parahaemolyticus ont été isolées. ... 188 Figure 28: Distribution des diamètres d'inhibition de V. parahaemolyticus par antibiotiques a) ampicilline ; b) gentamicine ; c) tétracycline ; d) chloramphénicol. Les histogrammes représentent la population sauvage et les histogrammes représentent la population non- sauvage. Le trait rouge représente le COwt. ... 190

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Figure 29: Antibiogramme de la souche de V. parahaemolyticus 15-B3PA-0752 présentant un phénotype sauvage à gauche et de la souche 16-B3PA-006 à droite présentant un phénotype non-sauvage pour 9 molécules testées (en rouge). Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST). ... 192 Figure 30: Exemple de PCR de détection de l'intégrase intI1. La souche E. coli pTRC99A était le témoin positif de la réaction. Les souches E. coli SXT, V. parahaemolyticus CIP 70.63 et CNRVC 089 étaient les témoins négatifs. Les puits avec le mélange réactionnel étaient des témoins de contamination de la PCR. MP : marqueur de poids moléculaire en paire de base. ... 195 Figure 31: Résultats du CIM test. ... 205 Figure 32: Antibiogrammes de la souche E. coli réceptrice UB 5201 et les deux phénotypes obtenus après la conjugaison avec V. parahaemolyticus 16-B3PA-006. Ampicilline (AMP), amoxicilline/clavulanate (AMC), ceftazidime (CAZ), céfoxitine (FOX), céfalotine (CEF), céfotaxime (CTX), témocilline (TEM), chloramphénicol (CHL), streptomycine (STR), gentamicine (GEN), cotrimoxazole (SXT), tétracycline (TET), azithromycine (AZM), acide nalidixique (NAL), ciprofloxacine (CIP) et colistine (CST)... 207

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Introduction

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La résistance aux antibiotiques est un des enjeux majeur de santé publique mondial, pouvant augmenter la létalité de bactéries pathogènes et entrainer des pertes économiques. En 2007, en Europe, il était estimé que les bactéries résistantes aux antibiotiques étaient responsables de 25 000 morts par an (Norrby et al. 2009). Sur la même année, le coût des infections avec des bactéries résistantes était estimé à 1,5 milliard d’euros (surcoût pour les des systèmes de santé et perte de productivité). En France, 158 000 patients contractent, chaque année, une infection par un germe dit multi-résistant, avec près de 12 500 décès (Santé Publique France 2015). De plus, si rien n’est mis en place pour lutter contre la résistance aux antibiotiques, il est prévu qu’en 2050 les bactéries résistantes aux antibiotiques pourraient être responsables de 10 millions de morts par an dans le monde dont 390 000 en Europe . Les pertes économiques mondiales s’élèveraient à 100 000 milliard d’euros (O’Neill 2016).

Par conséquent, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) coopère avec l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE) et la Food and Agriculture Organisation (FAO) au sein du concept

« One Health », pour lutter contre la résistance aux antibiotiques et sa dissémination. En effet, les résistances aux antibiotiques peuvent circuler entre l’Homme, les animaux et l’environnement.

L’Homme peut être exposé à des bactéries résistantes aux antibiotiques via son alimentation.

Il y a deux risques associés à la présence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans l’alimentation. Le premier est lié à la présence de bactéries pathogènes alimentaires résistantes aux antibiotiques, il y a un risque d’échec thérapeutique si un traitement antibiotique est nécessaire. Le second risque est le transfert des résistances aux antibiotiques entre la flore bactérienne de l’aliment et la flore intestinale du consommateur. Il participe alors à la dissémination des résistances aux antibiotiques.

Face à ce problème sanitaire, une surveillance de la résistance aux antibiotiques de la

« fourche à la fourchette » a été mise en place dans l’Union Européenne. La résistance aux antibiotiques des bactéries isolées des animaux de rente et des viandes est étudiée. Cela concerne

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des bactéries zoonotiques alimentaires pour l’Homme (Salmonella spp. et Campylobacter spp.) et les bactéries indicatrices de la résistance aux antibiotiques (Escherichia coli, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium). Cependant, ces plans de surveillance ne concernent que les animaux et les viandes des filières bovines, avicoles et porcines mais pas la filière de la pêche et de l’aquaculture. De plus, les études sur la résistance aux antibiotiques de la flore bactérienne présente dans les produits aquatiques sont peu nombreuses.

Pourtant, le milieu aquatique est une source alimentaire pour l’Homme, avec une augmentation mondiale de la production des produits de la pêche et de l’aquaculture depuis les années 1960. De plus, les effluents agricoles, d’aquacultures, urbaines, hospitalières et industrielles contaminent le milieu aquatique avec des résidus d’antibiotiques et des bactéries résistantes aux antibiotiques. Les effets de ces apports anthropiques sur la flore bactérienne du milieu aquatique sont encore peu connus. Pourtant, le génome des bactéries aquatiques est particulièrement riche en éléments génétiques mobiles impliqués dans la sélection et la dissémination de gènes de résistance.

Plusieurs publications mettent en évidence que des gènes de résistance à fort impact sur la santé humaine sont issus du génome des bactéries d’origine aquatique. Pour exemple, qnrA et qnrS, gènes de résistance plasmidique aux fluoroquinolones, ont été mobilisés à partir des génomes de Shewanella algae et Vibrio splendidus. La découverte de nouveaux gènes de résistance dans le milieu aquatique est souvent fortuite mais suggère que ce milieu est très favorable à la sélection de bactéries résistantes. L’expérience acquise dans la surveillance des bactéries des filières terrestres, montre que la circulation de la résistance au sein des agents zoonotiques ne peut être appréhendée sans tenir compte de la circulation des éléments génétiques mobiles porteurs de gènes de résistance au sein de bactéries sentinelles. Ainsi, il a été mis en évidence la circulation d’un unique plasmide IncI1 porteur de BLSE chez des salmonelles de sérotypes variés isolées chez l’Homme et la volaille et des E. coli commensaux de poulets (Cloaeckaert, 2010). Pour la filière halieutique et aquacole, si le choix des bactéries zoonotiques à surveiller peut paraitre simple (Vibrio, Salmonella, Listeria,…), celui des bactéries sentinelles pertinentes est moins documenté (Aeromonas, Shewanella …). Il y a un

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risque de sélection de nouveaux gènes de résistance aux antibiotiques depuis des bactéries aquatiques, comme cela s’est produit pour la β-lactamase blaOXA-48 provenant des bactéries du genre Shewanella. Il y a également un risque de diffusion des résistances de la flore bactérienne des effluents à la flore bactérienne aquatique et des animaux y vivant. Aucune étude ne permet de retracer le devenir des activités anthropiques via les apports fluviaux et de relier l’antibiorésistance en milieu dulçaquicole avec celle observée en milieu marin.

L’objectif principal de ces travaux de thèse a été de caractériser la résistance aux antibiotiques des bactéries présentes sur des produits issus de la pêche et de l’aquaculture parmi les plus consommés en France.

Dans un premier temps, nous avons réalisé une cartographie (isolement, identification) de la flore bactérienne cultivable mésophile présentes sur 9 produits aquatiques parmi les plus consommés en France (cabillaud, plie, limande, sole, moules, huîtres, noix de Saint-Jacques, homard, crevettes).

Dans un second temps, nous avons caractérisé phénotypiquement la résistance aux antibiotiques des genres bactériens les plus fréquemment isolés de ces produits dans deux objectifs :

- Déterminer les populations sauvages et non-sauvages de ces genres bactériens,

- Définir le(s) genre(s) bactérien(s) pouvant être de(s) potentiel(s) candidat(s) indicateur(s) de la résistance aux antibiotiques des produits issus du milieu marin.

Dans un troisième temps, nous avons étudié la résistance aux antibiotiques d’une collection de souches de l’espèce bactérienne Vibrio parahaemolyticus, espèce pathogène alimentaire indigène du milieu marin, isolée principalement de crustacés et de coquillages. Nous avons caractérisé les phénotypes de résistance de la collection et le potentiel de diffusion des souches phénotypiquement résistante.

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E tude bibliographique

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I. Consommation, production et commerce international des produits de la pêche et point sur la réglementation

Les produits de la pêche et de l’aquaculture sont une part importante des apports en protéines animales dans l’alimentation humaine. En 2014, ils représentaient 17 % de ces apports dans le monde (FAO 2016). Ceci est le résultat d’une augmentation de la consommation des produits aquatiques depuis 50 ans. Elle est passée de 9,9 kg/an/habitant dans les années 1960 à 20 kg/an/habitant en 2014. Cependant, la consommation de ces produits est inégale et dépend des régions du monde. Les pôles de consommation principaux sont l’Europe du Nord et de l’Ouest, avec 25 kg/an/habitant, l’Amérique du Nord, la façade pacifique de l’Asie et l’Asie du Sud-Est (Figure 1)(EUMOFA 2016). Au sein de l’union Européenne, il y a également des disparités de consommation entre les pays. En 2015, les Portugais consommaient 60kg/an/habitant de produits aquatiques alors qu’en Hongrie, la consommation était de 4,8kg/an/habitant (EUMOFA 2016) (Figure 1).

Figure 1: Le poisson comme aliment : apport par habitant (moyenne 2011-2013) (FAO 2016)

Pour soutenir la consommation croissante des produits aquatiques, la production mondiale des produits issus de la pêche a quadruplé, elle est passée de 20 millions de tonnes à près de

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80 millions de tonnes à la fin des années 1980 puis s’est stabilisée (FAO 2016). À partir de cette stabilisation de la pêche de capture, la production de l’aquaculture a fortement augmenté. Elle a été multipliée par 7, en passant de 10 millions de tonnes à la fin des années 1980 à 70 millions de tonnes en 2014 (FAO 2016). Les pays asiatiques produisent près de 74 % des ressources de pêche et d’aquaculture mondiale. Quatre pays concentrent 78 % de la production aquacole du monde : la Chine (±45 469 000 t), l’Indonésie (±4 254 000 t), l’Inde (±4 881 000 t) et le Vietnam (±3 397 000 t). La Chine, à elle seule représente 60 % des ressources aquacoles (FAO 2016).

L’Europe et les États-Unis produisent près de 10 % des ressources mondiales aquatiques chacun, l’Afrique et l’Océanie sont à 5 et 1 % respectivement (EUMOFA 2016). En 2015, au sein de l’Union européenne, 4 686 000 t de poissons ont été débarquées. Les principales espèces étaient le hareng (720 750 t, 15%), le sprat (553 714 t, 12 %) et le maquereau (464 160 t, 10 %). En ce qui concerne l’aquaculture, 80 % de la production aquacole européenne concernait l’élevage de mollusques bivalves et salmonidés (saumon et truite)(38 % de moules, 15 % de truite, 11 % de saumon et 7 % d’huîtres). En 2016, la France était le troisième producteur Européen de produits de la pêche avec 785 000 tonnes, ce qui correspondait à 11 % de la production Européenne (FranceAgriMer 2017c). Les principales espèces produites étaient le thon (102 880 t totalement issues de la pêche), les huîtres (79 010 t entièrement issues de l’aquaculture) et les moules (77 040 t très majoritairement issues de l’aquaculture).

Les pôles mondiaux de production et de consommation des produits aquatiques sont différents. En effet, un tiers de la production halieutique mondiale est exportée. Les principales espèces échangées, en termes de valeur, sont le saumon (16,6 %), les crevettes (15,3 %) et les thonidés (10,2 %). En termes de volume, ce sont les morues, merlus, églefins (14,4 %) puis les autres poissons pélagiques (12,7 %) et enfin les thonidés (8,3 %) (FAO 2016). Les flux de marchandises aquatiques se font principalement des pays en développement vers les pays développés (Figure 2) (FAO 2016). Les trois principaux pays exportateurs sont la Chine (20 980 millions d’USD), la Norvège

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(10 803 millions d’USD) et le Viet Nam (8 029 millions d’USD). En parallèle, l’Union Européenne est le marché d’importation le plus important du monde (54 000 millions d’USD) devant les Etats-Unis (20 317 millions USD) et le Japon (14 844 millions d’USD).

Figure 2: Principaux flux commerciaux des produits de la pêche dans le monde (2016)(EUMOFA 2016)

Entrée en vigueur au 1^er janvier 2006, la réforme de la réglementation européenne relative à l’hygiène des aliments a simplifié et harmonisé les textes applicables dans l’Union européenne. Cet ensemble de textes réglementaires, appelé « Paquet hygiène », concerne l’ensemble de la filière agroalimentaire depuis la production primaire, animale et végétale jusqu’au consommateur pour d'harmoniser le niveau de sécurité sanitaire. La consommation des produits aquatiques comporte des dangers dont font partie les bactéries. En effet certaines peuvent être des pathogènes alimentaires pour l’homme. En 2006, en Europe, l’Union Européenne a mis ne place un ensemble de règlements appelé le « paquet hygiène » pour assurer la sécurité sanitaire des aliments, dont les produits aquatiques. Il s’applique à l’ensemble des acteurs de la filière agro-alimentaire, de la production à la distribution au consommateur. Ils doivent veiller à ce que les produits alimentaires qu’ils vendent soit sain et sûr pour les consommateurs, sinon les produits non conformes doivent être retirés du marché. Parmi l’ensemble des textes, les règlements 2073/2005 et 1441/2007 définissent les critères microbiologiques de sécurité sanitaire des aliments. Les produits aquatiques concernés dans cette réglementation sont les fruits de mer (mollusques et crustacés) et les produits

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prêts-à-consommer. Les fruits de mer doivent contenir moins de 130 NPP Escherichia coli et aucune Salmonella. Pour les produits prêts à consommer, moins de 100 ufc/g de Listeria monocytogenes doivent être détecté en date limite de consommation (Commission européenne 2005 ).

En France, la direction générale de l’alimentation (DGAL) a défini que les produits aquatiques importés disponible à la consommation ne doivent pas être porteurs de Vibrio cholerae possédant les gènes des toxines cholériques, de V. parahaemolyticus porteur des gènes codant pour des hémolysines ou de Vibrio vulnificus (DGAL 2014).

II. Risques liés à la flore bactérienne présente dans les produits de la pêche

II.1. Flore bactérienne pathogène alimentaire pour l’homme : Toxi- infections alimentaires et résistance aux antibiotiques

La présence de bactéries pathogènes pour l’homme dans les aliments peut entraîner une infection alimentaire. Aux États-Unis, entre 1999 et 2008, la moyenne annuelle d’infections alimentaires dues à la consommation de produits aquatiques était de 664 021 personnes dont 100 morts et engendrait un coût estimé à 941 millions de dollars (Batz et al. 2012). En 2016, en Europe, 13,4% des TIAC avaient pour origine les produits aquatiques. Les principaux agents bactériens responsables de ces TIAC étaient Salmonella et Vibrio parahaemolyticus (EFSA et ECDC 2017). Listeria monocytogenes est également responsable de TIAC liée à la consommation de produits aquatiques transformés et prêt-à-consommer comme du saumon fumé ou des poissons marinés (EFSA et ECDC 2017).

L’espèce bactérienne Vibrio parahaemolyticus, indigène du milieu aquatique, est considérée comme la principale cause d’infection alimentaire bactérienne due aux produits aquatiques (Jaime et al. 2018). Les infections à V. parahaemolyticus se traduisent par des gastroentérites et la guérison est généralement spontanée. Pourtant pour les personnes à risque, notamment les personnes

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immunodéprimées ou souffrant de maladies hépatiques, l’infection peut évoluer en septicémie (Hou et al. 2011). Une antibiothérapie à base de fluoroquinolones, de C3G ou d’azithromycine peut être prescrite (Diemert 2006a, Hou et al. 2011, Chiou et al. 2015). Le Center for Disease Control and prevention (CDC) estime que cette bactérie est responsable de plus de 45 000 cas par an aux Etats- Unis du à l’alimentation (CDC 2017b). Au Japon, cette bactérie serait responsable de 20 à 30% des infections alimentaires (Jahangir Alam et al. 2002). En Europe, l’incidence des infections à V. parahaemolyticus est inconnue, exceptéé en Galice, où depuis les années 1990 des infections, liées à la consommation de produits aquatiques sont reportées régulièrement (Jaime et al. 2018). En Espagne, en 2004 et 2012, 80 et 100 personnes ont été contaminées en mangeant des crustacés.

Dans le premier cas, des crabes importés d’Angleterre étaient probablement la cause de la TIAC (Jaime Martinez-Urtaza et al. 2005). Dans le deuxième cas, il y aurait eu une contamination croisée entre des coquillages de Galice contaminés et des crevettes congelées via la glace utilisée pour refroidir les aliments cuits (Martinez-Urtaza et al. 2016). En France, en 1997, une infection notable a impliqué 44 personnes ayant consommées des crevettes importées d’Asie (Robert-Pillot et al. 2004).

L. monocytogenes n’est pas considérée comme une bactérie native du milieu aquatique. Sa présence dans ce milieu serait causée par une contamination d’effluents terrestres (plantes en décomposition, fèces de bétails)(Vázquez-Boland et al. 2001, Lyautey Emilie et al. 2007, Jami et al.

2014). L. monocytogenes contaminerait les produits aquatiques dans l’eau ou les ateliers agro- alimentaires (Jami et al. 2014). Cette espèce bactérienne a été isolée de 0 à 34 % de saumons et truites vivantes ou fraîches et de 0 à 79 % de saumons et truites fumées (Gram 2001).Ce pathogène alimentaire est isolé d’environ 5 % des produits aquatiques transformés dans l’union européenne (Jami et al. 2014). L’ingestion d’aliments contaminés par des personnes en bonne santé peut déclencher des gastro-entérites. L’infection dure quelques jours et la guérison est spontanée. En revanche, chez les personnes fragilisées (comme les nouveau-nés, les personnes âgées, les femmes enceintes et les personnes immunodéprimées), la bactérie peut passer la barrière intestinale et se propager dans le corps humain (septicémie, méningite) (Santé Publique France). Le taux de mortalité

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pour les sujets à risque est de 20% à 30 %(Vázquez-Boland et al. 2001). De plus, chez les femmes enceintes la bactérie peut envahir le placenta et infecter le fœtus. Il y a alors un risque de fausse couche ou que le nourrisson soit atteint de listériose. En cas d’infection, un traitement antibiotique à base d’aminoside et de pénicilline peut être prescrit (Temple et Nahata 2000).

Entre 2008 et 2015, dans l’union Européenne, il y a eu 7 TIAC liées à la consommation de produits aquatiques (viande de crabe, hareng marinés, saumon gravad et poissons fumés/fermentés). Il y a eu 40 malades, dont 25 hospitalisations et 4 morts (Ricci et al. 2018).

Récemment, en 2017, la consommation de saumons fumés, produits en Pologne et contaminés par L.

monocytogenes, a causé une TIAC touchant 4 personnes (RASFF 2017, Vidal 2017).

Les bactéries du genre Salmonella sont responsables de près de 15 % et 21 % des TIAC aux États-Unis et en Europe respectivement (Huang 2016, EFSA et ECDC 2017). Cependant, ces bactéries ne sont pas natives du milieu aquatique, la contamination des produits issus de ce milieu se fait par des eaux souillées ou une mauvaise hygiène dans les entreprises (Fernandes et al. 2018). Par conséquent, en 2016, en Europe, Salmonella était l’agent causatif de 5 % des TIAC associées avec la consommation des produits de la pêche, contre 40 % des TIAC associées à la consommation de produits à base de viande (EFSA et ECDC 2017). Les symptômes des infections alimentaires causées par cette bactérie sont généralement des gastro-entérites et le patient guérit spontanément.

Cependant, pour les individus à risque comme les enfants, les personnes âgées, les femmes enceintes et les personnes immunodéprimées, les infections alimentaires peuvent entraîner des complications, comme une septicémie et menacer la vie du patient (Santé Publique France , Chlebicz et Śliżewska 2018). Un traitement antibiotique à base de fluoroquinolone, de C3G ou d’azithromycine peut être prescrit (Diemert 2006a, Le Hello et al. 2011).En 2015, aux Etats-Unis, la consommation de thon congelé, contaminé par Salmonella sérovar paratyphi B et Salmonella sérovar Weltevred, a causé des infections alimentaires à travers 11 états. Au total, 65 personnes ont été malades avec 11 hospitalisations (Hassan et al. 2018). En 2016, en Arizona, 25 personnes ont été infectées par

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Salmonella sérovar javina et 17 hospitalisées après avoir mangé des produits aquatiques dans un restaurant. Du fait du nombre d’aliments différents incriminés (crevettes, huîtres, poissons), une contamination croisée dans le restaurant a été suspectée (Venkat et al. 2018).

Cependant, si les souches bactériennes responsables d’infections acquièrent des résistances aux antibiotiques, alors il y a un risque d’ échec thérapeutique, pouvant mener au décès du patient. Il n’y a pas de cas référencé de toxi-infection alimentaire avec des bactéries résistantes aux antibiotiques liés à la consommation de produits aquatiques. Pourtant, le risque d’infection alimentaire par une bactérie résistante aux antibiotiques n’est pas nul. En effet, une étude réalisée entre 2000 et 2005 aux Etats-Unis, sur la contamination par Salmonella de produits aquatiques importés d’Asie, a montré que 25 % des souches étaient résistantes à au moins un antibiotique (Khan et al. 2009). De plus, des infections alimentaires impliquant d’autres aliments avec des bactéries résistantes aux antibiotiques ont été décrites dans la littérature scientifique. En 2015, aux États-Unis, 192 personnes ont été infectées par Salmonella sérotype I 4,[5],12:i:- et infantis en mangeant de la viande de porc. Les souches du sérovar I 4,[5],12:i:- étaient multirésistantes, elles avaient acquis des résistances aux pénicillines (ampicilline), aminosides (streptomycine), tétracyclines (tétracycline), sulfamides (sulfisoxazole) (CDC 2015). Suite à ces infections 30 personnes ont été hospitalisées et aucune mort n’a été déclarée. De plus, depuis 2002 des souches de Salmonella sérotype Kentucky ST198-X1 résistantes aux quinolones, pénicillines, phénicolés, aminosides, sulfamides et cyclines se sont disséminées en Afrique (Egypte, Maroc, Nigéria), Asie (Inde, Bangladesh), Europe (Pologne, Allemagne, France) (Le Hello et al. 2011). Entre 2000 et 2008, plus de 500 personnes ont été malades à cause de la consommation d’aliments contaminés par ce clone en France, en Angleterre, au Pays de Galle et au Danemark(Le Hello et al. 2011).Ce clone bactérien a été isolé de matrices alimentaires comme de la viande, des épices ou des produits aquatiques, mais aussi de reptiles et de prélèvements environnementaux (rivière, compost) (Le Hello et al. 2013).

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II.2. Flore bactérienne cultivable des produits de la pêche et de l’aquaculture

La flore bactérienne non pathogène présente dans les produits aquatiques est peu décrite dans la littérature scientifique. Les quelques travaux ont montré que l’environnement (température, salinité, …) impacte la composition de cette flore bactérienne. Il a été établi que les saisons influaient la composition des flores bactériennes des poissons. En hiver, la flore digestive des saumons est dominée par les bactéries à Gram positif et, en été, elle est dominée par les Vibrionaceae (Tarnecki et al. 2017). En effet, les poissons, mollusques et crustacés sont des animaux dont la température interne est variable et donc la flore bactérienne associée à ces animaux est également dépendante de la température du milieu (Liston 1957, Georgala 1958, Chen et al. 2016). Il a été également montré que la salinité de l’eau influence les flores bactériennes isolées des animaux marins. En effet, les bactéries du genre Vibrio sont isolées des animaux marins (Kueh et Chan 1985, Tarnecki et al.

2017) tandis que celle du genre Aeromonas sont plus spécifiques aux animaux d’eau douce (Tarnecki et al. 2017). De plus, l’origine géographique influe également la composition des flores bactériennes.

Par exemple, les bactéries du genre Vibrio sont associées aux animaux des eaux chaudes (Al-Harbi et Uddin 2005, Baker-Austin et al. 2017). Les animaux vivants près des côtes comme les mollusques et les poissons côtiers sont soumis directement aux pollutions microbiologiques anthropiques comme bactéries les fécales par rapport aux animaux de pleine mer comme le cabillaud.

Par ailleurs, la position de l’animal dans la colonne d’eau peut également avoir un impact sur sa flore bactérienne : les espèces benthiques comme les poissons plats et les mollusques bivalves sont en contact avec la flore bactérienne sédimentaire, alors que les espèces pélagiques comme le thon ne le sont pas (Figure 3). La composition des flores des animaux aquatiques semble donc être multifactorielle, ce qui ne permet pas aux chercheurs de différencier une flore allochtone (transitoire) d’une flore autochtone (résidente) (Cahill 1990, Austin 2006, Lyons et al. 2017, OIE

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2017a). Cependant certains auteurs émettent l’hypothèse d’une notion d’une flore de base, c’est-à- dire que la diversité et la prévalence de certains genres bactériens sont spécifiques à des espèces ou des groupes d’espèces d’animaux aquatiques (Georgala 1958, Kueh et Chan 1985, Larsen et al. 2013, Tarnecki et al. 2017).

La plupart des études se concentrent sur le tube digestif des poissons d’élevage et de son rôle en aquaculture sur la croissance des poissons (Leroi 2010). Pourtant, la chair des poissons est considérée stérile et la contamination bactérienne se fait par contamination croisée avec la peau, les branchies et/ ou le tube digestif lors de leur manipulation. Quelques études également ont décrit la flore bactérienne isolée de la peau et des branchies des poissons issus de la pêche. Liston et al.

(1957) ont décrit la flore bactérienne de limandes (Pleuronectes microcephalus) pêchées au large de l’Ecosse. Il a montré la présence de bactéries du genre Pseudomonas (57 %), Achromobacter (16,7

%), Alcaligenes (9,5 %), Flavobacterium (9,5 %) sur la peau. Ils ont montré que la flore bactérienne dans les branchies et sur la peau étaient la même, mais pas celle présente dans le tube digestif. En effet dans le tube digestif, les proportions bactériennes étaient différentes : Pseudomonas (34,6 %),

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Achromobacter (7,7 %), Alcaligenes (1,9 %), Flavobacterium (9,6 %). De plus ils ont montré la présence des bactéries du genre Vibrio (34,6 %) et Corynebacterium (5,8 %) (Liston 1957). Georgala et al. (1958), dans les mêmes conditions expérimentales, ont décrit sur la peau de cabillaud la même flore bactérienne que sur la peau de limande. Ils ont montré en plus la présence des bactéries des genres Vibrio (4,7 %), Corynebacterium (5,1 %) et Micrococcus (0,9 %). Le constat était le même pour des poissons provenant de la Baie de Seattle. Les flores bactériennes de la peau et des branchies étaient proches et il y avait une différence avec celle du tube digestif. Les genres bactériens décrits étaient les mêmes que ceux isolés de limande et de cabillaud dans des proportions proches.

Cependant quelques genres supplémentaires ont été décrits comme Bacillus, Aeromonas, Proteus, Brevibacterium, Arthrobacter, Photobacterium et Enterobacter mais ils étaient minoritaires (Colwell 1962). Des bactéries des genres Pseudomonas, Psychrobacter, Proteus, Vibrio, Pseudoalteromonas, Shewanella, Vagococcus, Staphylococcus, Oceanisphaera, Synechococcus, Bizoni et Bacillus ont été isolées de la peau, des branchies et des intestins de maquereaux d’Atlantique Nord sur une gélose (Svanevik et Lunestad 2011). L’ensemble de ces flores décrites sont dominées par les bactéries à Gram négatif : Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Cytophaga, et les genres appartenant à la famille des Enterobacteriaceae. Toutefois dans d’autres travaux des bactéries à Gram positif appartenant aux genres Micrococcus, Bacillus et Corynebacterium ont été également isolées (Cahill 1990, Austin 2006, Leroi 2010).

Dans la flore bactérienne des mollusques bivalves, les genres bactériens fréquemment isolés étaient Pseudomonas, Vibrio, Acinetobacter, Corynebacterium, Alcaligenes, Micrococcus, Bacillus (Colwell et Liston 1960, Kueh et Chan 1985, Linton et al. 2003, Cruz-Romero et al. 2008, Cao et al.

2009, Amadi 2015). Cependant, les proportions de ces genres bactériens étaient différentes selon les études. Par exemple, les bactéries du genre Pseudomonas représentaient 50 % des souches isolées de moules et d’huîtres de Hong-Kong (Kueh et Chan 1985), 10 % des isolats de coquilles Saint- Jacques et de moules, 20 % des isolats d’huîtres prélevées en Chine (Cao et al. 2009). La présence d’Enterobacteriaceae était également fréquente dans la flore bactérienne des mollusques bivalves.

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Des souches d’E. coli et de Proteus spp. étaient notamment identifiées dans deshuîtres (Amadi 2015).

Cependant, une identification plus précise que la famille Enterobacteriaceae était rarement faite (Linton et al. 2003, Cruz-Romero et al. 2008, Cao et al. 2009, Amadi 2015). D’autres genres bactériens, comme Moraxella et Lactobacillus peuvent être isolés de moules, d’huîtres et de Saint- Jacques, Flavobacterium et Staphylococcus de moules et d’huîtres, Leuconostoc isolés de moules et de Saint-Jacques (Kueh et Chan 1985, Linton et al. 2003, Amadi 2015). De plus, dans certaines études, des souches de Shewanella et Enterococcus ont été isolées dans des huîtres (Colwell et Liston 1960, Cao et al. 2009).

Les crustacés sont un sous-embranchement des arthropodes. Ils possèdent une carapace de chitine. Ce polymère facilite l’adhésion de certains genres bactériens comme Vibrio (Carman et Dobbs 1997). Les études décrivant la flore bactérienne des crustacés sont peu nombreuses et ne concernent que les crevettes. Cependant, les bactéries des genres Bacillus et Staphylococcus étaient systématiquement isolées, comme les bactéries appartenant aux bactéries lactiques (Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus) et aux Enterobactericeae (Proteus, Serratia, Escherichia, Enterobacter) (Heinsz et al. 1988, Linton et al. 2003, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Les genres Acinetobacter, Moraxella, Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Flavobacterium, Exiguobacterium étaient également fréquemment isolés dans les crevettes (Heinsz et al. 1988, Linton et al. 2003, Broekaert et al. 2013, Dabadé et al. 2016). Les bactéries des genres Aeromonas, Vibrio, Alcaligenes ont été isolées plus spécifiquement de crevettes pêchées en mer d’Irlande (Linton et al.

2003), Chryseobacterium, Loktanella, Planococcus, Pseudoalteromonas, Psychrobacter de crevettes pêchées en Mer du nord (Broekaert et al. 2013) et Kurthia, Macrococcus, de crevettes d’élevage Béninois (Dabadé et al. 2016).

II.3. Résistance aux antibiotiques de la flore des produits aquatiques

La présence de résistance acquise aux antibiotiques dans la flore bactérienne, qu’elle soit pathogène ou non pathogène, des produits de la pêche et de l’aquaculture présente un risque de

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transmission de gènes de résistance des bactéries présentes dans l’aliment à celles du tube digestif humain. Ce phénomène peut alimenter le réservoir de gènes de résistance que constitue le microbiote humain à partir du réservoir animal (Broaders et al. 2013). Ces gènes de résistance peuvent être mobilisés ultérieurement de ce réservoir par une bactérie pathogène. De plus, les individus porteurs de résistance peuvent la diffuser dans leur environnement.

Quelques travaux scientifiques ont mis en évidence la présence de bactéries porteuses de résistance aux antibiotiques dans les produits aquatiques. Une étude canadienne a décrit une nouvelle carbapénémase, VCC-1, dans des souches de Vibrio cholerae isolées de crevettes disponibles à la consommation (Mangat et al. 2016). Une autre étude a mis en évidence la présence d’un gène de carbapénémase blaIMI chez Enterobacter cloacae et Enterobacter aerogenes isolés de crevettes en provenance d’Asie du Sud-Est (Janecko et al. 2016). De plus, une souche E. coli productrice de VIM-1 et une souche E. cloacae productrice de NDM-1 ont été isolées de palourdes importées, d’Italie vers l’Allemagne pour la première, du Vietnam vers le Canada pour la seconde (Janecko et al. 2016, Roschanski et al. 2017). Des résistances à d’autres classes d’antibiotiques ont été retrouvées dans ces souches, notamment aux aminosides, quinolones, phénicolés et sulfamides (Janecko et al. 2016, Roschanski et al. 2017). En 2014, une équipe canadienne a mis en évidence une souche de Pseudomonas spp, isolée d’un calamar, produisant la carbapénémase VIM-2 (Joseph et al.

2014). Une étude japonaise a mis en évidence des souches Aeromonas hydrophila, isolées de palourdes, de poisson empereur et de dorade japonaise, porteurs la β-lactamase blaPSE-1 et de gènes de résistance aux aminosides et au triméthoprime (Ahmed et al. 2015). De plus, dans une ferme aquacole française, au moment de l’abattage de truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), des souches Aeromonas spp résistantes aux quinolones, sulfamides, aminosides et triméthoprime ont été isolées (Naviner et al. 2011). De même, une bactérie du genre Citrobacter porteuse de β-lactamase blaOXA-48 et des bactéries de l’ordre des Enterobacteriales porteuses de gènes de résistance aux tétracyclines, et aux inhibiteurs de la synthèse des folates ont également été isolées des poissons d’élevage en Lituanie (Ruzauskas et al. 2018).