Disponible à / Available at permalink :

- - -

- - -

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Zarkik, S. (1996). Contribution à l'étude de la fusion BLV (Bovine Leukemia Virus)-cellule. (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212360/3/3a3ea633-e5e9-4888-8738-fb7422197324.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université (di-fusion@ulb.be).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;

L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;

Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University (di-fusion@ulb.be).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.

Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;

The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire de Chimie Physique des Macromolécules aux Interfaces

Directeur: Prof Jean-Marie RUYSSCHAERT

CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA FUSION BLV (Bovine Leukemia Virus)-CELLULE.

Thèse présentée en vue de

l'obtention du grade de

Docteur en Sciences

ZARKIK Sarra

Octobre 1996

Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire de Chimie Physique des Macromolécules aux Interfaces

Directeur: Prof Jean-Marie RUYSSCHAERT

CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA FUSION BLV (Bovine Leukemia Virus)-CELLULE.

Thèse présentée en vue de

l'obtention du grade de

Docteur en Sciences

Remerciements

Au terme de ce travail, je voudrais remercier tous ceux qui de près ou de loin m'ont aidée et soutenue durant toutes ces années.

Je tiens à remercier le Professeur Jean-Marie Ruysschaert, pour m'avoir accueillie dans son laboratoire. Le soutien et la confiance qu'il m'a accordés ainsi que l'intérêt constant qu'il a porté à ce travail m'ont permis d'effectuer ces recherches dans les meilleures conditions possibles.

Je remercie tout particulièrement le Professeur Arsène Burny, pour m'avoir également reçue dans son laboratoire de Chimie Biologique. Son enthousiasme, sa générosité et ses discussions stimulantes m'ont été d'une grande aide.

Merci également au Docteur Daniel Porteielle pour m'avoir fournis le matériel nécessaire à la réalisation de ce travail.

Je voudrais dire un grand merci à,

Fabienne Defrise-Queriain, non seulement pour avoir guidé mes premiers pas dans le domaine de la recherche mais également pour sa gentillesse, sa disponibilité et surtout pour son amitié.

Véronique Cabiaux, pour avoir su m'écouter et m'encourager dans les moments difficiles, pour les nombreuses discussions, de tout et de rien, que nous avons eues ensemble et pour son amitié.

Isabelle Martin pour sa disponibilité, ses conseils judicieux et son aide précieuse lors de la réalisation de cette thèse.

Sandrine Wouters, pour sa sympathie, ses encouragements et son aide dans la correction de ce manuscrit.

Caroline Vanhulle, pour sa gentillesse, sa disponibilité, ses encouragements et pour son patient travail dans la lecture de ce manuscrit.

Monique Lahaye, pour sa sympathie, pour toute l'aide qu'elle m'a apportée et surtout pour son grand talent "d'avocate".

Tous les membres du LCPMI et du laboratoire de Chimie Biologique pour m'avoir permis

de travailler dans une ambiance amicale et chaleureuse. Merci à Michel (VDB), Najib, Guy, Véro,

Pierre, Carine, Fabien, Philippe, Fabrice, Elge, Erik, Vincent, Keith, Xio-Ming, Nathalie,

Michel (Poulou), Jacques, Sunu, Christian, Abdel, Odile, Sophie, Bénédicte, Christina, Jimmy,

Sylvia, Aouatif, Véronique, Delphine, Gosia, Anne, Louis, Yvette, Karen, Jean, Roland et

Jeanine.

Perrine, Suzanne, Anne et tous les membres du Laboratoire de Radiobiologie pour leur sympathie et leur gentillesse.

Mme Van De Winckel Madeleine et Mr Nuhuys Luc pour leur présence permanente, leur sympathie et leur générosité. Grâce à vous je me suis sentie en famille. Merci beaucoup.

Je voudrais dire un grand merci à Nadia, Mohamed, Fatima, Ali,... et à tous mes compatriotes qui nous ont permis de nous sentir un peu moins dépaysés.

Un merci tout particulier va à mes parents qui ont suivi de très près ma progression. Merci

"baba" et merci "mamma" pour votre aide constante, votre soutien et vos encouragements.

J'espère qu'avec l'achèvement de cette thèse, j'aurais pu réaliser une partie de votre rêve.

Merci également à mon petit frère Tarik , à ma soeur Mariam et à toute ma famille pour leur intérêt constant et leurs encouragements.

Un grand merci à "Azizi", Lalla, Nana, Abdelkarim, Omar, Ahmed, Aziza et à toute la famille pour leur amour et leur soutien.

Je voudrais terminer en remerciant les êtres qui me sont les plus chers: mes DEUX HOMMES:

Merci à toi Mohamed pour avoir été à mes côtés (même en étant loin) et m'avoir toujours encouragée. C'est l'amour et le soutien que tu m'as apportés durant toutes ces années qui m'ont aidée à tenir le coup et à arriver au bout de ce parcours.

Merci à toi aussi M. Yassin, mon petit bout'chou, pour avoir été le rayon de soleil qui a illuminé notre vie durant ces 18 derniers mois.

Enfin, je ne pourrais m'empêcher de remercier celle qui, par ses coups de pieds ou de coudes m'a tenu compagnie durant ces derniers mois et a fait que je me sentes un peu moins seule.

A tous, merci de tout coeur.

Sarra

TABLE DES MA TIERES

Résumé

/. Introduction

I. 1. Aperçu sur les rétrovirus 1

I. 1. a-Le cycle viral 1

I. 1. b- Transmission de l'infection virale 2

I. 2. Le virus de la leucémie bovine (BLV) 2

I. 2. a- Structure du BLV 3

I. 2. b- Organisation génomique du BLV 3

I. 2. c- Les protéines codées par le BLV 3

1 - Les protéines structurales 3

2- Les protéines de régulation 4

I. 2. d- La pathologie induite par le BLV 5

I. 3. Mécanisme de l'infection virale 6

I. 3 . a- La liaison virus-cellule 6

I. 3 . b- La fusion virus-cellule 7

1- La fusion membranaire dépendante du pH 7 2- La fusion membranaire indépendante du pH 8 3- Facteurs influençant la fusion membranaire 9

I. 4. Etude des glycoprotéines d'enveloppe du BLV 11

I. 4. a- La glycoprotéine gp30 11

I. 4. b- La glycoprotéine gp51 13

I. 4. c- Modélisation moléculaire des glycoprotéines

d'enveloppe du BLV 15

I. 5. La maturation des glycoprotéines de l'enveloppe

virale par clivage endoprotéolytique 16

I. 6. La maturation des proprotéines par les convertases 17

I. 6. a- la flirine 20

I. 6. b- Les prohormones convertases PCI et PC2 21

I. 6. c- La prohormone convertase PACE4 22

I, 6. d- La prohormone convertase PC4 23

I. 6. e- La prohormone convertase PC5 23

I. 6. f- La prohormone convertase PC7 23

IL But du travail 24

III. Matériels et méthodes 26

III. 1. Matériels 26

III. 1. a-Produits utilisés 26

III. 1. b- Tampons utilisés 27

\

III. 2. Méthodes expérimentales 28

III. 2. a- Préparation des liposomes 28

III. 2. b- Production et purification du virus 28

1- Test ELIS A 29

2- Electrophorèse 29

3- Western Blot 30

III. 2. c- Marquage du virus 31

III. 2. d- Interaction BLV-Rl 8/cellules 31

III. 2. e- Interaction BLV-Rl 8/liposomes 32

III. 2. f- Etude du dequenching de la fluorescence du RI 8 32 III. 2. g- Etude du clivage de la gp72 par les

prohormones convertases "in vivo" 33

IV. Résultats

IV. 1. Etude de l'activité fiisogène du BLV 34

IV. 1. a- Purification et marquage du BLV au RI8 35 IV. 1. b- Fusion du BLV-Rl 8 avec des grands

liposomes unilamellaires 36

IV. 1. c- Fusion du BLV-Rl 8 avec des cellules cibles 37 1. Adsorption du BLV-Rl8 sur les cellules et

formation du complexe virus/cellule 37

2. Effet du pH et de la température sur la

fusion du BLV-Rl8 avec les cellules CC81 37 3. Influence du type cellulaire sur la fusion du BLV-cellule 38 IV. 1. d- Etude de la fusion BLV-cellules par combinaison de la

technique RI8 et de la PCR 39

Article I, 23 pages

Résumé et discussion de l'article 40

IV. 1. e- Effet de l'ApoAl sur la fusion du BLV-Rl8 avec les

cellules CCS 1 42

Conclusions et perspectives 43

IV. 2. Clivage endoprotéolytique de la gp72 en gp51 et gp30 46 IV. 2. a- Clivage de la gp72 par la furine, PCI,

PACE4 et PC5/6A "in vivo" 46

IV. 2. b- Comparaison du clivage de la gp72 dans

les cellules CVl et les cellules LoVo 47

IV. 2. c- Clivage de la gp72 par la furine ,PC1

PACE4 et PC5 "in vitro" 48

Article II, 22 pages.

Résumé et discussion de l'article 49

Conclusions et perspectives 51

Conclusions sénérales 54

Abréviations

acides aminés .

Ala (A) alanine Arg (R) arginine Asn (N) asparagine Asp (D) acide aspartique Cys (C) cystéine

Gin (Q) glutamine

Glu (E) acide glutamique Gly (G) glycine

His (H) histidine Ile (I) isoleucine Leu (L) leucine Lys (K) lysine Met (M) méthionine Phe (F) phénylalanine Pro (P) proline Ser (S) sérine Thr (T) thréonine Trp (W) tryptophane Tyr (Y) tyrosine Val (V) valine ACTH corticotropine

ADN acide désoxyribonucléique ApoAl apolipoprotéine Al

ARN acide ribonucléique BLV bovine leukemia virus BSA bovine sérum albumine

CL cardiolipine

Chol cholestérol

DOPC L-a-dioléoylphosphatidylcholine

EDTA éthylène diamine tétraacétate de sodium FCS foetal calf sérum

FPV flow plague virus

gP glycoprotéine

HA hémagglutinine

HIV human immunodeficiency virus

HTLV JP kDa LFA-1 P-LPH LUV LTR MLV

human T-cell leukemia virus jonction peptide

kilodalton

lymphocyte function-associated antigen 1 P-lipotropine

large unilamellar vesicles long terminal repeat multilamellar vesicles moi.

a-MSH Mo-MuLV NDV P-NGF PAGE PC PC PCR al-PDX PG POMC PS RT RT-PCR RSV SFV SIV SM SUV VEM VSV

multiplicité d'infection a-mélanotropine

moloney murine leukemia virus newcastle disease virus

P-nerve growth factor

pair basic amino acid cleaving enzyme prohormone convertase

L-a-phosphatidylcholine polymerase chain reaction al-antitrypsine Portland phosphatidylglycérol proopiomélanocortine phosphatidylsérine reverse transcriptase

reverse transcription-polymerase chain reaction rous sarcoma virus

semliki forest virus

simian immunodeficiency virus sphingomyèline

small unilamellar vesicles virus envelope maturase vesicular stomatitis virus Les cellules utilisées

BL+ Bat Lung: cellules de poumon de chauve-souris, chroniquement infectées par le BLV.

CC81 CVl FLK

fibroblastes de chat transformés par le MSV.

cellules de rein de singe vert d'Afnque.

Foetal lamb kidney: cellules de rein de foetus ovin,

RESUME

Le virus de la leucémie bovine (BLV) est l'agent étiologique de la leucose bovine.

Il infecte les lymphocytes B et induit des tumeurs lymphoïdes chez les ruminants. Comme pour tout virus enveloppé, l'infection d'une cellule par le BLV commence par la fixation du virus sur son récepteur suivie de la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire permettant l'entrée du matériel génétique du virus dans la cellule. Ces premières étapes de l'infection virale sont médiées par les glycoprotéines d'enveloppe virale gp51 et gp30. La gp51 assure la reconnaissance du récepteur cellulaire alors que la gp30, par son extrémité NH2-temiinale hydrophobe, est impliquée dans le processus de fusion. La fusion membranaire induite par le BLV est généralement étudiée par des méthodes très indirectes (lyse cellulaire, formation de syncytia...) qui ne permettent pas de suivre directement la cinétique de fusion virus-cellule. Les techniques utilisant des marqueurs fluorescents tels que l'octadécylrhodamine ou RI 8 insérés dans l'enveloppe virale constituent une alternative intéressante pour suivre la cinétique de fusion virus-cellule hôte.

La première partie de ce travail est consacrée à l'étude de la fusion du BLV marqué au RI8 avec des cellules cibles. Nous avons montré que:

1. La fusion BLV-cellule est indépendante du pH et que, outre son rôle dans la reconnaissance du récepteur, la gp51 est également impliquée dans le processus de fusion membranaire.

2. L'épitope H de la gp51, qui joue un rôle important dans la formation de syncytia, n'intervient pas lors de la fusion virus-cellule.

3. La fusion BLV-cellule cible observée en fluorescence est accompagnée de l'entrée du

matériel génétique du virus dans la cellule. Ceci a été démontré en combinant la méthode

RI 8 et la technique PCR.

La fusion BLV-cellule hôte implique les glycoprotéines d'enveloppe virale gp51 et gp30. Celles-ci sont synthétisées sous la forme d'un précurseur inactif (gp72) clivé par une ou plusieurs enzymes cellulaires. Le clivage endoprotéolytique de la gp72 en gp51 et gp30 est une condition indispensable à l'activité fiisogène du BLV. Les enzymes impliquées dans ce processus de maturation de la gp72 restaient inconnues. Cependant, l'analogie de séquence entre les sites de clivage du précurseur des glycoprotéines d'enveloppe du BLV (R-V-R-R>1) et des prohormones (R-X-K/R-R't) suggère que les prohormones convertases, une famille d'enzymes récemment identifiées, pourraient être impliquées dans la maturation endoprotéolytique de la gp72 du BLV.

Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons démontré que plusieurs

prohormones convertases (furine, PACE4, PC5) clivent la gp72 "in vitro". Le site de

clivage a été identifié. En coexpression, le clivage de la gp72 est favorisé en présence de

la fùrine. Par RT-PCR, nous avons montré que seuls les ARNm des convertases furine et

PC7 sont transcrits dans les lymphocytes B.

INTRODUCTION

Fig. 11. Cycle de réplication d'un rétrovirus.

Le cycle commence par la fixation du virus sur son récepteur cellulaire suivie de la

fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire et libération de la

nucléocapside dans le cytoplasme. La transcriptase inverse synthétise une copie

d'ADN double brin complémentaire de l'ARN viral, qui sera intégré dans le génome

cellulaire. Cette forme intégrée de l'ADN est appelée provirus. Après activation, cet

ADN proviral est transcrit par les ARN polymérases de la cellule. Après leur

synthèse, certains ARNs viraux sont épissés et traduits par la machinerie cellulaire

alors que d'autres s'assemblent avec les protéines virales pour former de nouveaux

virions qui quittent la cellule par bourgeonnement, (d'après Portetelle, 1990)

INTRODUCTION

/. 1. Aperçu sur les rétrovirus:

Les rétrovirus sont des virus enveloppés qui infectent les cellules animales. Leur génome est constitué de deux molécules d'ARN identiques liées entre elles de manière non covalente. Leur cycle de réplication nécessite la synthèse d'une molécule d'ADN à partir de l'ARN génomique viral. Cette rétrotranscription est assurée par la transcriptase inverse, enzyme apportée par le virus. Les rétrovirus sont classés en trois sous-familles en fonction de leurs propriétés biologiques (revue de Coffin et al., 1991):

- les lentivirus (tels que HIV, SIV, Visna) sont des virus induisant des maladies immunologiques et neurologiques à évolution lente et progressive. Ils ne semblent pas être impliqués dans le processus de transformation cellulaire.

- les spumavirus (tel que le Foamy virus) sont responsables d'infections bénignes. In vitro, ils induisent la vacuolisation des cellules infectées.

- les oncovirus (tels que HTLV I et HTLV II, RSV, BLV) sont associés à différentes formes de cancer.

I. J. a- Le cycle viral: (fig. I. 1)

Le cycle rétroviral commence par la fixation du virus sur son récepteur, suivie par la

fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire. Ceci permet au virus de libérer son

matériel génétique dans le cytoplasme de la cellule infectée. L'ARN viral sert alors de modèle à

la transcriptase inverse pour la synthèse d'une copie d'ADN. L'ADN double brin migre vers le

noyau où il s'intégre dans le génome cellulaire grâce à l'intégrase virale. On parle alors de

provirus qui sera répliqué en même temps que l'ADN cellulaire.

Le génome rétroviral est constitué essentiellement de trois gènes:

- le gène "pol" (polymérase) codant pour la transcriptase inverse et l'intégrase.

- le gène "gag" (group spécifie antigen) codant pour les protéines internes du virus (capside, matrice).

- le gène "env" (enveloppe) codant pour les glycoprotéines de l'enveloppe virale.

Après leur synthèse, certains ARNs viraux sont épissés et traduits par la machinerie cellulaire alors que d'autres s'assemblent avec les protéines virales pour former de nouveaux virions qui quittent la cellule par bourgeonnement.

11 b- Transmission de l'infection virale:

L'infection virale peut se transmettre essentiellement de deux manières;

- transmission verticale: le provirus intégré dans le génome est transmis lors de la division cellulaire.

- transmission horizontale: suite à la production de virions matures, de nouvelles cellules cibles peuvent être infectées.

Il faut aussi mentionner la transmission de l'infection virale par fusion d'une cellule infectée exprimant à sa surface les glycoprotéines virales avec des cellules voisines non infectées pour former de grandes cellules polynucléées appelées syncytia. Ce mode de transmission existe chez certains virus tels que HIV et SIV (McClure et al., 1988),

7. 2. Le virus de la leucémie bovine (BLV)

Le BLV est un rétrovirus qui induit des tumeurs lymphoïdes chez les ruminants (revue

de Kettmann et al., 1994). Il est transmis par l'intermédiaire de cellules infectées véhiculées par

le sang et les sécrétions (Mammerickx et al., 1987, Bumy et al., 1980). Structurellement et

fonctionnellement, le BLV est apparenté aux virus de la leucémie humaine, HTLV I et HTLV

II (Rice et al., 1987b), ce qui en fait un excellent modèle pour l'étude des mécanismes viraux

induisant la leucémie chez l'homme.

Proteine env ancrée dans ta membrane par la gp30

Proteines gag formant la capside

Protéine pol Revcrsc-iranscriptase. RNasc

et imégrase

ARN

gp51

gp 30

O

P12 (protéine liée à TARN)

Fig. I. 2. Représentation schématique de la structure d'une particule de BLV (d'aorès Uckert, 1984).

H---+

2

PROT

LTR CAC

pr 14S

pr 68

pr 44

1 ,

’ prot«*f

Mi

majeure

liaison eu RN^

P10 myrislyiée

pr 72

^ ipSt ^

titre mcmbreAeirt

■ IP30

trenscnptâse inverse endonucl^ete

(662 ee)

LOR

9 KB 3‘

O

tranemembreneire

Fig. I. 3. Représentation schématique de la structure génomique du BLV et produits

de traduction des gènes viraux, (d'après Portetelle, 1990)

1. 2. a- Structure dtt BLV: (fig. I. 2)

La particule virale BLV, une sphère de lOOnm de diamètre, est constituée d'une nucléocapside entourée d'une bicouche lipidique d'origine cellulaire. Des glycoprotéines codées par le virus sont ancrées dans la bicouche lipidique formant l'enveloppe virale. La nucléocapside est formée de deux molécules d'ARN identiques auxquelles sont liées la transcriptase inverse et la protéine de structure pl2. Ce complexe ribonucléoprotéique est entouré d'une capside constituée de la protéine majeure du virion p24 et de la protéine de matrice pl5 qui assure la liaison entre la capside et l'enveloppe virale.

/■ 2. h- Organisation génomique du BLV: (ftg. I. 3)

Le génome du provirus BLV comporte les gènes structuraux classiques des rétrovirus (gag, pol, env) bordés de séquences redondantes appelées LTR (Long Terminal Repeat). Les LTR, composés de trois régions U3-R-U5, sont impliqués dans l'initiation et la régulation de l'expression virale.

Outre les trois gènes caractéristiques des rétrovirus, le provirus BLV contient une région supplémentaire appelée "X" située entre le gène "env" et le LTR 3'. Cette séquence est formée de plusieurs cadres de lecture superposés (Mamoun et al., 1985, Sagata et al., 1985, Rice et al., 1987a, Alexandersen et al., 1993). Elle code pour des protéines impliquées dans la régulation de l'expression virale.

7. 2 c- les protéines codées par le BLV:

1- les protéines structurales:

- Le gène "gag" code pour une polyprotéine de 44kDa, qui après clivage, génère les protéines de structure de la particule virale:

- la protéine p24 (24 kDa) est le constituant majeur du virion.

- la protéine pl5 (15 kDa) est la protéine de matrice. Elle est myristillée et correspond à ' l'extrémité NH2-terminale de la polyprotéine gag.

- la protéine pl2 (12 kDa) est une protéine basique fortement liée à l'ARN viral.

- Une phase ouverte de lecture appelée “prot”, couvrant la partie 3’ du gène gag et la partie 5’

du gène pol, code pour une aspartylprotéase de 14 kDa, la protéine pl4.

- Le gène "pol" code pour la transcriptase inverse (ADN polymérase-ARN dépendante) et pour l'intégrase.

Les parties codantes gag, prot et pol se trouvent dans trois phases de lecture différentes.

- Le gène "env" code pour une protéine glycosylée de 72 kDa (gp72). Après clivage par des enzymes cellulaires, la gp72 génère les deux glycoprotéines de l'enveloppe virale:

- la gp51 (51 kDa) est une protéine de surface fortement glycosylée impliquée dans la reconnaissance du récepteur cellulaire.

- la gp30 (30kDa) est transmembranaire. Elle est liée à la gp51 de manière non covalente et assure l'ancrage du complexe gp51-gp30 dans l'enveloppe virale. Par son extrémité NH2-terminale très hydrophobe, appelée peptide de fusion, la gp30 joue un rôle important dans la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire.

2- Les protéines de régulation:

Elles sont codées par des phases de lecture superposées, formant la région X située entre le gène "env" et le LTR 3'.

- La phase "LOR" (Long Open Reading ffame) code pour une protéine de 34 kDa à localisation nucléaire: la p34. Cette protéine communément appelée tat (Trans Acting Transcriptional activator) ou tax (Trans Activator derived ffom the X région), augmente le niveau d'expression des gènes viraux (Willems et al., 1987, Derse, 1987) via des séquences présentes dans le LTR (Derse et Casey, 1986).

- La phase "SOR" (Short Open Reading frame) code pour une phosphoprotéine de 18 kDa, également à localisation nucléaire, appelée rex (Regulating Expression factor derived ffom the X région). Cette protéine intervient dans la régulation post-transcriptionnelle et dans l'épissage des ARNs messagers viraux (Derse et al., 1988).

- La région X code également pour deux autres protéines, R3 et G4, qui sont essentielles à la propagation du virus (Alexandersen et al., 1993, Willems et al., 1994). La protéine G4 peut transactiver le LTR du BLV. Elle pourrait agir sur la régulation des gènes viraux et/ou

4

cellulaires et être impliquée dans le déclenchement de la lymphocytose (Alexandersen et al., 1993) . Le rôle de la protéine R3 est encore méconnu, elle pourrait cependant agir comme répresseur de l’action de la protéine rex (Alexandersen et al., 1993).

I. 2. d. La pathologie induite par le BLV

Le BLV est l'agent étiologique de la leucose bovine. C'est la maladie néoplasique la plus fréquente de l'espèce bovine. Elle est caractérisée par une absence de virémie et par une latence de plusieurs années. En effet, dans la plupart des cas, le BLV peut persister indéfiniment sous forme de provirus intégré dans le génome cellulaire des animaux infectés; le seul signe de l'infection étant la présence d'anticorps dirigés contre les protéines virales. Cet état latent du provirus n'est pas dû à une altération de sa structure. En effet, un provirus provenant d'une tumeur de mouton n'exprimant pas d'antigènes viraux est capable, après clonage et transfection dans des fibroblastes, d'exprimer les protéines gp51, p24 et tax (Van Den Broeke et al., 1988).

Des facteurs présents dans le plasma des animaux infectés seraient responsables du blocage de la transcription du provirus et de son état latent (Gupta et al., 1982, 1984). Suite à l'infection par le BLV, certains animaux (10 à 30%) développent une phase de lymphocytose persistante caractérisée par une augmentation du nombre de lymphocytes B circulants. Une forte proportion de ces lymphocytes sont porteurs du provirus BLV intégré dans divers sites non préférentiels de leur génome (Kettmann et al., 1980). La présence du provirus est corrélée à la présence du marqueur CD5 à la surface des lymphocytes (Depelchin et al., 1989). La phase tumorale apparaît seulement chez un faible pourcentage de bovins atteints (moins de 10%). Par contre, chez le mouton, le BLV induit des tumeurs chez tous les animaux infectés (Mammerickx et al 1976). Les tumeurs sont toujours issues d'une cellule lymphoïde B (revue par Bumy et al., 1988). Les cellules tumorales possèdent au moins une copie du provirus BLV complète ou délétée mais jamais dans la région X (revue de Bumy et al., 1988, Kettmann et al.,

1994) . L'expression du provirus BLV n'est pas nécessaire au maintien de l'état tumoral (Van Den Broeke et al., 1988).

Le BLV induit une forte réponse immunitaire caractérisée par un taux élevé d'anticorps

dirigés principalement contre la glycoprotéine d'enveloppe gp51 et la protéine interne majeure.

la p24 (Miller et Oison 1972, Miller et Van Der Maaten 1977). Malgré leur titre élevé, leur activité cytolytique vis-à-vis des cellules productrices de BLV (Portetelle et al., 1978) et leur pouvoir neutralisant in vitro (inhibition de la formation de syncytia et de la lyse cellulaire induite par des particules virales hybrides VSV/BLV) (Bruck et al., 1982a, b), les anticorps anti-BLV ne peuvent empêcher la progression de la maladie et l'apparition éventuelle de tumeurs (Portetelle, 1990).

I. 3- Mécanisme de l'infection virale:

Comme pour tout autre rétrovirus, le cycle du BLV débute par la liaison du virus à la surface de la cellule cible. La fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire permet ensuite au virus d'injecter son ARN génomique dans le cytoplasme de la cellule infectée.

/■ 3. a- La liaison virus-cellule:

Elle est assurée par une interaction spécifique entre le récepteur cellulaire et la glycoprotéine de surface gp51. Le récepteur du BLV n'a pas été clairement identifié, cependant, il pourrait s'agir d'une protéine membranaire de 849 aa (94 kDa) formée d'une séquence signal, d'un domaine extramembranaire contenant la région de liaison de la gp51, d'une séquence transmembranaire et d'un domaine intracytoplasmique (Ban et al., 1993). Cette protéine semble être hautement conservée chez les différentes espèces de mammifères (Ban et al., 1993). Différents arguments ont permis de la considérer comme le récepteur potentiel du BLV (Ban et al., 1993, 1994):

- Elle est capable de lier spécifiquement la gp51.

- La transfection du plasmide exprimant le récepteur dans des cellules résistantes au BLV (NIH3T3 ou Hep-2) les rend sensibles à l'infection par le virus. Cette infection est inhibée de manière spécifique par des anticorps dirigés contre la gp51.

6

B

Fig. I. 4. Mécanisme d'entrée des virus enveloppés dans les cellules cibles.

A: entrée du virus par fusion directe avec la membrane plasmique, (a) liaison du virus à son récepteur cellulaire, (b) fusion des membranes virale et cellulaire et libération de la nucléocapside dans le cytoplasme.

B Entrée du virus par endocytose, (1) liaison du virus à son récepteur, (2) formation

du "coated pit", (3) formation de la "coated vesicle", (4) fusion de la "coated vesicle

avec un endosome. Le pH acide de l'endosome entraine la fusion de l'enveloppe virale

avec la membrane de l'endosome et la libération de la capside dans le cytoplasme,

(d’après Hoekstra, 1990)

1. 3. b- La fusion virus-cellule:

Après fixation à son récepteur cellulaire, le virus fusionne avec la cellule infectée permettant ainsi l'injection de son matériel génétique dans le cytoplasme. On distingue deux mécanismes de fusion virus-cellule: la fusion dépendante du pH qui se déroule dans les endosomes et la fusion indépendante du pH qui a lieu à la surface de la membrane cellulaire.

1- La fusion membranaire dépendante du pH: fFig. I. 4^)

Les orthomyxovirus, les alphavirus, les bunyavirus et les rhabdovirus requièrent un pH acide, compris entre 5 et 6.5, pour fusionner avec la cellule cible.

Après l'adsorption du virus, la membrane cellulaire s'invagine et le virus se retrouve dans une structure caractéristique dite "coated pit". Cette vésicule, couverte de molécules de clathrine, se détache de la membrane plasmique en entourant complètement le virus qui se retrouve ainsi dans une "coated vesicle". Celle-ci achemine le virus à l'intérieur de la cellule, perd son manteau protéique et fusionne avec un endosome cellulaire. Le pH acide de l'endosome provoque des changements de conformation des glycoprotéines de l'enveloppe virale démasquant ainsi une région hydrophobe de la protéine, dite peptide de fusion, qui induit la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane endosomiale et la libération du matériel génétique du virus dans le cytoplasme cellulaire (revue de White et al., 1983, Marsh et Helenius, 1989). L'addition de bases faibles (NH4CI, chloroquine, amantadine) ou l'utilisation d'ionophores carboxyliques (nigéricine) qui neutralisent l'acidité endosomiale, inhibe complètement l'activité fusogène de ces virus (Marsh et Helenius, 1989, White, 1990). Ce mécanisme de fusion, dépendant du pH, a été bien décrit dans le cas de nombreux virus dont le VSV, le SFV et du virus de l'influenza ( White et al., 1983, 1990, Stegmann et al., 1989).

L'hémagglutinine HA du virus de l'influenza est la glycoprotéine membranaire la mieux caractérisée. Elle est synthétisée sous forme d'un précurseur HAO. Les monomères de HAO s'assemblent en trimères puis sont transportés à la surface cellulaire et clivés en deux glycoprotéines HAÏ et HA2 reliées par des ponts disulfures (Stegmann et al., 1989). La tête globulaire du trimère est essentiellement formée de molécules de HAÏ (fig. I. 5); elle assure la liaison du virus à son récepteur. La sous-unité HA2 forme la tige du trimère. Son extrémité

7

Fig. I. 5. Représentation de la protéine PiA du virus de l'influenza (Hoekstra, 1990).

(A) A pH neutre, l'extrémité NH2-terminale de HA2 est enfouie dans la structure trimérique de HA.

(B) En milieu acide, la structure s'ouvre en exposant la région hydrophobe de HA

Fig. I. 6. Représentation schématique de la structure de la protéine HA2 du virus de l'influenza (Carr et Kim 1993).

(A) A pH neutre, la protéine HA2 est structurée en une longue hélice a liée par une structure en boucle à une autre hélice plus courte qui se termine par le peptide de fusion.

(B) En milieu acide, la région en boucle de HA2 se structure en une hélice a projettant

NH2-terminale ou peptide de fusion, très hydrophobe, permet la fusion du virus avec la membrane cible. A pH neutre, le peptide de fusion se trouve enfermé dans la structure trimérique de HAÏ (Hoekstra, 1990). Comme mentionné précédemment, le virus de l'influenza pénètre dans la cellule par endocytose. Le pH acide de l'endosome cellulaire entraîne la dissociation du trimère HAÏ exposant ainsi le peptide de fusion qui peut alors interagir avec la membrane cible et induire la fusion (Fig. I. 5) (Stegmann et al., 1989, Hoekstra, 1990).

Récemment, Carr et Kim (1993) ont proposé un modèle décrivant l'organisation des molécules de HA2, qui forment la tige des trimères HA, à pH neutre et à pH acide (Fig. I. 6). Ce modèle a été confirmé par la détermination de la structure cristallographique de HA2 à pH acide (Bullough et al., 1994).

Ainsi, dans leur structure native, à pH neutre, les trimères de HA2 sont agencés en une tige hélicoïdale en forme d'épingle à cheveux. Chaque molécule de HA2 comporte une longue hélice a liée, par une structure formant une boucle, à une autre hélice a plus courte qui se termine par le peptide de fusion. (Fig. I. 6A). A pH acide, la boucle entre les deux hélices se structure également en une hélice a projetant ainsi les peptides de fusion au sommet de la protéine HA où ils peuvent interagir avec la membrane cible (Fig. 1. 6B).

2- La fusion membranaire indépendante du pH:

Les paramyxovirus, le virus de l'herpès et les coronavirus sont caractérisés par une activité flisogène indépendante du pH (revue de White et al., 1983, White, 1990). Les rétrovirus tels que le BLV (Guillemain et al., 1978, Graves et al., 1981, Ferrer et al., 1981), HTLV-I (Hoshido et al., 1983), HIV (Stein et al., 1987, McClure et al., 1988) ou RSV (Gilbert et al., 1990) fusionnent avec leurs cellules cibles également de manière indépendante du pH. Diverses études suggèrent que ces virus pénètrent dans la cellule cible par fusion directe avec la membrane plasmique plutôt que par endocytose. En effet, l'augmentation du pH endosomial ne bloque pas l'infection des cellules par BLV ou HIV et n'inhibe pas la formation des syncytia (Graves et al., 1981, Ferrer et al., 1981, McClure et al., 1988, Stein et al., 1987). Cependant, dans le cas du HIV, Pauza (1988) et Gelderblom (1991) ont pu mettre en évidence, par microscopie électronique, la présence de particules virales dans des vésicules d'endocytose. Ils

8

ont également observé la fiision de l'enveloppe virale avec la membrane endosomiale ce qui suggère que HIV, qui pénètre normalement dans la cellule par fusion directe de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire, peut également entrer par la voie de l'endocytose.

Les changements de conformation des glycoprotéines virales requis pour déclencher la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire seraient induits par l'adsorption du virus à son récepteur (White et al., 1983, White, 1990).

En plus de la fusion virus-cellule, ces virus peuvent également induire la fusion de cellules infectées exprimant à leur surface les glycoprotéines d'enveloppe virale avec des cellules cibles non infectées conduisant ainsi à la formation de syncytia. Ce mode d'infection permet au virus d'être transmis d'une cellule à l'autre sans relargage dans le milieu extracellulaire. La formation de syncytia "in vivo" a été largement décrite pour le HIV et le SIV (McClure et al., 1988). La plupart des organes de singes infectés par le SIV contiennent de nombreuses cellules multinucléées (Li et al., 1991). Cependant, jusqu'à présent, aucun lien direct n'a pu être établi entre la formation de syncytia et les effets cytopathogènes du virus.

3- Facteurs influençant la fusion membranaire:

Les virus enveloppés pénètrent dans la cellule cible en induisant la fusion de leur

enveloppe avec la membrane cellulaire. Cette étape de fusion peut être influencée par différents

facteurs tels que la présence de corécepteur(s), la température, le pH ou la composition

lipidique des membranes. Dans le cas du virus HIV, il a été montré récemment que, en plus du

récepteur CD4, l'infection des cellules par le HIV nécessite la présence de corécepteurs appelés

fusine (pour la souche de HIV adapté aux cellules T) ou CC-CKR5 (pour la souche adapté aux

macrophages). Des cellules NIH3T3 transfectées par le gène du CD4 seul ne sont pas

infectables par le HIV alors que la cotransfection de ces cellules par le gène du CD4 et le gène

codant pour la fusine ou le CC-CKR5 les rend permissives à l'infection (Feng et al., 1996,

Alkhatib et al., 1996, Deng et al., 1996, Dragic et al., 1996). Ceci a été vérifié sur différentes

lignées cellulaires connues pour être non infectables par le HIV. Ces résultats montrent que, en

plus du CD4, la présence de corécepteurs telsque la fusine ou CC-CKR5 joue un rôle

déterminant dans le tropisme et la fusion HIV-cellule hôte.

Fig. L 7. Représentation schématique du processus de fusion membranaire.

A Rapprochement des membranes. .

B; Formation de structures lipidiques non lamellaires (phases hexagonales ou micelles inverses).

C; Formation d'une nouvelle bicouche stable.

(d’après Verkleij, 1984)

Les réactions de fusion induites par la plupart des virus dépendent de la température et sont généralement maximales aux alentours de 37°C (White, 1990).

Le pH peut également être un facteur limitant de la fusion virus-cellule surtout dans le cas de virus tels que l'influenza, le VSV ou le SFV qui pénètrent dans la cellule cible par endocytose (revue de White et al., 1983, White, 1990, voir chapitre I. 3. 2 La fusion virus-cellule).

La composition lipidique des membranes joue également un rôle important dans la fusion. L'utilisation de liposomes, dont la composition peut-être facilement contrôlée, comme modèles membranaires a pu rendre compte de ce phénomène. Ainsi, l'étude de la fusion virus- liposomes a permis de mettre en évidence l'importance du cholestérol dans le mécanisme d'infection par le SFV (White et al., 1983, Stegmann et al., 1989), le virus de Sendai (Citovsky et al., 1988), et le VSV (Hermann et al., 1990).

La présence de lipides insaturés comme la phosphatidyléthanolamine (PE) dans la bicouche lipidique favorise la formation de structure lipidiques transitoires (phases hexagonales ou micelles inverses). La formation de ces structures a été mise en évidence par microscopie électronique lors de la fusion de liposomes contenant la protéine HA du virus de l'influenza avec des cellules (Knoll et al., 1988). L'existence de telles structures n'a jamais été démontrée in vivo. Cependant, la présence, dans les membranes biologiques, de lipides (notamment la PE et la cardiolipine) susceptibles de former des micelles inverses et/ou des phases hexagonales laisse supposer que de telles structures peuvent également se former in vivo. Les différents résultats obtenus sur modèles de membranes et sur cellules ont permis de proposer un modèle selon lequel le processus de fusion se déroulerait en trois étapes:

- les membranes se rapprochent et adhèrent entre elles.

- des structures lipidiques non lamellaires et transitoires se forment au niveau du site de contact des membranes en cours de fusion.

- un réarrangement moléculaire permet la formation d'une nouvelle bicouche stable avec ou

sans mélange des compartiments aqueux (fig. I. 7)

CLIVAGE

gp72

N RVRR

33

SIGNAL PEPTIDE

gp51

515 TRANSMEMBRANEOUS

Fig. I. 8. Représentation schématique des glycoprotéines d'enveloppe du BLV. La

gp72, produit du gène "env", est clivé en deux sous-unités; gp51 et gp30. Les régions

hydrophobes sont représentées en noir et les régions hydrophiles en blanc.

I. 4- Etude des £lvcoprotéines d'enveloppe du BLV:

L'activité ftisogène du BLV, comme celle des autres virus enveloppés est déterminée par ses glycoprotéines d'enveloppe. Celles-ci sont synthétisées sous la forme d'un précurseur glycosylé de 72 kDa (gp72) clivé par des protéases cellulaires au niveau d'un site riche en résidus arginine. La glycosylation de la gp72 semble être essentielle au clivage. En effet, la forme non glycosylée du précurseur, obtenue par traitement des cellules à la tunicamycine, n'est pas clivable (Portetelle et al., 1990). Le clivage de la gp72 génère deux sous-unités: la gp30, une protéine transmembranaire de 30kDa et la gp51, une protéine de surface de SllcDa (Fig. I. 8). L'étude d'un recombinant vaccine exprimant le gène d'enveloppe du BLV muté au niveau du site de clivage montre que quand elles ne sont pas maturées, les glycoprotéines de l'enveloppe du BLV sont incapables d'induire la fusion (Vonèche et al., 1992a). Ceci souligne l'importance du clivage de la gp72 dans l'acquisition du caractère fiasogène par le virus.

La comparaison des séquences en acides aminés des glycoprotéines d'enveloppe de six variants du BLV montre une très faible variabilité. Sur les 515 acides aminés de la gp72, seuls 14 sont modifiés (Portetelle et al., 1989, Mamoun et al., 1990). Cette faible variabilité est également observée dans le système HTLV-I (Ratner et al., 1991, Picque et al., 1990, 1992).

Ceci suggère qu'une forte pression de sélection est exercée sur les glycoprotéines d'enveloppe de ces virus pour conserver leurs propriétés biologiques et structurales (Picque et al., 1990).

Une faible fréquence de réplication pourrait également être à l'origine de cette variabilité restreinte.

7. 4. a- La glycoprotéine gp30:

La gp30 est la sous-unité transmembranaire du complexe glycoprotéique de l'enveloppe

du BLV. Par sa partie C-terminale, la gp30 interagit avec la protéine pl5 assurant ainsi la

liaison entre la capside et l'enveloppe virale (revue de Bumy et al., 1980). La séquence de la

gp30 renferme deux segments hydrophobes. Le premier, d'une vingtaine d'acides aminés, est

Influcnza HA "

Scndai

F FZ ^Fl

HIV >1 ~1 ^ ■

env |?l^)

RSV .1 1 1

env

Fig. I. 9. Représentation des glycoprotéines d'enveloppe des virus de l'influenza, du

Sendai, HIV et RSV (d'après White et al. 1993). Les domaines transmembranaires sont

représentés en noir, et les peptides de fusion en hachuré.

situé près de l'extrémité C-terminale de la protéine. Il est riche en acides aminés apolaires (Ala, Ile, Leu, Phe) et contient quelques acides aminés polaires non chargés (Ser, Cys). Il présente toutes les caractéristiques d'un segment transmembranaire. Par analogie à la gp41 du HIV (Kowalski et al., 1987, Gabuzda et al., 1991) cette région de la gp30 pourrait être le point d'ancrage du complexe gp51-gp30 dans l'enveloppe virale.

La deuxième région hydrophobe de la gp30, constituée de 25 aa, est située à l'extrémité NH2-terminale de la protéine et correspond au peptide de fiision du BLV. Elle débute juste après le site de clivage et est impliquée dans le processus de fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire. Une séquence similaire a été identifiée dans la protéine de fusion de la plupart des virus enveloppés notamment dans les hémagglutinines des orthomyxovirus, les protéines F des paramyxovirus et les glycoprotéines de nombreux rétrovirus (White et al.,

1990).

Des mutations réalisées sur l'extrémité NH2-terminale de la gp30 du BLV (Vonèche et al., 1992a), de la gp41 du HIV (Kowalski et al., 1987, Felser et al., 1989, Freed et al., 1990), de la gp32 du SIV (Bosch et al., 1989) ou de l'hémagglutinine HA de l'influenza (Gething et al., 1986) altèrent les propriétés fusogènes de ces virus, ce qui montre l'importance de cette région pour la fusion. Des études physico-chimiques ont également confirmé le rôle joué par cette partie de la protéine dans la fusion membranaire. En effet, des peptides synthétiques correspondant à l'extrémité NH2-terminale de l'hémagglutinine de l'influenza (Lear et DeGrado, 1987, Wharton et al., 1988), de la gp41 du HIV (Rafalski et al., 1990, Martin et al., 1993, 1996) de la gp32 du SIV (Martin et al., 1991) et de la gp30 du BLV (Zarkik, 1991) sont capables de déstabiliser la membrane lipidique et d'induire la fusion entre liposomes.

Il est à remarquer que ces peptides ne sont pas toujours localisés à l'extrémité N-terminale de la protéine de fusion. Chez le RSV, le SFV ou le Sindbis, le peptide de fusion est interne à la protéine (Fig. I. 9) (White, 1990).

L'analyse conformationnelle des peptides de fusion de nombreux virus (NDV, HIV,

RSV, BLV, SIV...) suggère qu'ils sont organisés en une structure hélicoïdale amphipatique

s'insérant obliquement dans la membrane lipidique (Brasseur, 1991). Cette orientation résulte

de la distribution asymétrique des acides aminés hydrophobes et hydrophiles le long de l'axe de

VACciniâ Recombir.«nt

Cxpressed 8LV Glycoproceins

R/nlno Acid Sequence

Pusogenic peptide Viral Predicted Origin Orientation

Angle of Insertion

Fusogenic capacity*

Fusion inhibition**

Hydrophob^city Hean

wvldtyp«

v4ccinia

V1 vus 0\ ^_

ENV gp51-gp30 SPVAALTLGLAL BLV oblique 60° 100\ 27 7.73

VP391 gpSl - - - - 0% - -

VP462 gp72 - - - - 10% 81 “

HUO gps 1-gp30 SPVAALTLGRDR BLV perpendicular 87* 17% 81 0. 38

MUl gpSl-gp30 tPVLALTLGLAL BLV parailel 4* 15% 27 9.48

HU2 gpSl'gp30 tPVAtLTLCLAL BLV obiIque 31* 23% 81 9.48

HU3 gpSl*gp30 SPVJ^LSLGLAL BLV perpendicular CD • _16% 27 8.08

MU4 gpSl~gp30 SPVAÎ^L2LCLAL BLV oblique 68* 86% 27 8.08

MUS gpSl~gp30 cvFVLorLorui SIV oblique S3» 100% 81 11.15

Tableau 1. Relation entre la capacité des glycoprotéines d'enveloppe du BLV à induire la formation de syncytia et la séquence en acides aminés, l'orientation théorique et l'angle d'insertion du peptide de fusion dans la bicouche lipidique.

(d’après Vonèche et al., 1992a)

Fig. I. 10. A: Orientation relative du peptide de fusion du BLV (sauvage (ENV) ou muté (MuO et Mul)) à l'interface lipide-eau.

Mul: orientation parai èlle; ENV:

orientation oblique; MuO orientation perpendiculaire.

B: Représentation schématique de la distribution asymétrique des acides aminés hydrophiles et hydrophobes dans le peptide de fusion de la gp30 du BLV, à l'interface lipide-eau. La partie hachurée correspond aux régions hydrophobes et la partie non hachurée, aux régions hydrophiles.

(d’après Vonèche et al., 1992a)

l'hélice (Brasseur et al., 1990). Cette distribution asymétrique a été confirmée expérimentalement pour le peptide de fusion du virus de l'influenza (Harter et al., 1989). Des expériences de photolabelling utilisant un marqueur hydrophobe photoactivable ont fait apparaître une périodicité dans le marquage du peptide de fusion caractéristique d'une hélice amphipatique: un acide aminé sur trois est marqué (Harter et al., 1989). L'orientation oblique des peptides pourrait perturber l'organisation des lipides, en modifiant le parallélisme des chaînes acylées, et constituer ainsi une des étapes initiales de la fusion membranaire. Dans le cas du BLV, Vonèche et al., (1992a) ont confirmé l'importance de l'orientation du peptide fùsogène pour la fusion. Des mutations qui induisent des changements d'orientation du peptide (orientation horizontale ou verticale) diminuent considérablement son pouvoir fùsogène (Tableau 1, fig. I. 10).

/■ 4. b- La glycoprotéine gp5J:

La gp51 est le composant externe du complexe glycoprotéique du BLV. Elle est liée à la gp30 de manière non covalente, ce qui la rend extrêmement labile. La gp51 est impliquée dans la reconnaissance du récepteur cellulaire. En effet, une protéine de 94 IcDa, dont l'expression rend permissives au BLV des cellules qui normalement ne le sont pas, est capable de lier spécifiquement la gp51 (Ban et al., 1993).

Plusieurs travaux ont mis en évidence l'importance de la gp51 dans l'induction de la réponse immunitaire chez les animaux infectés par le BLV. La gp51 est le premier antigène viral à induire une réponse immunitaire. Des anticorps dirigés contre la gp51 apparaissent 2 à 5 semaines après l'infection bien avant ceux dirigés contre la protéine majeure du virus, la p24 (Bex et al., 1979, Mammerickx et al., 1980). In vitro, ces anticorps neutralisent l'infection des cellules par des particules virales hybrides contenant le génome du VSV et les glycoprotéines d'enveloppe du BLV. Ils sont également capables d'inhiber la formation de syncytia induite par les glycoprotéines du BLV (Portetelle et al., 1978, Burny et al., 1980, Mammerickx et al.,

1980).

Huit sites antigéniques différents(A, B, C, D, E, F, G, et H) (fig. I.l 1) ont été identifiés

sur la gp51 (Bruck et al 1982a). Les épitopes A, B, D et E sont séquentiels. La réactivité des

gp51

50 100 150 200 250

NI^[ I

268 CO

H E A B D

Fig. I. 11. Schéma représentant la localisation des sites antigéniques A, B D E F G

etHsurlagp51. > . > -

GLUi9 lys ser ser asp-7

\/\/\/\/^

ALA LEU LEU LEU

/\/\/\/\

YALj ALA THR CLY ALA||

(B)

Qîl

PHQ PHT

19-Î7 scfment

PHQ

fusioa pcpcidc

PffT

Fig. 1. 12. Représentation des deux modes d'interactions possibles entre le segment

peptidique aa 19-17 de gp51 et le peptide de fusion. PHI; face hydrophile; PHO; face

hydrophobe, (d’après Vonèche et al., 1992b)

anticorps dirigés contre les épitopes F, G et H dépend de la glycosylation et de la conformation de la gp51 indiquant que ces épitopes sont de type conformationnel (Bruck et al., 1984, Portetelle et al., 1989, 1990). De plus, les activités biologiques des anticorps anti-gp51 sont toujours associées aux épitopes F, G et H (Bruck et al 1982a, b). Ces trois sites antigéniques sont situés dans la partie NH2-terminale de la gp51 caractérisée par un contenu élevé en résidus cystéine (Portetelle et al., 1990). Ces résidus pourraient imposer localement des contraintes de structure et contribuer à la conformation des sites F, G et H.

Bruck et al., (1984), Portetelle et al., (1989), Mamoun et al., (1990) ont mis en évidence des variants naturels du BLV qui différent entre eux par la réactivité de la gp51 vis-à- vis des anticorps dirigés contre les sites F, G, ou H. La perte de l'un ou l'autre de ces épitopes a été observée chez ces isolats. Cependant, aucun variant BLV ayant perdu les trois épitopes à la fois n'a pu être identifié jusqu'à présent. Ceci suggère que la perte simultanée des épitopes F, G, et H s’accompagne d'une perte d'infectivité.

L'utilisation de peptides synthétiques couvrant 78% de la séquence de la gp51 a permis la localisation exacte de certains épitopes séquentiels. Ainsi, l'épitope A a été localisé entre les aa 195-205, B entre les aa 181 et 237, D entre les aa 249-260 et E entre les aa 142-161 (Callebaut et al., 1991, Ban et al., 1992, revue de Kettmann et al., 1994). La localisation exacte des sites F, G et H n'est pas encore connue. Cependant, l'étude de certains variants du BLV caractérisés par des phénotypes F’, G’ ou H' permet de localiser le site F aux alentours de l'aa 62, le site G contiendrait les aa 40, 41 et 88 alors que le site H contiendrait l'aa 111 et/ou les aa 23 et 25 (Portetelle et al., 1989, Mamoun et al., 1990). Il est intéressant de noter que le segment peptidique situé entre l'aa 19 et 27 de la gp51, contenant éventuellement le site H, pourrait interagir avec le peptide de fusion de la gp30 et être ainsi impliqué dans la fusion.

En effet, par leur structure en brin (3 amphipatique, ces deux peptides pourraient interagir via

leurs faces hydrophobes et/ou hydrophiles (fig. I. 12). Des mutations qui modifient

l'hydrophobicité et le caractère amphipatique de la région 19-27 (remplacement de Phe22 par

His, Ileu24 par Gin et Ile26 par Gin) altèrent le pouvoir fusogène des glycoprotéines virales

(Vonèche et al., 1992b). Cependant, il est probable que ces mutations affectent la liaison de la

gp51 à son récepteur et non pas le processus de fusion lui-même.

A

Fig. I. 13. Représentation schématique de la structure tridimensionnelle du complexe

gp51/gp30 du BLV (B) et de l'hemagglutinine HA du virus de l'influenza (A). La

localisation présumée du site de reconnaissance du récepteur est indiquée par une

étoile. Les positions des sites antigéniques A B. D, E, F, G et H sont également

indiquées, (d’après Callebaut et al., 1994)

7. 4. c. Modélisation moléculaire des glycoprotéines d'enveloppe du BLV: (Callebaut et al.

1994). (Tig. I. 13)

La comparaison de la séquence des glycoprotéines d'enveloppe du BLV et de l'hémagglutinine HA du virus de l'influenza par la méthode HCA (Hydrophobie Cluster Analysis) fait apparaître des similitudes de structures entre les deux protéines. Par analogie à la structure tridimensionnelle de la protéine HA (Bullough et al., 1994), un modèle a été proposé pour l'organisation des glycoprotéines gp51/gp30 du BLV. Ainsi, le complexe gp51/gp30 serait organisé en trimère formant une "tige" surmontée d'une "tête" globulaire. La "tige" serait formée par la gp30 et les parties N et C-terminales de la gp51. La "tête" du trimère, contenant les résidus de la gp51 (aa 43-205), serait composée de deux parties: un large domaine globulaire (aa 91-205) et d'une charnière (aa 43-90) reliant la "tête" à la "tige" du trimère.

Selon ce modèle, la région de la gp51 susceptible d'interagir avec le récepteur serait située au

sommet de la tête globulaire. Il est intéressant de noter que des anticorps dirigés contre les

peptides 98-117 et 177-192, inclus dans cette partie de la gp51, inhibent la formation de

syncytia. Ces régions sont agencées en forme de boucle au sommet de la tête globulaire et

pourraient être impliquées dans la reconnaissance du récepteur. Les épitopes F et G se

situeraient au niveau de la "charnière" qui est riche en résidus cystéine et qui contient deux

sites potentiels de glycosylation (Asp218 et 233). Ces résidus pourraient déterminer la

conformation des sites F et G. Des anticorps dirigés contre cette partie du trimère sont

également capables d'inhiber la formation de syncytia. La position de l'épitope H demeure

incertaine et pourrait se situer soit au sommet de la tête globulaire (aa 98-117), près du site de

reconnaissance du récepteur soit au niveau de la tige (aa 19-27) à proximité du peptide de

fusion.

VIRUS Séquence précédant le site de ^

1 clivage

ARV lEYTAGRHKR AVQFIPLLVG

BLV SSAPPTRVRR S P VA A L T L

CMV RTKR STD

FPV SKKREKR G

FSV (GA) HFAKAARFRR EPISLTVALM

FSV (ST) HFDKTVRLRR EPISLTVALM

HCMV THNRTKR ST

HFV NNKRKRR S

HIV-1 (BHIO) KAKRRVVQREKR AVGIGALF

HIV-2 APTKEKR YS

HTLV -II (IZ) VPPPATRRRR A VPI A VWL V

HTLV-I VPTLGSRSRR AVPVAVWLV

HTLV-IV TTGGTSRNKR GVFVLGFLG

MCFFM FEKKK TKYKR PVSLTLALLL

MLVAV QFE RRAKYKR GPVSLTLALL

MLVKI RRARYKK E PVSLTLALLL

MLVMo FERSNRHKR EPVSLTLALL

MMTV NLIRAKR F V

MSV QFKRRAKYKR EPVSLTLALLL

MuLV RSNRHKR G

RSV TGIRRKR SV

Sendai (avirulent) TQNAGVPQSR FFGAVIGTI A

Sendai PF3 SNENTQPRTKR FFGAVIGTIA

Sendai SV5 RNQLIPTRRRRR FFGAVIGTIA

SIV TTGGTSRNKR GVFVLGFLG

VILV (1514) RRSRRNLQRKKR GIGLVIVLAI

4' RV ARRARR SS

Tableau 2. Comparaison des séquences du site de clivage protéolytique des glycoprotéines d’enveloppe virale. ARV: Avian Reticuloendotheliosis virus; BLV:

Bovine Leukemia Virus; CMV: CytoMegaloVirus; FPV: Fowl Plague Virus; FSV:

Feline Sarcoma Virus; HCMV: Human CytoMegaloVirus; HFV: Human Foamy Virus;

HIV: Human Immunodeficiency Virus; HTLV: Human T-Lymphotropic Virus;

MCFFM: Mink Cell Focus-Forming Murine Virus: MLVAV: AKV Murine Leukemia Virus; MLVKI: Murine Leukemia Virus Kirsten, MLVMo: Moloney Murine Leukemia Virus; MMTV: Mouse Mammary Tumor Virus; MSV: Murine Oesteosarcoma Virus;

MuLV: Murine Leukemia Virus; RSV: Rous Sarcoma Virus; SIV: Simian

Immunodeficiency Virus; VILV: Visna LentiVirus; TRV: Pseudo-Rabies virus.

I. 5. La maturation des £lvcoprotéines de l'enveloppe virale par clivaee endoprotéolytigue:

Les glycoprotéines d'enveloppe de nombreux virus sont synthétisées sous la forme d'un précurseur inactif qui est ensuite clivé par des endoprotéases cellulaires. Ceci permet la libération du peptide de fusion qui pourra par la suite interagir avec la membrane de la cellule cible et induire la fusion. De nombreux travaux ont montré que ce clivage protéolytique était essentiel à la fusion du virus avec la cellule cible et à l'initiation de l'infection (Revue par White et al., 1983, White, 1990). Des mutations introduites dans le site de clivage de la gpl60 du HIV, du SIV et de la gp72 du BLV ont confirmé le rôle essentiel du clivage dans le processus d'infection virale (Bosch et al., 1989, Horth et al., 1991, Kowalski et al., 1987, Vonèche et al., 1992a). Par mutagenèse dirigée, McCune et al., (1988) ont remplacé le site de clivage du HIV (Arg-Glu-Lys-Arg) par un site sensible à la chymotrypsine (Gly-Glu-Glu-Phe). La gpl60 ainsi mutée n'est pas clivée mais est acheminée correctement à la surface cellulaire et incorporée dans les particules virales nouvellement produites. Cependant, cette mutation bloque la formation de syncytia et les virus produits ne sont pas infectieux. Un traitement à la chymotrypsine permet le clivage de la gpl60 en gpl20 et gp41 et les virus retrouvent leur activité fùsogène et leur infectivité (McCune et al., 1988).

La comparaison de la séquence d'acides aminés précédant le site de clivage chez de

nombreux virus a montré que la plupart des glycoprotéines virales contiennent une séquence

consensus Arg-X-Lys/Arg-Arg (Tableau 2). Cette séquence est clivée, au niveau de l'arginine

(Arg) carboxy-terminale, par des protéases cellulaires ubiquitaires (revue de Barr, 1991,

Steiner et al., 1992). Cependant, dans certains cas, le site de clivage ne contient qu'un seul

résidu Arg. Par conséquent, le clivage ne peut se faire que via des enzymes très spécifiques

présentes dans un nombre restreint de lignées cellulaires (Barr, 1991). Dans le cas des

glycoprotéines d'enveloppe de souches avirulentes du virus de l'influenza et du NDV, la

séquence dibasique précédant le site de clivage est remplacée par une séquence monobasique

(Arg) (revue de Klenk et Rott, 1988). Ceci empêche la maturation de ces glycoprotéines dans

un grand nombre de cellules (Vey et al., 1992). Ainsi, ces souches virales n'infectent qu'un

Protéines 1 Séquence précédant le site de I

1 ^clivage

Précurseurs

<So typ«—1

Bngf Thr-His-Arg-Ser-Lys-Arg Ser-Ser

TGF-Pl Ser-Ser-Arg-His-Arg-Arg Ala-Leu

Facteur Von Willebraind Ser-His-Arg-Ser-Lys-Arg Ser-Leu Récepteur à l'insuline Pro-Ser-Lys-Arg-Arg-Arg Ser-Leu Pro-somatostatine-14 Ala-Pro-Arg-Glu-Lys-Arg Ala-Gly

Facteur X Leu-Glu-Xrg-Arg-Lys-Arg Ser-Val

7B2 Glu-Arg-Arg-Lys-Arg-Arg Ser-Val

PA de B. antracis Asn-Ser-Arg-Lys-Lys-Arg Ser-Thr Toxine Diphtérique Gly-Asn-Arg-Val-Arg-Arg Ser-Val Hemagglutinine (HA) Lys-Lys-Arg-glu-Lys-Arg Gly-Leu

gpl60 de HIV-1 Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg Ala-Val

Précurseurs

de tYT3e 2

POMC (JP/ACTH) Pro-Arg-Glu-Gly-Lys-Arg Ser-Tyr

POMC (ACTH/BLPH) Pro-Leu-Glu-Phe-Lys-Arg Glu-Leu

POMC (OMSH/CLP) Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg Arg-Pro

POMC (ylph/Bend) Pro-Pro-Lys-Asp-Lys-Arg Tyr-Gly Pro-Isuline (B/C) Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg Gly-Ile Pro-Isuline (C/A) Tyr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg Glu-Ala

Pro-PTH Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg Ser-Val

Pro-En)<ephaline 1 Gly-Gly-Phe-Met-Lys-Lys Asp-Ala Pro-En)cephaline 2 Met-Asp-Tyr-Gln-Lys-Arg Tyr-Gly Pro-En)cephaline 3 Gly-Gly-Phe-Leu-Lys-Arg Phe-Ala

Pro-Dynorphine Arg-Lys-Gln-Ala-Lys-Arg Tyr-Gly

Pro-Dynorphine Glu-Asp-Leu-Tyr-Lys-Arg Tyr-Gly

Pro-Dynorphine Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys-Arg Ser-Ser

Pro-Renine Ser-Gln-Met-Pro-Lys-Arg Leu-Thr

Pro-Albumine Arg-Gly-Val_-he-Arg-Arg Asp-Ala

Proteine C Arg-Ser-His-Leu-Lys-Arg Asp-Thr

Récepteur a-fibronectine His-His-Gln-Gln-Lys-Arg Glu-Ala

Précurseurs

de tvpe

Pro-Dynorphine Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val Thr-Arg Ser-Gln Pro-ANF Arg-Ala-Leu-Leu-Thr-Ala-Pro-Arg Ser-Leu Pro-Somatostatine (28) Glu-Met-Arg-Leu-Glu-Leu-Gln-Arg Ser-Ala

IGF-1 Leu-Lys-Pro-Tyr-Lys-Ala-Ala-Arg Ser-Ile

IGF-2 Ala-Tyr-Pro-Ala-Lys-Ser-Glu-Arg Asp-Val

EGF (N-terminal) Glu-Asp-Gly-His-Lys-Leu-Asp-Arg Asn-Ser EGF (C-Terminal) Asp-Leu-Arq-Trp-Trp-Glu-Leu-Arg His-Ala

Tableau 3. Sites de clivage endoprotéolytique de prohormones, de récepteurs et de

précurseurs de protéines plasmatiques.