Université Libre de Bruxelles
Institut Scientifique de Santé Publique (ISP)
Direction opérationnelle : Maladies Infectieuses et Transmissibles
Laboratoire de Pathologie Moléculaire de la Tuberculose
Vanessa Mathys
Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques.
Promoteur : Pr. M. Struelens Co-promoteur : Dr. P. Bifani
Année académique 2009-2010
Contribution à la compréhension des mécanismes moléculaires de résistance
de Mycobacterium tuberculosis aux
agents anti-tuberculeux
Remerciements
La rédaction de ce manuscrit venant clore l’aventure que constitue une thèse, je tiens donc à exprimer mes sincères remerciements à tous ceux qui ont joué un rôle dans sa concrétisation.
Je tiens à remercier en premier lieu le Prof. Marc Struelens et le Dr. Pablo Bifani pour avoir accepté d’être, respectivement, promoteur et co-promoteur de cette thèse.
Un merci tout particulier à toi, Pablo, de m'avoir recueillie dans ton laboratoire il y a déjà quatre ans et pour m'avoir immédiatement accordé ta confiance. Bien plus qu'un directeur de thèse, tu as toujours été disponible et à l’écoute pour moi. J’ai appris qu’il est possible de faire les choses bien….et avec une touche d’humour en plus! Chercheur et pédagogue exemplaire, j'ai beaucoup appris à ton contact, tout en prenant un très grand plaisir à être ta thésarde.
Je remercie les professeurs Gilbert Vassart, Abdelmounaaïm Allaoui, Françoise Mascart, Olivier Vandenberg, Aliouat El Moukhtar et Alain Baulard, d’avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse.
Je remercie le Prof. Jean Content et le Dr. Maryse Fauville-Dufaux de m’avoir accueillie au sein de l’Institut Pasteur de Bruxelles ainsi que Michaël Kalaï pour ses conseils avisés.
Je tiens également à exprimer toute ma reconnaissance à Philippe Lefèvre pour la relecture de cette thèse, ses précieux conseils et ses remarques toujours intéressantes.
Merci également à René Wintjens et Alain Baulard, pour nos nombreuses et toujours fructueuses discussions. Travailler avec eux a été un réel plaisir!
Merci à Mehdi Kiass et Warda Boukhouchi, pour l’ambiance de travail très agréable qui règne dans notre équipe et pour avoir assuré la continuation des manipulations durant ma rédaction.
Merci à Amit Singhal de m’avoir fait partager son expérience acquise à l’étranger ainsi que pour son dévouement au sein du laboratoire.
Je n’oublie pas toutes les personnes qui m’ont entourée au quotidien. J’en profite pour souhaiter mes vœux aux « futurs docteurs » (Frédéric, Samira, Vanessa, Florence, Virginie, Geoffrey, Vijay,…) ainsi qu’aux autres membres de l’Institut Pasteur devenu depuis Institut Scientifique de Santé Publique.
Je salue en particulier, Samira Boarbi, avec qui j’ai partagé les mêmes joies et les mêmes angoisses inhérentes à la vie de thésard, mais également d'excellents moments de détente.
Merci également au Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS) pour m’avoir fourni les moyens financiers pour effectuer cette thèse.
Merci enfin à ma famille et à mes amis qui, de près comme de loin, m'ont encouragée aux moments opportuns. Un merci particulier à mes parents, pour avoir toujours cru en mes choix et à mon mari, Jonathan, pour son soutien et la relecture orthographique de cette thèse.
Un gros bisou à Maeva, mon bébé, pour avoir fait rapidement ses nuits et avoir ainsi permis à sa maman de travailler le soir sur cette thèse.
Merci à tous.
Table des matières
Remerciements ... 1
Table des matières ... 3
Composition du jury de thèse... 6
Liste des abréviations... 7
Résumé ... 9
Chapitre I : Introduction ... 13
1. Tuberculose et mycobactéries ... 13
1.1. Définition et classification ... 13
1.2. Caractéristiques de Mycobacterium tuberculosis... 15
1.3. Le génome de M. tuberculosis ... 15
2. Groupes génétiques des souches de M. tuberculosis... 18
2.1. Groupes génétiques principaux ... 19
2.2. Clusters génétiques... 20
2.3. Méthodes de génotypage de M. tuberculosis ... 21
2.4. Utilisation des groupes génétiques pour les études de population ... 22
3. Epidémiologie de la tuberculose ... 23
3.1. La tuberculose dans le monde ... 23
3.2. La tuberculose en Europe ... 24
3.3. La tuberculose en Belgique ... 25
4. Histoire de la tuberculose ... 27
4.1. Histoire de la maladie... 27
4.2. Histoire du traitement anti-tuberculeux... 30
4.3. Lutte contre la tuberculose ... 32
5. Histoire naturelle de l’infection tuberculeuse ... 34
5.1. Transmission et développement de la maladie... 34
5.2. Primo-infection... 34
5.3. Tuberculose active : pulmonaire et extra-pulmonaire... 35
5.3.1. Tuberculose pulmonaire ... 35
5.3.2. Tuberculose extra-pulmonaire... 35
6. Dépistage et diagnostic de la tuberculose ... 37
6.1. Dépistage de la tuberculose latente (primo-infection) ... 37
6.2. Diagnostic de la tuberculose active ... 38
6.3. Détermination de la sensibilité aux antibiotiques... 41
7. Traitement de la tuberculose ... 42
7.1. Traitement de la tuberculose latente... 42
7.2. Traitement de la tuberculose active... 43
8. La résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux : définitions et mécanismes généraux 47 8.1. Généralités sur la résistance aux antibiotiques... 47
8.1.1. Définition de la résistance bactérienne à un antibiotique... 47
8.1.2. Détermination de la sensibilité ou de la résistance d’une bactérie à un antibiotique... 47
8.2. Résistance de M. tuberculosis aux antibiotiques anti-tuberculeux ... 48
8.2.1. Résistance naturelle et résistance acquise ... 48
8.2.2. Résistances primaire et secondaire... 52
8.2.3. Sélection des mutants résistants ... 52
8.2.4. Fréquence des mutations conférant la résistance à un antibiotique... 53
8.2.5. Résistance multiple ... 54
8.2.6. Intérêt des mutations chromosomiques pour le dépistage des résistances ... 55
8.2.7. Coût biologique lié à l’acquisition d’une résistance à un antibiotique... 55
8.2.8. Différence entre résistance, tolérance et persistance... 56
9. Les antibiotiques anti-tuberculeux : classification, mécanisme d’action et de résistance ... 57
9.1. Médicaments anti-tuberculeux de « première ligne » ... 57
9.1.1. L’isoniazide ... 57
9.1.2. La rifampicine ... 62
9.1.3. La pyrazinamide ... 64
9.1.4. L’éthambutol ... 66
9.2. Médicaments anti-tuberculeux de « seconde ligne » et alternatifs... 69
9.2.1. L’acide para-aminosalicylique (PAS) ... 69
9.2.2. L’éthionamide ... 73
9.2.3. Le 5-fluorouracil (5-FU) ... 76
9.2.4. Molécules en développement, candidates pour le traitement de la tuberculose 79 Chapitre II : Objectifs de recherche... 82
Chapitre III : Matériel et Méthodes ... 85
1. Sélection de souches de M. tuberculosis ... 85
2. Manipulations in vitro ... 85
2.1. Culture de M. tuberculosis ... 85
2.2. Stockage des souches de M. tuberculosis... 86
2.3. Sélection de mutants devenus spontanément résistants à un antibiotique... 86
2.4. Inactivation des cultures et extraction d’ADN mycobactérien pour amplification par PCR ... 87
2.5. Isolement d’ADN génomique pour séquençage... 87
2.6. Amplification par PCR et séquençage des gènes cibles étudiés ... 88
2.7. Détermination du groupe génétique des isolats cliniques (PGG : « Principal Genetic Group ») ... 89
2.8. Séquençage des gènes cibles étudiés... 90
2.9. Analyse des séquences d’acide nucléique ... 91
2.10. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) ... 91
2.11. Courbes de croissance des mycobactéries... 93
3. Manipulation in vivo : modèle murin de la tuberculose ... 94
3.1. Races murines ... 94
3.2. Types d’expériences et souches mycobactériennes utilisées ... 94
3.3. Préparation des cultures de M. tuberculosis pour inoculation... 95
3.4. Préparation de l’inoculum ... 96
3.5. Anesthésie ... 96
3.6. Infection ... 96
3.7. Traitement ... 97
3.8. Euthanasie et homogénéisation des poumons ... 97
3.9. Numération des colonies de mycobactéries intra-pulmonaires (détermination des CFU: Colony Forming Unit) ... 98
3.10. Lecture de luminescence (détermination des RLU : Relative Light Unit)... 98
3.11. Etude pharmacocinétique (détermination des ASC) ... 99
Chapitre IV : Résultats ... 101
1. Génétique moléculaire de la résistance à l’acide p-aminosalicylique (PAS) des souches cliniques et mutants spontanés de Mycobacterium tuberculosis... 101
2. Des inhibiteurs synthétiques d’EthR stimulent l’activité anti-tuberculeuse de l’éthionamide... 114
3. L’anti-cancéreux 5-fluorouracil peut-il être utilisé comme médicament alternatif pour le
traitement d’infections tuberculeuses multi-résistantes (MDR-TB ou XDR-TB) ?... 128
4. Extrêmement haute prévalence de la tuberculose multi-résistante à Mourmansk, Russie ... 151
Chapitre V : Discussion ... 176
1. Caractérisation de la résistance au PAS ... 177
2. Amélioration de l’efficacité thérapeutique de l’éthionamide... 180
3. Evaluation de l’activité anti-tuberculeuse du 5-FU... 183
4. Caractérisation de la résistance à l’isoniazide et à la rifampicine dans une région géographique définie ... 184
5. Discussion générale... 187
Conclusion et perspectives... 194
Bibliographie... 197
Thèse annexe ... 218
Curriculum Vitae ... 221
Composition du jury de thèse
Président
Prof. Gilbert Vassart, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Belgique
Secrétaire
Prof. Marc Struelens, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Belgique
Membres
Prof. Abdelmounaaïm Allaoui, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Belgique Prof. Françoise Mascart, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Belgique Prof. Olivier Vandenberg, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Belgique Dr. Pablo Bifani, co-promoteur, Novartis, Singapour
Experts étrangers
Prof. Aliouat El Moukhtar, Laboratoire de Parasitologie – Zoologie, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Lille, France
Dr. Alain Baulard, Institut Pasteur de Lille et INSERM U629, Lille, France
Liste des abréviations
AA Acide aminé
ADN Acide désoxyribonucléique ADS Albumine-Dextrose-Saline ARN Acide ribonucléique ASC Aire Sous la Courbe
BAAR Bacille Acido-Alcoolo Résistant BCG Bacille de Calmette et Guérin
BDM Biostructures et Découverte du Médicament (Université de Lille)
BK Bacille de Koch
BSA Bovine Serum Albumine (Albumine du Sérum de Bovin) CDC Centers for Disease Control and Prevention
CFU Colony Forming Unit (Colonies Formant Unité) CMI Concentration Minimale Inhibitrice
CTAB Bromure d'hexadécyltriméthylammonium DHFR Dihydrofolate réductase
DMSO Diméthylsulfoxyde
dNTP Déoxynucléoside triphosphate ddNTP Didéoxynucléotide triphosphate DO Densité optique
DOTS Directly Observed Therapy Short-course (Traitement de courte durée sous observation directe)
EDTA Acide éthylènediaminetétraacétique EMB Ethambutol
ERDR Ethambutol Resistance Determining Region ETH Ethionamide
EuroTB Programme de surveillance de la tuberculose en Europe FAD Flavine Adénine Dinucléotide
FARES Fonds des Affections Respiratoires
FU Fluorouracil
FMNH2 Flavine mononucléotide réduite GCSF Granulocyte colony stimulating factor Hyg Résistance à l’hygromycine
INH Isoniazide
IDR Intradermoréaction IS Insertion Sequence
ISP Institut Scientifique de Santé Publique ITL Infection Tuberculeuse Latente
L Litre
LC-MS/MS Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry Log10 Logarithme en base 10
MDR-TB Multidrug-Resistant Tuberculosis (Tuberculose multi-résistante aux antibiotiques)
mg Milligramme
min Minute
MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube (Tube indicateur de croissance mycobactérienne)
MIRU Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit (unité répétitive dispersée dans le génome mycobactérien)
mL Millilitre
n Nombre
NaCl Chlorure de sodium
NAD(P) Nicotinamide Adénine Dinucléotide (Phosphate)
nM Nanomolaire
OADC Acide Oléique-Albumine-Dextrose-Catalase OMS Organisation Mondiale de la Santé
PANTA Polymyxine B, Amphotéricine B, acide Nalidixique, Triméthoprime, Azlocilline PAS Acide p-aminosalicylique
pb Paire de bases
PBS Phosphate Buffer Saline (Tampon Phosphate)
PCR Polymerase Chain Reaction (Réaction de Polymérisation en Chaîne) PGG Principal Genetic Group (Groupe Génétique Principal)
PHRI Public Health Research Institute PPD Purified Protein Derivative PZA Pyrazinamide
RFLP Restriction fragment length polymorphism (Polymorphisme de la longueur de fragments de restriction)
RIF Rifampicine
RLU Relative Light Unit (Unité relative de lumière) RRDR Rifampin Resistance Determining Region
SCC Short Course Chemotherapy (Thérapie médicamenteuse de courte durée) SIDA Syndrome d'Immuno-Déficience Acquise
SM Streptomycine
SNP Single Nucleotide Polymorphism (Polymorphisme au niveau d’un seul nucléotide)
SPF Specific Pathogen Free (Exempt de pathogènes spécifiques) Taq Thermus aquaticus
TB Tuberculose
TIGR The Institute for Genomic Research
UV Ultraviolet
VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine
VNTR Variable Number of Tandem Repeat (Nombre variable de répétition en tandem) WHO World Health Organization (Organisation Mondiale de la Santé - OMS)
WT Wild-Type (Type sauvage)
XDR-TB Extensively Drug-Resistant Tuberculosis (Tuberculose à résistance étendue aux antibiotiques)
Résumé
Malgré la disponibilité d’un traitement curatif et un vaccin largement utilisé, l’OMS estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l’agent étiologique de la tuberculose, et qu’environ 2 millions de personnes en meurent chaque année. La compréhension de l’épidémiologie de la tuberculose et les actions de contrôle de la maladie ont été, récemment, compliquées par l’émergence de bacilles tuberculeux résistants aux antibiotiques et par la synergie fournie par la co-infection avec le VIH. Une tendance alarmante pour la santé publique est l’émergence de souches résistantes à plusieurs antibiotiques (multi-résistantes, MDR), définies comme des isolats résistants au moins à l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), les deux agents anti-tuberculeux les plus puissants.
La sélection de mutants résistants se produit chez le patient lorsque les taux d’antibiotiques présents dans le corps sont sub-thérapeutiques ou lorsque la thérapie est inappropriée. Un des facteurs favorisant est l’exceptionnelle durée de la chémothérapie. Le besoin de maintenir des taux élevés d’antibiotiques pendant des mois, combiné avec la toxicité inhérente des agents, résultent en une observance incomplète du traitement par le patient et le risque d’acquérir des résistances. La résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis résulte d’altérations dans des gènes chromosomiques spécifiques. Les causes génétiques de la résistance ont été définies pour certains antibiotiques bien que plusieurs inconnues persistent.
Le présent travail a consisté en l’étude du problème de la résistance aux antibiotiques anti- tuberculeux par différentes approches : l’analyse génétique des mécanismes de résistance, l’évaluation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules et la caractérisation du profil de résistance de souches cliniques.
L’acide p-aminosalicylique (PAS) est un antibiotique bactériostatique de deuxième ligne dont le mécanisme d'action sur le bacille tuberculeux est incompris. Récemment, en utilisant la mutagenèse par transposon, la résistance au PAS fut associée à des mutations de la thymidylate synthase encodée par le gène thyA. Suite à cette découverte, nous avons entrepris une étude moléculaire de souches cliniques et de mutants spontanés résistants au PAS. Des mutations du gène thyA furent identifiées chez seulement 37% des souches. En tout, vingt-
quatre mutations différentes furent identifiées dans le gène thyA. Les séquences nucléotidiques de cinq autres gènes de la voie de synthèse du folate et de la thymine (dfrA, folC, folP1, folP2, et thyX) ainsi que de 3 gènes encodant des N-acétyltransférases (nhoA, aac1 et aac2) furent également analysées mais aucune mutation associée à la résistance au PAS n’a pu être mise en évidence. L’utilisation de techniques bioinformatiques de prédiction structurelle révèle que les mutations identifiées affectent soit la structure soit le site fonctionnel de ThyA. L’étude des profils de croissance des organismes résistants au PAS nous permit de constater que les organismes porteurs d’une mutation de la protéine ThyA présentent un profil de croissance constant en présence de concentrations croissantes de PAS.
Les organismes résistants au PAS possédant une protéine ThyA sauvage répondent, quant à eux, aux concentrations croissantes de PAS de façon dose-dépendante, indiquant que le(s) mécanisme(s) alternatif(s) de résistance au PAS est (sont) dose-dépendant(s).
La thymidylate synthase est également une des cibles du 5-fluorouracil (5-FU), l’agent chimiothérapeutique le plus largement utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé.
Etant donné l’augmentation du nombre de souches résistantes de M. tuberculosis, de nouveaux composés anti-tuberculeux sont nécessaires de façon urgente. Ici, nous avons évalué l’efficacité in vitro et in vivo du 5-FU sur M. tuberculosis. La concentration minimale inhibitrice du 5-FU fut déterminée sur une collection de souches cliniques sensibles et multi- résistantes ainsi que sur des mutants spontanés résistants au PAS. Tous les isolats montrèrent une sensibilité au 5-FU à des concentrations allant de 0.4 à 1.8 µg/ml, et ce indépendamment de leur profil de sensibilité/résistance aux agents anti-tuberculeux actuels. Les études in vivo du 5-FU (sur un modèle murin de tuberculose active) montrèrent une efficacité de celui-ci durant les deux premières semaines de traitement puis une perte d’activité à la troisième semaine, vraisemblablement engendrée par les effets secondaires du 5-FU.
L’éthionamide (ETH) est un autre antibiotique de deuxième ligne dont l’utilisation est limitée aux tuberculoses multi-résistantes étant donné les effets secondaires qu’il engendre. Ces dernières années, les études ont montré que l’ETH est un pro-médicament, transformé en forme active par l’enzyme monooxygénase EthA dont l’expression est contrôlée par le répresseur transcriptionnel EthR. Notre étude décrit l’élaboration d’inhibiteur d’EthR capable d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’ETH suite à l’amélioration de son activation.
Les composés synthétisés et sélectionnés pour leur capacité à inhiber l’interaction EthR-ADN furent co-cristallisés avec EthR. Les structures tridimensionnelles des complexes furent
utilisées pour la synthèse d’analogues capables d’améliorer la puissance de l’ETH en culture.
Les molécules les plus prometteuses furent testées sur un modèle murin de tuberculose. Pour un des inhibiteurs d’EthR testés, nous avons montré que sa co-administration avec l’ETH permet une réduction de la dose d’ETH utilisée de 3 fois, pour l’obtention d’une même réduction de charge mycobactérienne pulmonaire. Ce travail démontre la possibilité d’augmenter l’index thérapeutique de l’éthionamide en agissant pharmacologiquement sur le mécanisme régulateur de son activation.
Dans certaines régions du monde, le problème de la multi-résistance devient très présent.
Nous avons étudié l’état de la situation à Mourmansk (Fédération russe), une région à haute incidence de tuberculose. La résistance aux antibiotiques et l’épidémiologie moléculaire de la tuberculose furent étudiées sur des isolats collectés en 2003 et 2004 dans cette région. Une extrêmement haute prévalence de tuberculose multi-résistante (MDR-TB) fut constatée à la fois pour les nouveaux cas (primaires) (26%) et les cas précédemment traités (72.9%). Le typage des souches MDR primaires révèle une appartenance au génotype Beijing pour la plupart des isolats (79.8%) et l’homogénéité génétique des souches suggère une transmission active au sein de la population. L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans la résistance à l’INH et à la RIF montre la présence des mutations katG codon 315 et rpoB codon 531 chez, respectivement, 98,2% et 76,3% des isolats MDR-TB primaires. La haute fréquence de ces mutations « communes » suggère la possible utilisation de tests moléculaires ciblant spécifiquement ces mutations pour détecter rapidement la plupart des cas de MDR-TB.
Nos travaux illustrent les différentes voies à suivre pour maitriser le problème de la résistance aux antibiotiques : l’élucidation des mécanismes de résistance, le développement de nouveaux médicaments et la détection rapide des cas de résistance.
Chapitre I : Introduction
Chapitre I : Introduction
1. Tuberculose et mycobactéries
1.1. Définition et classification
La tuberculose est une maladie infectieuse causée par une mycobactérie. L’agent causal de la tuberculose humaine est, en général, Mycobacterium tuberculosis, également appelé BK pour
« Bacille de Koch ». Dans certains cas, la tuberculose humaine peut être causée par une autre mycobactérie, telle que :
• Mycobacterium africanum : agent responsable, le plus souvent, de la tuberculose en Afrique de l’ouest (Bonard et al., 2000).
• Mycobacterium bovis : agent responsable de la tuberculose chez les bovins et parfois chez l’homme (O'Reilly & Daborn, 1995).
• Mycobacterium microti, caprae et pinnipedii : agents responsables de la tuberculose chez les rongeurs, les chèvres et les mammifères marins (Prodinger et al., 2002).
• Mycobacterium canetti : agent responsable de tuberculose humaine (en particulier à Djibouti) (van Soolingen et al., 1997, Koeck et al., 2005).
Toutes ces mycobactéries, capables de causer la tuberculose, sont regroupées sous la dénomination « mycobactéries du complexe M. tuberculosis » (Figure 1). L’homologie entre leurs ADN est très élevée (>99,9%) (Garnier et al., 2003, Smith et al., 2009).
Les autres mycobactéries sont appelées mycobactéries atypiques ou non-tuberculeuses. Ces mycobactéries sont omniprésentes dans l’environnement. Dans certaines circonstances (immunodépression, lésion, maladie préexistante,…), certaines d’entre elles peuvent devenir pathogènes pour l’homme. On parle dans ce cas d’infection opportuniste appelée aussi mycobactériose.
Notons, par exemple :
• Mycobacterium avium-intracellulare : agent responsable de maladies respiratoires
• Mycobacterium ulcerans : agent responsable de l’ulcère de Buruli (nécroses chroniques de la peau et des tissus mous)
• Mycobacterium marinum : agent responsable d’infections cutanées torpides (maladie des aquariums)
• Mycobacterium abscessus : agent responsable d’infections cutanées et pulmonaires (notamment chez les patients mucoviscidosiques) (Jonsson et al., 2007)
En général, on classe dans une troisième catégorie, M. leprae et M. lepraemurium, les agents de la lèpre chez l’homme et le rat, caractérisés par leur incapacité à être cultivés in vitro (Figure 1).
Les mycobactéries appartiennent au genre Mycobacterium, de la famille des Mycobacteriaceae, de l’ordre des Actinomycétales et de la classe des Actinobactéries (Shinnick & Good, 1994).
Figure 1 : taxinomie des mycobactéries Bacteria
Domaine
Classe
Ordre
Famille Genre Espèce
(mycobactéries non tuberculeuses) M. avium-intracellulare M. marinum, M. kansasii
M. xenopi, ...
M. leprae M. lepraemurium (mycobactéries tuberculeuses)
M. tuberculosis, M. africanum M. bovis, M. microti M. caprae, M. pinnipedii
M. canetti
Complexe M. tuberculosis Mycobactéries atypiques Mycobactéries non cultivables Actinobacteria
Actinomycetales
Mycobacteriaceae
Mycobacterium
1.2. Caractéristiques de Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis se présente sous la forme d’un fin bâtonnet, de ~4 µm de long et
~0,4 µm de large, d’où le nom de « bacille » (Figure 2). Les bacilles tuberculeux sont rectilignes ou légèrement incurvés, aérobies ou microaérophiles, non sporulants et dépourvus de capsule. La croissance de M. tuberculosis est particulièrement lente avec un temps de doublement de 12 à 24h (Harshey & Ramakrishnan, 1977).
Figure 2 : image de M. tuberculosis par microscopie électronique à balayage (21228x) (http://phil.cdc.gov/phil/details.asp)
Une des caractéristiques majeures des mycobactéries est la richesse de leur paroi en lipides (60%) et, en particulier, en acides mycoliques (acides gras à longue chaîne). Ce haut contenu lipidique les rend imperméables aux colorants basiques. La coloration de Gram est donc difficilement réalisable. Pour obtenir une visualisation des mycobactéries au microscope, il est nécessaire de réaliser la coloration de Ziehl-Neelsen dont le principe repose sur l’acido- alcoolo-résistance de la mycobactérie, c’est-à-dire sa capacité de résister à la décoloration par les acides et alcools après une coloration à base d’arylméthane, telle que la fuchsine de Ziehl (Gangadharam & Droubi, 1981).
1.3. Le génome de M. tuberculosis
Le génome de M. tuberculosis (souche de référence H37Rv) a été entièrement séquencé et annoté. L’analyse a débuté en 1992 et s’est terminée en 1998 (Cole et al., 1998). Elle a été réalisée suite à une collaboration entre l’Institut Pasteur de Paris et le Centre Sanger. Le but
était de fournir des données utiles pour une meilleure compréhension de la physiopathologie de la bactérie permettant d’envisager l’identification de cibles pour la mise au point de nouveaux traitements et/ou vaccins.
Le génome de M. tuberculosis H37Rv consiste en un chromosome circulaire de 4.411.529 paires de bases contenant environ 4000 gènes (Figure 3). L’analyse de la séquence génomique a permis de mettre en évidence des particularités propres à M. tuberculosis. Ainsi, on observe que l’ADN présente une teneur élevée en guanine et cytosine (65.6% de GC) et qu’une grande partie des gènes (6% du génome) semblent coder pour des enzymes impliquées dans la synthèse et la dégradation des lipides.
Figure 3 : représentation du génome de M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998)
The outer circle shows the scale in Mb, with 0 representing the origin of replication. The first ring from the exterior denotes the positions of stable RNA genes (tRNAs are blue, others are pink) and the direct repeat region (pink cube); the second ring inwards shows the coding sequence by strand (clockwise, dark green; anticlockwise, light green); the third ring depicts repetitive DNA (insertion sequences, orange; 13E12 REP family, dark pink; prophage, blue); the fourth ring shows the positions of the PPE family members (green); the fifth ring shows the PE family members (purple, excluding PGRS); and the sixth ring shows the positions of the PGRSsequences (dark red). The histogram (centre) represents G + C content, with <65% G + C in yellow, and >65% G + C in red. The figure was generated with software from DNASTAR.
L’annotation du génome a été réalisée en comparant les séquences nouvellement déterminées avec les gènes précédemment séquencés chez d’autres organismes, permettant de prédire la fonction d’environ 50% des gènes. Afin de pouvoir facilement utiliser les informations obtenues par ce séquençage, le serveur « Tuberculist », a été construit et est disponible à l’adresse Internet suivante : http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/.
Depuis, d’autres génomes de M. tuberculosis et de mycobactéries atypiques ont été séquencés, tels que :
• M. tuberculosis: souche H37Rv (Sanger) (Cole et al., 1998) W210 (TIGR) (annotation en cours)
CDC 1551 (TIGR) (Fleischmann et al., 2002) C (Broad Institute*)
Haarlem (Broad Institute*) F11 (Broad Institute*) KZN 4207 (Broad institute*)
* http://www.broad.mit.edu
• M. bovis souche AF2122/97 (Sanger) (Garnier et al., 2003)
• M. bovis BCG souche Pasteur (Sanger) (Brosch et al., 2007)
• M. ulcerans (Pasteur Génopole) (Stinear et al., 2007)
• M. leprae (Sanger) (Cole et al., 2001)
• M. marinum (Sanger) (Stinear et al., 2008)
• M. smegmatis (TIGR)
• M. avium paratuberculosis (University of Minnesota)
• M. avium souche 104 (TIGR)
2. Groupes génétiques des souches de M. tuberculosis
Des substitutions nucléotidiques se produisent au sein du génome des bactéries. Il s’agit de mutations ponctuelles, plus communément appelées SNP pour « Single Nucleotide Polymorphism ». Il existe deux catégories de substitutions nucléotidiques :
- les SNP synonymes (silencieux)
- les SNP non-synonymes (non silencieux) Exemples :
SNP non-synonyme : mutation nucléotidique d’une cytosine « C » en thymine « T » provoquant la modification du codon et de l’acide aminé qu’il encode.
TCG TTG Sérine Leucine
SNP synonyme : mutation nucléotidique d’une guanine « G » en adénine « A » provoquant la modification du codon mais pas de l’acide aminé qu’il encode.
TCG TCA Sérine Sérine
Les SNP non-synonymes résultent en des changements d’acides aminés pouvant provoquer un changement de phénotype et entrainer de ce fait une sélection évolutionnaire. C’est ce type de modification génétique que l’on retrouve fréquemment chez M. tuberculosis au niveau des gènes impliqués dans la résistance aux antibiotiques, conférant les phénotypes résistants.
A l’opposé, les SNP synonymes n’altèrent pas la séquence d’acides aminés des protéines. Ces mutations sont donc considérées comme fonctionnellement neutres. Elles sont, cependant, les marques de l’évolution et, de ce fait, fournissent une base pour des études génétiques de relation évolutionnaire (phylogénétique) entre souches.
La comparaison des génomes séquencés de différentes souches de M. tuberculosis permit de mettre en évidence une diversité génomique intraspécifique très réduite et notamment un taux de variation nucléotidique (SNP) extrêmement faible par rapport aux autres bactéries pathogènes. Plusieurs études indépendantes ont montré une homologie de séquence >99,9%
(Garnier et al., 2003). Deux hypothèses peuvent être évoquées pour expliquer ce manque de diversité nucléotidique chez M. tuberculosis : soit la bactérie possède une fidélité de réplication inhabituelle ou un système de réparation des erreurs d’incorporation très efficace,
soit son origine est d’évolution récente. Etant donné que la fréquence de mutations spontanées chez M. tuberculosis se situe dans la gamme enregistrée pour les autres bactéries, la première hypothèse peut être écartée (David, 1970). Tout indique que M. tuberculosis est jeune (spéciation estimée comme s’étant produite il y a 15000-20000 ans) et s’est dispersée récemment (Kapur et al., 1994). Ces SNP limités ont fourni aux chercheurs des outils pour différencier les isolats cliniques de M. tuberculosis et étudier leurs relations phylogénétiques.
2.1. Groupes génétiques principaux
Sreevatsan utilisa deux SNP non-synonymes mais fonctionnellement neutres pour établir 3 grands groupes génétiques appelé PGG1, PGG2 et PGG3 (PGG pour « Principal Genetic Group ») (Sreevatsan et al., 1997a). Les deux SNP utilisés concernent : le codon 463 (Leu463Arg) du gène katG encodant la catalase-peroxydase KatG et le codon 95 (Thr95Ser) du gène gyrA encodant GyrA, la sous-unité A de la gyrase (Figure 4). Ces 2 SNP ne sont pas impliqués dans la résistance aux antibiotiques. Tous les isolats de M. tuberculosis peuvent être classés dans ces 3 groupes génétiques. Selon les études, il semble que les organismes du PGG1 sont ancestraux à ceux du PGG2 et que ceux du PGG2 sont eux-mêmes ancestraux à ceux du PGG3 (Gutacker et al., 2002). On remarque aussi que les organismes du PGG1 sont liés à M. bovis, l’agent causal de la tuberculose bovine, ainsi qu’à M. microti, M.
africanum,…. Plus récemment, une nouvelle étude portant sur un SNP synonyme au niveau du codon 203 du gène katG permit de subdiviser le PGG1 en deux groupes distincts (Frothingham et al., 1999).
Figure 4 : Groupes génétiques principaux et scénario évolutionnaire des organismes du complexe M. tuberculosis (Sreevatsan et al., 1997a)
2.2. Clusters génétiques
Gutacker réalisa une large analyse des SNP synonymes du génome de M. tuberculosis. En comparant les génomes séquencés de 4 souches tuberculeuses (CDC 1551, H37Rv, souche 210 et M. bovis), il identifia 900 SNP localisés dans les fenêtres de lecture, confirmant le niveau restreint des variations génétiques (Gutacker et al., 2002). De ces 900 SNP, il retint 230 SNP synonymes pour réaliser une large étude génotypique sur une collection de 432 souches du complexe M. tuberculosis (Gutacker et al., 2002). L’analyse identifia 8 clusters majeurs de génotypes. Une analyse plus poussée sur 5069 souches de M. tuberculosis avec 36 SNP synonymes lui permit par la suite de définir un 9ème cluster (Figure 5). Tous les isolats de M. tuberculosis peuvent être classés dans ces 9 clusters génétiques.
Figure 5 : Arbre phylogénétique montrant les relations supposées entre les 9 clusters génétiques des souches de M. tuberculosis (Gutacker et al., 2006)
Une relation existe entre les clusters et les PGG. Les organismes des clusters I et II appartiennent au PGG1. Ceux des clusters III, IV, V et VI appartiennent au PGG2 et enfin ceux des clusters VII et VIII appartiennent au PGG3. Le cluster II.A englobe à la fois des organismes des PGG1 et PGG2, renforçant l’hypothèse d’une relation phylogénétique entre les organismes du PGG1 et du PGG2 (Gutacker et al., 2006).
2.3. Méthodes de génotypage de M. tuberculosis
De nombreuses méthodes de génotypage des souches cliniques de M. tuberculosis ont été développées depuis une vingtaine d’années. Parmi les plus utilisées, on compte : la méthode IS6110-RFLP développée originalement, le spolygotyping et le MIRU-VNTR décrite plus récemment (Mathema et al., 2006, Kanduma et al., 2003).
IS6110-RFLP
Le génome des mycobactéries présente des séquences d’insertion appelées « IS ». L’élément d’insertion le plus étudié est l’IS6110 (1365 pb), communément utilisé pour le génotypage des isolats tuberculeux (Thierry et al., 1990). La technique repose sur l’analyse du nombre et de la position des copies d’IS6110, variables d’un isolat à l’autre et reflété par un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) après clivage de l’ADN génomique au moyen de l’enzyme PvuII. La technique IS6110-RFLP standardisée est actuellement la méthode de référence pour le typage des isolats du complexe M. tuberculosis (van Embden et al., 1993).
Spoligotyping
Une autre technique fréquemment utilisée pour le génotypage des isolats du complexe M.
tuberculosis est le spoligotyping (ou spacer oligotyping). Cette technique repose sur l’analyse d’une région unique du génome des isolats du complexe M. tuberculosis présentant de multiples copies d’une séquence de 36 pb appelée « DR » pour Directly Repeat. Ces éléments
« DR » sont séparés les uns des autres par des séquences uniques, non répétées, appelées
« spacer » (Kamerbeek et al., 1997). L’ordre des « spacers » est identique chez toutes les souches mais leur présence/absence varie d’un isolat à l’autre. C’est ce polymorphisme qui est mis en évidence par la méthode de spoligotyping après amplification des « spacers » par PCR et hybridation des fragments amplifiés sur une membrane préalablement coatée par un set de 43 « spacers » de référence. Etant donné que cette technique repose sur une amplification par PCR, elle nécessite une moindre quantité d’ADN (applicable sur un échantillon positif à l’examen direct) (Cave et al., 2005).
MIRU-VNTR
L’analyse des régions génomiques présentant des nombres variables de répétitions en tandem (VNTR, Variable Number of Tandem Repeat), proposée initialement par Frothingham, s’est également montrée très utile pour le génotypage de souches de M. tuberculosis (Frothingham
& Meeker-O'Connell, 1998, Mathema et al., 2006). De nombreux VNTR ont été identifiés dans le génome de M. tuberculosis suite à son séquencage génomique complet. Parmi ceux- ci, ont été décrits 41 VNTR d’éléments génétiques appelés « unités répétitives dispersées sur le génome mycobactérien » ou MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit). Douze des 41 loci MIRU furent sélectionnés pour le génotypage des isolats cliniques (Supply et al., 2000, Mazars et al., 2001). Le génotypage MIRU-VNTR repose sur l’amplification par PCR des régions ciblées et la détermination du nombre de répétitions de l’unité. Le résultat final est un code numérique à 12 chiffres correspondant au nombre de répétitions observées pour chaque locus chromosomique (Crawford, 2003). Récemment, une technique standardisée basée sur l’analyse de 15 loci MIRU au lieu de 12, présentant un pouvoir discriminatoire augmenté, a été proposée comme nouveau standard pour les études épidémiologiques de routine alors qu’un système à 24 loci a été proposé comme méthode à haute résolution pour les études phylogénétiques (Supply et al., 2006). Un exemple de cette application peut être trouvé dans une étude publié récemment sur des isolats belges (Allix-Beguec et al., 2008).
2.4. Utilisation des groupes génétiques pour les études de population
Lorsqu’une étude est réalisée sur une collection d’isolats tuberculeux dans le but de tirer des conclusions générales, il est important de veiller à ce que ceux-ci soit représentatifs des différents groupes génétiques (PGG, cluster,…) afin d’éviter tout biais de sélection par rapport à l’appartenance phylogénétique de ce pathogène. Au sein de notre laboratoire, lorsque nous étudions la possible association entre une mutation et un phénotype de résistance à un antibiotique, nous utilisons des isolats représentatifs des différents groupes de souches. En effet, l’utilisation d’isolats appartenant tous à un même groupe génétique pourrait mener à de fausses conclusions ; la mutation incriminée pourrait être phylogénétique.
3. Epidémiologie de la tuberculose
3.1. La tuberculose dans le monde
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale (~2 milliards d’individus) est infectée par M. tuberculosis, l’agent étiologique de la tuberculose (Dye et al., 1999). Ces personnes sont porteuses de la maladie et donc susceptibles de développer une forme active de tuberculose à un moment de leur vie.
Les organismes de lutte contre la tuberculose utilisent régulièrement l’image très parlante suivante : « chaque seconde, une nouvelle personne est infectée par le bacille tuberculeux ».
La prévalence de la tuberculose active dans le monde (c'est-à-dire le nombre de malades) est estimée à 14,4 millions (WHO, 2008b) : elle concerne principalement la population active, c’est-à-dire les individus appartenant à la tranche d’âge 15-49 ans (Dye et al., 1999). Après le syndrome d’immunodéficience acquise dû au VIH, la tuberculose est la seconde cause de mortalité liée à une maladie infectieuse. De ce fait, selon les estimations, la tuberculose sera encore reprise parmi les 10 premières causes de mortalité en l’an 2020 (Murray & Salomon, 1998).
En 2006, 1.7 millions de patients sont décédés de tuberculose et 9.2 millions d’individus ont contracté la maladie (Figure 6). Parmi ces nouveaux cas, 44% présentaient un examen microscopique de crachat positif (contagieux) et 8% étaient séro-positifs pour le VIH (WHO, 2008b).
Figure 6 : Carte mondiale représentant les taux d’incidence estimée de la tuberculose en 2006 (WHO, 2008b)
Estimated new TB cases (all forms) per 100 000 population
No estimate 0–24 25–49 100–299 300 or more
50–99
La distribution mondiale de la tuberculose concerne fortement les régions économiquement faibles (pays en voie de développement). Les 3 zones géographiques les plus atteintes sont l’Asie du Sud Est (33% des malades), l’Afrique (29%), et le Pacifique Occidental (22%).
Ensemble, ces 3 régions totalisent 84% des malades souffrant de tuberculose. L’Amérique (Nord et Sud) et l’Europe représentent, respectivement, 4 et 5% des cas de tuberculose (WHO, 2008b). Les plus hautes prévalences sont enregistrées, dans l’ordre, pour l’Inde, la Chine, l’Indonésie, l’Afrique du Sud et le Nigéria. C’est l’Afrique qui présente l’incidence la plus élevée avec 363 nouveaux cas pour 100.000 habitants en 2006 (WHO, 2008b).
L’épidémiologie et les programmes de contrôle ont vu leur complexité augmenter par l’émergence de bacilles résistants aux drogues anti-tuberculeuses et par la synergie de la co- infection M. tuberculosis/VIH (Zignol et al., 2006). En effet, en 2006, le nombre de cas de tuberculose multi-résistante (résistante à l’isoniazide et à la rifampicine, les deux antibiotiques majeurs du traitement) a été estimé à 500.000 (soit environ 5% des nouveaux cas annuels estimés à 9.2 millions en 2006) et sur les 1.7 millions de décès, 200.000 concernaient des patients VIH positifs (Zignol et al., 2006, WHO, 2008b). En 2005, le nombre de cas de tuberculoses causées par une souche XDR (résistante à l’isoniazide, la rifampicine, une fluoroquinolone et un antibiotique injectable) fut estimé à 27.000 (soit environ 5% des souches classées comme multi-résistantes) (Goldman et al., 2007, LoBue, 2009).
3.2. La tuberculose en Europe
Les pays industrialisés ont enregistré une diminution progressive des cas de tuberculose depuis le début du 20ème siècle suite à l’amélioration des conditions de vie et à la découverte d’antibiotiques efficaces. A partir des années 1980-1990, cette régression s’est ralentie, probablement en relation avec le nombre de cas de SIDA mais aussi en rapport avec le relâchement de la lutte contre la tuberculose, le développement de souches résistantes aux antibiotiques et l’importation de cas en provenance de pays à haute prévalence (FARES, 2006a).
En 2006, 423.000 cas ont été rapportés en Europe, ce qui représente environ 7% des cas de tuberculose dans le monde pour cette année. Les cas notifiés en Europe se répartissent comme suit : 73% pour l’Europe de l’Est (Kazakhstan, Moldavie, Géorgie, Arménie,
Bélarus,….), 21% pour l’Union Européenne et l’Europe de l’Ouest et 6% pour les pays des balkans. En 2006, l’EuroTB, le réseau de surveillance de la tuberculose en Europe, a établi une cartographie de la tuberculose en Europe (Figure 7). Celle-ci indique clairement que l’incidence de la tuberculose augmente progressivement de l’Ouest vers l’Est (EuroTB, 2006).
Figure 7 : Nombre de cas de tuberculose par 100.000 habitants, rapporté en 2006 dans les différents pays européens. Cette carte de l’Europe a été définie par l’EuroTB et est basée sur
les secteurs de santé (EuroTB, 2006)
3.3. La tuberculose en Belgique
Comme dans les autres pays industrialisés, le nombre de cas de tuberculose en Belgique a régulièrement diminué au cours du siècle dernier (à l’exception des deux périodes de guerre).
En 1993-1994, une augmentation du nombre de cas a, cependant, été observée et depuis la régression a fortement freiné (stabilisation de l’incidence) (Figure 8). Ce changement est dû à l'augmentation du nombre de cas de tuberculose importés d’Afrique, d’Asie et de l'Europe de l'Est via une immigration accentuée. En effet, on observe un accroissement de la proportion de cas « étrangers » parmi les patients tuberculeux de Belgique (51% des cas en 2006 contre 18% en 1991) (FARES, 2006a).
Not included Not reporting to EuroTB
< 11 11 – 20 21 – 50
Andorra Malta Monaco San Marino
Figure 8 : évolution de l’incidence de la tuberculose en Belgique, 1980-2006
En 2006, 1127 nouveaux cas de maladie tuberculeuse ont été déclarés en Belgique (10,7 cas pour 100.000 habitants). La Région bruxelloise est la plus touchée, s’expliquant probablement par le fait qu’elle présente le plus grand nombre de sujets à risque (défavorisés, toxicomanes, immigrants de pays à haute prévalence, ...) (FARES, 2006b).
En 2006, 7,6 % des cas de tuberculose en Belgique présentaient une résistance à au moins un antibiotique anti-tuberculeux et 2,2 % présentaient une multirésistance. En Belgique, le phénomène de tuberculose multi-résistante reste donc assez limité mais son évolution doit être l’objet d’une surveillance attentive (FARES, 2006b).
4. Histoire de la tuberculose
4.1. Histoire de la maladie
La tuberculose est une maladie très ancienne dont l’évolution semble avoir suivi celle de l’homme. Par l’analyse d’échantillons de tissus humains prélevés sur des momies égyptiennes datant de 3400 ans avant JC, on peut dire que la tuberculose sévissait déjà durant l’antiquité.
Ces conclusions sont basées à la fois sur des évidences morphologiques (déformation de la colonne vertébrale typique de la maladie de Pott, la tuberculose des os) et sur des évidences génétiques (présence d’ADN tuberculeux dans les tissus) (Crubezy et al., 1998). Les premiers documents mentionnant la tuberculose sont d’origine grecque. En 460 avant JC, Hippocrates parle de la tuberculose sous le terme « phthisis », du grec « dépérissement ». Il donna des informations cliniques assez précises sur la tuberculose pulmonaire et dit de cette maladie qu’elle était très répandue et presque toujours fatale. On retrouve également des écrits de Claudius Galen, un célèbre médecin de l’Empire Romain. Il décrit la tuberculose comme une maladie incurable.
Au cours du 16ème et du 17ème siècles, les descriptions médicales de la tuberculose deviennent de plus en plus fréquentes.
A la fin du 18ème siècle et début du 19ème, l’Europe est en pleine expansion industrielle alors que l’endémie de tuberculose atteint son apogée. Ceci peut s’expliquer par l’accroissement de la population dans les villes en développement et par la malnutrition (mauvaises conditions physiques des travailleurs) décrits à cette époque. La tuberculose, responsable d’un décès sur cinq, est un véritable fléau, notamment en Grande-Bretagne. La littérature anglo-saxonne parle de la tuberculose sous le nom « consumption » car les patients semblent être « consumés » de l’intérieur. La même progression de la maladie est observée en Amérique du Nord (Leao &
Portaels, 2007).
Au 18ème siècle, la population perçoit la tuberculose comme une « maladie romantique ». On pensait qu’elle ne touchait que les personnes sensibles qui « brûlaient de passion ». La littérature entretient cette vision romantique de la tuberculose. L’exemple le plus connu est le roman « La Dame aux Camélias » d’Alexandre Dumas fils (1848) (Morens, 2002). Dans la
deuxième moitié du 19ème siècle, on observe une fréquence plus élevée de tuberculose dans les couches sociales les plus pauvres. Son image devient alors négative.
A l’époque, il n’existait pas encore de traitement. On recommandait seulement une bonne alimentation et du repos, de préférence dans des sanatoriums (Figure 9). Le premier sanatorium pour tuberculeux pulmonaires date de 1854 en Allemagne.
Figure 9 : photograhie du sanatorium Prince Charles d’Auderghem situé dans la forêt de Soignes en Belgique (FARES, 2006a)
En 1816, le docteur Laennec met au point le premier stéthoscope. Cet instrument permit l’auscultation thoracique des patients (Daniel, 2006).
En 1865, le médecin Jean-Antoine Villemin démontre expérimentalement le caractère contagieux de la tuberculose. Il parvient à transmettre la maladie à des lapins en les inoculant avec des broyats de lésions tuberculeuses humains et bovines (Daniel, 2006). Il affirme, par conséquent, que la tuberculose est due à un microbe invisible par les techniques de l’époque.
Ces déclarations furent fortement controversées et seulement approuvées après la mise en évidence du bacille tuberculeux par Robert Koch.
Etant donné ces découvertes sur la contagiosité de la tuberculose et l’observation de la tendance au développement de la tuberculose dans les milieux insalubres, les premières recommandations de mesure d’hygiène firent leur apparition. On recommanda, par exemple, le lavage des mains régulier et une toilette quotidienne à l’eau et au savon.
En 1882, Robert Koch, un médecin allemand, annonce qu’il a identifié et cultivé l’agent responsable de la tuberculose. Ce bacille fut surnommé BK pour « Bacille de Koch » en l’honneur de celui qui l’a mis en évidence. La découverte de Koch fut rejetée par le monde scientifique, dans un premier temps, avant d’être acceptée mondialement. En 1905, il reçut le prix Nobel de médecine et de physiologie pour ses recherches scientifiques (Sakula, 1982, Koch, 1882-1982).
En 1895, Van Röntgen découvre les rayons X (ou rayons Röntgen). Cette découverte conduira au développement de la technique de radiographie. En 1896, Bouchard décrit les premières applications des rayons X sur l’étude de la tuberculose pulmonaire. Cet examen devint rapidement indispensable pour le diagnostic et le suivi des patients tuberculeux.
Au bureau central pour la prévention de la tuberculose, officialisé à Berlin en 1902, le Dr.
Gilbert Sersiron suggéra que, comme la lutte contre la tuberculose est comparable à une croisade, il serait approprié d’adopter l’emblème d’un croisé. Ils prirent celui du Duc de Lorraine, Godefroy de Bouillon, dont la bannière portait une croix doublement barrée signifiant « courage et succès » (Figure 10). Cette double croix devint ainsi le symbole mondial de la lutte contre la tuberculose (Leao & Portaels, 2007).
Figure 10 : symbole de la croisade anti-tuberculeuse (Leao & Portaels, 2007)
En 1921, Albert Calmette (médecin) et Camille Guérin (vétérinaire) présentent le vaccin BCG (Bacille Calmette Guérin) qu’ils ont mis au point. Ce vaccin fut préparé à l’Institut Pasteur de Lille, à partir d’une souche vivante mais atténuée de M. bovis, l’agent de la tuberculose bovine. Pour obtenir l’atténuation de la virulence de cette souche, Calmette et Guérin réalisèrent 230 cultures successives de celle-ci sur un milieu à la pomme de terre contenant également de la bile et du glycérol. Ces repiquages successifs prirent un peu plus de 12 ans.
A l’heure actuelle, l’efficacité de ce vaccin est assez controversée. En effet, des niveaux très variables de protection ont été observés chez l’adulte (Andersen & Doherty, 2005).
Cependant, il présente un bon effet protecteur contre la tuberculose chez les enfants, en particulier pour les formes sévères, telles que les tuberculoses méningées et disséminées (Colditz et al., 1994). C’est pourquoi, le vaccin BCG reste le vaccin le plus utilisé de par le monde (Locht, 2008).
A partir de 1944, on rentre dans l’ère de la thérapie médicamenteuse. Cette étape marque un tournant important dans l’histoire de la tuberculose.
4.2. Histoire du traitement anti-tuberculeux
Avant l’introduction des antibiotiques, de nombreux remèdes « douteux » furent proposés pour traiter la tuberculose. Certains proposaient des concoctions d’herbes, des régimes alimentaires ou simplement du repos. D’autres proposaient des méthodes moins bénignes, telles que saignées, injection d’air dans les poumons,….. affaiblissant encore davantage le patient. Divers composés furent également testés, tels que le sanocrysin (sel d’or proposé par Robert Koch), la vitamine D, des sulphones, … leur efficacité sur le patient ne fut jamais prouvée (Benedek, 2004, Dutau, 2005). A l’époque, on considérait que la tuberculose tuait un patient sur deux soit 50% des malades. La découverte des sulfonamides et de la pénicilline au cours des années 30 marqua le début de la thérapie anti-microbienne. En 1944, on note les deux premières avancées majeures dans le traitement de la tuberculose. En effet, Waksman mit en évidence l’activité anti-tuberculeuse de la streptomycine (SM) et Lehman synthétisa l’acide para-aminosalycilique (PAS), également actif sur M. tuberculosis. On commenca par l’utilisation de la streptomycine, mais dès le début de son utilisation des cas de résistance furent rapportés (Mc Dermott, 1947, Youmans et al., 1947). Des essais cliniques furent réalisés (de 1944 à 1949) afin de comparer le PAS ou la SM, seuls et en combinaison (Medical Research Council, 1950). Les résultats montrèrent un net avantage de la thérapie combinée à la fois pour la guérison et pour prévenir l’apparition de souches résistantes (fréquente lors de l’utilisation d’un seul antibiotique en traitement). En 1952, Domagk découvrit l’isoniazide (INH), un composé clef pour le traitement de la tuberculose. La thérapie combinée PAS+SM évolua alors vers une triple thérapie INH+PAS+SM, qui assurait la guérison de 90 à 95% des patients. La durée du traitement restait problèmatique ; 24 mois
étaient nécessaires pour obtenir la guérison du patient. En 1960, la durée du traitement fut réduite à 18 mois suite au remplacement du PAS par l’éthambutol (EMB).
L’étape suivante et importante dans l’évolution de la thérapie anti-tuberculeuse, fut la découverte de la rifampicine (RIF) en 1967. Les tests montrèrent que la RIF, par son effet stérilisant, en présence d’INH, permettait de réduire encore la durée de traitement de 18 à 9 mois (Webb & Davies, 1999). En 1980, la pyrazinamide (PZA) fut introduite dans le schéma de base du traitement de la tuberculose. Cet antibiotique, en présence de l’INH et de la RIF, permit d’obtenir la guérison de plus de 95% des patients en seulement 6 mois (Webb &
Davies, 1999) (Figure 11).
Figure 11 : Evolution du traitement de la tuberculose (et de sa durée) au cours du temps
Donc, le schéma actuel de traitement, appelé aussi « Short Course Chemotherapy » (SCC), consiste en 2 phases successives :
- Phase initiale de 2 mois : isoniazide, rifampicine, pyrazinamide + streptomycine ou éthambutol. Cette phase initiale permet la négativation des crachats des patients.
- Phase de continuation de 4 mois: isoniazide et une autre drogue de première ligne (il s’agit souvent de la rifampicine). Cette phase a pour but d’éliminer les bacilles restants et ainsi de prévenir toute rechute.
24 mois 18 mois 9 mois 6 mois
1944 1952 1960 1980
SM + PAS INH PAS EMB RIF PZA Découverte
Temps de traitement
1967 1957
ETH
4.3. Lutte contre la tuberculose
L'OMS recommande la stratégie DOTS initiée en 1995. DOTS est l’abréviation de « Directly Observed Treatment Short-course » c’est-à-dire un traitement de courte durée sous supervision directe (Corbett & Raviglione, 2005). Concrètement, pendant les deux premiers mois de traitement, les patients doivent prendre leurs antibiotiques en présence d’un professionnel de la santé. Ceci peut être réalisé dans un centre médical ou directement au domicile du patient. Par ce plan d’action, le personnel médical s’assure du respect du traitement et fournit aux patients le soutien nécessaire tout au long de son administration. Les professionnels essayent également de fournir aux patients les informations et les conseils nécessaires afin qu’ils se prennent davantage en charge et poursuivent leur traitement seul, après les deux mois d’observation DOTS.
La stratégie DOTS repose sur 5 éléments de base (http://www.who.int/tb/dots/fr/) :
• Engagement politique des pays dans la lutte contre la tuberculose avec tout ce que cela implique : soutien financier, législation, formation,….
• Dépistage de qualité des cas de tuberculose par examen microscopique des expectorations chez les personnes présentant des symptômes évocateurs de tuberculose.
• Mise en place de traitements complets, standardisés et sous supervision directe. Cela implique l’existence de centres de soins adaptés.
• Disponibilité des médicaments via un approvisionnement ininterrompu.
• Mise en place d’un système de rapportage et de notification afin de suivre l’évolution des patients et des résultats globaux du programme.
L’OMS s’était fixé comme objectif de détecter 70% des nouveaux cas de tuberculose-maladie et d’en guérir 85% pour l’année 2000 (WHO, 1991). Celui-ci ne fut pas atteint en 2000 mais les chiffres laissaient beaucoup d’espoir. Globalement, en 2005, le taux de détection du nombre d’expectorations positives étaient de 61% (comparé aux 70% visés) et un traitement fut appliqué avec succès pour 84,7 % des malades (juste en dessous des 85% ciblés) (WHO, 2008b). Depuis le début de son application en 1995, la stratégie DOTS a été appliquée dans 184 pays et 31,8 millions de nouveaux cas ont été notifiés par ce programme.
La stratégie DOTS est au cœur du programme « Halte à la tuberculose » lancé par l’OMS en 2006 (WHO, 2006b). Ce nouveau programme propose, en plus de renforcer la stratégie DOTS, de favoriser la recherche pour le développement de vaccins et de nouveaux médicaments anti- tuberculeux et de lutter contre la co-infection TB-VIH et les tuberculoses multi-résistantes.
“The stop TB strategy” (WHO, 2006b)
1. Poursuivre et améliorer une stratégie DOTS de qualité
• Engagement politique accompagné d’un financement accru et durable;
• Dépistage des cas par un examen bactériologique de qualité avérée;
• Traitement standardisé et supervisé, accompagné d’un soutien au patient;
• Système efficace d’approvisionnement et de gestion des médicaments;
• Système de suivi et d’évaluation, et mesure de l’impact.
2. Lutter contre la co-infection TB/VIH, la Tuberculose - MR et s'attaquer à d'autres défis
• Collaboration dans le domaine de la lutte contre la co-infection tuberculose/VIH;
• Prévention de la tuberculose multi-résistante;
• Mesures en faveur des prisonniers, des réfugiés, d’autres groupes à risque et des situations particulières.
3. Contribuer au renforcement des systèmes de santé
• Participation active aux efforts pour améliorer la politique des systèmes de santé, les ressources humaines, le financement, la gestion, la prestation de services et les systèmes d’information;
• Partager les nouvelles approches permettant de renforcer les systèmes, y compris de l’approche pratique de la santé respiratoire (APSR);
• Adaptation d’innovations venant d’autres domaines.
4. Impliquer tous les soignants
• Approches public-public et public-privé;
• Normes internationales pour la prise en charge de la tuberculose.
5. Donner aux patients et aux communautés la capacité d'agir
• Plaidoyer, communication et mobilisation sociale;
• Participation de la communauté aux soins de la tuberculose;
• Charte des patients pour les soins anti-tuberculeux.
6. Favoriser et promouvoir la recherche
• Recherche opérationnelle centrée sur les programmes de lutte;
• Travaux de recherche pour la mise au point des outils diagnostiques, des médicaments et des vaccins nouveaux.
5. Histoire naturelle de l’infection tuberculeuse
5.1. Transmission et développement de la maladie
La tuberculose se transmet généralement par voie aérienne. Le malade, atteint par une tuberculose pulmonaire en phase active, émet dans l’air de fines gouttelettes (1 à 5 µm) chargées de quelques bactéries, notamment lorsqu’il tousse, parle ou éternue. C’est par l’inhalation de ces gouttelettes en suspension dans l’air qu’un individu sain se contamine.
Les lieux de promiscuité importante (prisons, mines, manufactures,…) favorisent la contamination qui est proportionnelle au confinement de l’air (Beggs et al., 2003, Nardell, 1989). Une contamination peut également avoir lieu suite à la formation d’aérosols lors de la manipulation de lésions tuberculeuses ou d’objets souillés dans les hôpitaux et laboratoires (Kao et al., 1997).
Dans la majorité des cas, les bacilles tuberculeux sont arrêtés au niveau du nez, des bronches et bronchioles. Ils sont alors entraînés par le mucus vers le pharynx puis déglutis et détruits par l’acidité de l’estomac.
5.2. Primo-infection
Dans la minorité des cas, les bacilles atteignent les alvéoles pulmonaires. Là, ils entrent en contact avec les macrophages alvéolaires qui, en général, les phagocytent, les dégradent et les éliminent. Cependant, si les défenses immunitaires innées de l’individu sont réduites, si l’infection est importante (charge bactérienne élevée) ou si la bactérie est fortement virulente, il arrive que des bacilles survivent dans les macrophages et s’y multiplient. Les macrophages colonisés finissent par éclater et libérer un grand nombre de bacilles capables d’infecter, à leur tour, d’autres macrophages. Ainsi, un foyer infectieux se développe au niveau du poumon et provoque la formation d’une lésion ou « chancre d’inoculation ». Le corps de la personne infectée réagit à cette « primo-infection » par le développement d’une réponse immunitaire cellulaire et la formation d’un granulome constitué principalement de macrophages infectés et de cellules T (Peyron et al., 2008, Kaufmann, 2002).
Dans 90% des cas, la maladie ne se développe pas. Le granulome se calcifie et les bacilles emprisonnés restent sous contrôle à l’état quiescent, on parle d’ « infection tuberculeuse latente (ITL) » (Smith, 2003). Ces patients ne sont pas contagieux. Chez la plupart des individus, la « primo-infection » passe inaperçue. On peut cependant, parfois, observer de la fièvre, une adénopathie, une perte d’appétit,…. La primo-infection peut être mise en évidence chez un patient grâce au test d’hypersensibilité retardée (intradermoréaction à la tuberculine) (Hopewell & Jasmer, 2005).
5.3. Tuberculose active : pulmonaire et extra-pulmonaire
5.3.1. Tuberculose pulmonaire
La tuberculose-active ne se développe que chez environ 10% des personnes infectées par M.
tuberculosis (Kaufmann, 2002). Elle peut se développer soit directement après la primo- infection, soit après plusieurs années suite à la réactivation de l’ « infection tuberculeuse latente ». Dans ce cas, la lésion précédemment formée se nécrose et les bacilles tuberculeux quiescents sont libérés (Smith, 2003). La tuberculose active s’accompagne de signes cliniques et/ou radiologiques. Les signes cliniques de la tuberculose pulmonaire sont une toux persistante avec des expectorations parfois accompagnées de sang, une douleur thoracique et des symptômes plus généraux comme fièvre, sudation nocturne, fatigue, perte d’appétit, et amaigrissement. Un diagnostic peut être proposé par radiographie ou scanner du thorax du patient.
5.3.2. Tuberculose extra-pulmonaire
La tuberculose pulmonaire (ou phtisie) est la forme la plus commune de la tuberculose (85%
des cas), cependant les bacilles tuberculeux peuvent, plus rarement, être transportés dans tout l’organisme, via les systèmes lymphatique et sanguin, créer de nouveaux foyers infectieux et provoquer une tuberculose extra-pulmonaire (15% des cas) (Hopewell & Jasmer, 2005). Les bacilles peuvent infecter différents organes du corps tels que les os, les reins, les ganglions, les méninges, l’intestin, la peau,…. (Figure 12). Lorsque la tuberculose est extra-pulmonaire, les symptômes peuvent varier en fonction de la région corporelle atteinte et la radiographie pulmonaire, réalisée habituellement suite à la détection d’une IDR positive, n’apporte
