L'infection par le BLV commence par la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane de la cellule hôte, suivie de la libération de la nucléocapside du virus dans le cytoplasme

cellulaire. L'utilisation de la technique du RI

nous a permis de suivre de manière directe et

continue l'étape de fusion. Par la méthode PCR, nous avons montré que cette fusion était

accompagnée par l'entrée de l'ARN viral dans la cellule.

La combinaison de ces deux techniques nous a permis de montrer que le marquage du

BLV au RI

(BLV-R18) n’altère pas les activités biologiques du virus. En effet, l’interaction

du BLV-R18 avec des cellules cibles se traduit par une fusion lente et progressive atteignant

15% (avec les cellules CC81) ou 12% (avec les cellules Raji) après 25 min d’incubation à 37°C

(cf article I, fig 1, courbes A et B). Cette fusion est accompagnée par le libération de l'ARN

viral dans la cellule. Par PCR, nous avons pu détecter l'ADN du BLV dans les cellules CC81

après 20 min d’incubation à 37°C (cf article I, fig 7).

L’anticorps polyclonal B67 (sérum de bovin infecté) inhibe l’adsorption du virus aux

cellules. En effet, seuls 3% du virus s’associent aux cellules en présence de cet anticorps (fig.

IV.

). De plus, l’anticorps B67 bloque complètement la fusion du BLV-R18 avec des cellules

CC81 ou Raji (cf article I fig. 3,4 courbes A). Le sérum de bovin non infecté (utilisé comme

control) n'affecte ni l'adsorption (fig. IV.

) ni la fusion (cf article i fig. 3,4 courbes B) du virus

avec les cellules Ceci montre clairement que l’augmentation de fluorescence que nous

observons lors de l’incubation du BLV-R18 avec des cellules est spécifique de la fusion.

Comme pour tous les virus enveloppés, la fusion du BLV avec la cellule cible est

médiée par ses glycoprotéines de surface. La sous-unité externe gp51 assure la reconnaissance

du récepteur cellulaire. La gp30 est transmembranaire et est impliquée, par son extrémité NH

-

terminale hydrophobe, dans le processus de fusion. L’importance de l’extrémité NH

-terminale

de la glycoprotéine transmembranaire dans la fusion a été mise en évidence pour de nombreux

virus (White et al., 1983, 1990). Cependant, des travaux réalisés sur la gpl20 du HIV ont

montré qu'en plus de la reconnaissance du CD4, la gpl20 est également impliquée dans la

fusion membranaire (Willey et al., 1988, Skinner et al., 1988, Kowalski et al., 1987).

Bruck et al., (1982a) ont défini trois épitopes conformationnels F, G et H situés à

l’extrémité NH

-terminale de la gp51. Ces épitopes semblent être importants pour l’infectivité

du virus ainsi que pour la formation de syncytia (Bruck et al., 1982a, 1982b, Portetelle et al.,

1989). Des anticorps monoclonaux (monoF, monoG, et monoH) dirigés contre ces épitopes

sont connus pour inhiber la formation de syncytia (50% d’inhibition pour monos F et G, 100%

pour monoH). Nous avons testé l’effet des anticorps monoF et monoG sur le processus de

fusion BLV-cellule cible. Nous avons ainsi montré que bien qu'ils soient dirigés contre la gp51,

les anticorps monoF et monoG n'affectent pas l'adsorption du virus sur les cellules. En effet, en

présence ou en absence de ces anticorps, le même pourcentage de virus s'associe aux cellules

CC81 ou Raji (fig. IV.

). Cependant, la présence de monoF ou de monoG entraîne une

diminution de la fusion du BLV avec les cellules, d’environ 60% (cf article I, fig 5,6 courbes B

et C). De plus, l’ADN viral n’a pu être détecté dans les cellules en présence de monoF ou

monoG (fig.

pistes

et 7). Ces résultats suggèrent qu’en présence de ces deux anticorps, une

faible quantité de virus arrive toujours à fusionner avec les cellules. La quantité d’ARN viral

qui entre dans les cellules dans ces conditions n’est probablement pas suffisante pour être

détectée par PCR. Ces résultats montrent que les anticorps monoF et monoG inhibent la fusion

membranaire induite par le BLV sans affecter la liaison du virus aux cellules. Ceci suggère que

la région de la gp51 contenant les sites F et G (aa 39-103) serait impliquée dans le processus

de fusion membranaire et non pas dans la reconnaissance du récepteur.

L’anticorps monoclonal monoH inhibe complètement la formation de syncytia (Bruck

et al., 1982a). Cependant, nos résultats montrent que le monoH n’a aucun effet sur la fusion

virus-cellules (cf article I, fig 5,6 courbes D). Ceci n'est pas dû à une inactivité de l'anticorps.

En effet, le monoH utilisé est capable d'inhiber la formation de syncytia. Par PCR, nous avons

pu détecter l’ADN viral dans les cellules CC81, même en présence de monoH (cf article fig.

piste

). Ceci suggère que, malgré son importance pour la formation de syncytia, l’épitope H

n’est pas essentiel à la fusion virus-cellule. La fusion cellule-cellule et la fusion virus-cellule

induites par le BLV seraient donc deux phénomènes différents.

fu

s

io

n

(%

)

v

ir

u

s

a

d

s

o

rb

é

{%

)

0|/g ApoAl le^/gApoAl 32>ug ApoAl 64/yg ApoAl 100/ugApoAI

Fig. IV. 7. Effet de l'ApoAl sur l'adsorption (A) et la fusion (B) du BLV-R18 avec

des cellules CC81. 13pg de BLV-R18 ont été incubés avec différentes concentrations

d'ApoAl (0, 16, 32, 64 ou lOOpM) pendant Ih à 4°C. 2 10® cellules CC81 ont ensuite

été ajoutées et incubées avec le virus à 4°C. Après Ih d'incubation, le complexe

virus/cellules a été transféré dans la cuve de fluorescence contenant du tampon hépès

préchauffé à 37°C. L'augmentation de fluorescence qui reflète la fusion BLy-

R18/CC81 est mesurée pendant 1200 secondes.

IV. 1. e: Effet de l’ApoAl sur la fusion du BLV-R18 avec les cellules CCS J:

Vonèche, (1991) a montré que l'apolipoprotéine Al, le constituant majeur des "high

density lipoproteins" caractérisé par une succession de

hélices amphipatiques, inhibait la

formation de syncytia induite par le BLV. Des résultats similaires ont été obtenus dans le cas

du HIV (Owens et al., 1990) et du virus de l'herpès (Srinivas et al., 1990). Cet effet inhibiteur

de l'ApoAl semble spécifique des virus enveloppés. Le mécanisme exact de cette inhibition

reste inconnu. Cependant, Martin et al., (1992b) ont montré que l'ApoAl inhibe la fusion de

vésicules lipidiques induite par les peptides de fusion du virus HIV et SIV en interagissant

directement avec ces peptides.

L’incubation du BLV-R18 avec l’ApoAl avant l’addition des cellules et la formation

du complexe virus-cellules à 4°C, entraîne une inhibition dose-dépendante de la fusion du

BLV-R18 avec les cellules CC81 (fig. IV. 7A). L’ApoAl n’interfère pas avec l’étape de la

reconnaissance du récepteur cellulaire. En effet, la même quantité de virus (13%) s'adsorbe sur

les cellules en présence ou en absence de l’ApoAl (fig. IV. 7B). L’addition de l’inhibiteur au

complexe virus-cellules, préformé à 4°C, ne modifie pas la cinétique de fusion. Ceci montre

que pour inhiber la fusion, l’ApoAl doit être présente au moment où le virus se fixe sur son

récepteur. La fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire nécessite un changement

de conformation des glycoprotéines virales qui entraîne la libération du peptide de fusion

(Stegmann et al., 1989, Hoekstra et al., 1990). Dans le cas des virus pH-indépendants, ce

changement de conformation se produirait suite à la liaison du virus à son récepteur cellulaire

(White et al., 1990). Rappelons par ailleurs que l’ApoAl interagit directement avec le peptide

de fusion du HIV et du SIV (Martin et al., 1992b).

Après la fixation de la gp51 sur le récepteur cellulaire, le changement de conformation