UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires

Directeurs de thèse : Dr B. ROBAYE et Pr J.E. DUMONT

Etude des mécanismes de résistance à la mort cellulaire par apoptose induite par le TNF dans la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC).

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Frédéric CLERMONT Année académique 2003-2004

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires

Directeurs de thèse : Dr B. ROBAYE et Pr J.E. DUMONT

Etude des mécanismes de résistance à la mort cellulaire par apoptose induite par le TNF dans la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC).

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Frédéric CLERMONT Année académique 2003-2004

Etude des mécanismes de résistance à la mort cellulaire par apoptose induite par le TNF dans la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC).

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Thhèèssee pprréésseennttééee eenn ssoouutteennaannccee pprriivvééee llee 1111 mmaarrss 22000044 eett eenn ssoouutteennaannccee ppuubblliiqquuee llee 11^erer aavvrriill 22000044 d

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Frédéric CLERMONT

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (I.R.I.B.H.M.), Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (I.B.M.M.),

Université Libre de Bruxelles (U.L.B.).

Remerciements,

Je remercie les professeurs Dumont et Vassart pour m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire.

Je tiens particulièrement à vous remercier Professeur Dumont pour votre enthousiasme et votre optimisme indéfectible.

Bernard, tout les acquis avec lesquels on sort d’une thèse ne viennent que de ceux qui nous les ont enseigné, tout ce que j’en ai gagné, je te le dois. Mais, je dois surtout te remercier d’avoir su garder l’optimisme qui m’a parfois manqué face aux résultats qui n’étaient pas toujours à la hauteur de nos espérances.

A côté du domaine scientifique, je te félicite surtout du courage avec lequel tu as supporté mon humour gaulois et mes vannes à 5 centimes d’euros (=2 balles, en anciens francs). Je ne peux évidemment pas passer à côté du point « musique » : tu m’aura fait découvrir le répertoire d’

interprètes que je n’aurais probablement jamais connu ! J’en profite également pour te rappeler que Maxime adolescent passera nécessairement par une phase hardrock et/ou techno et comme cette musique ne s’apprécie pas en sourdine … bon courage ! Et je n’ai pas parlé des consoles de jeux et autres GSM !

Et tant qu’on y ait, celui qui t’a collé le poisson d’avril 2003 avec lequel tu t’es promené pendant des heures, c’était qui finalement ?

Domi, notre maman du labo, toujours disponible. Merci pour ton éternelle bonne humeur, ton positivisme et tes encouragements.

Je ne pourrais pas relater toutes les anecdotes de moments cocasses, loufoques, délirants, etc … qu’on a vécu tant il y en a eu dans ce labo de fou (ce poisson d’avril dans le dos du chef, c’était qui finalement ?) . De toute façon, il y a des traces cachées un peu partout dans le labo, surtout dans l’appareil photo jetable … tu les retrouveras à ton retour.

Françoise, ta présence aura été comme la douceur d’un vent de printemps sur une plaine

ensoleillée (ça veut rien dire et c’est fait exprès). Merci d’avoir supporté toutes ces gauloiseries

et surtout pardon pour t’avoir fait la victime de tant de vannes …

Il n’empêche, le string vert …

Hakim, nouveau compagnon de fortune ( ?). Je n’insisterai pas sur ta capacité a dévier de certains de nos sujets de conversation à l’entrée de la gente féminine, mais je maintiens que dans ce bâtiment c’est peine perdue ... Et quand ça foire dans les manips, rappelle-toi : « Cinq ans ! ».

Allez,, bonne route $ ^.

Giovanna, plus sur ce continent pour lire ceci.

Yannic, sitôt arrivé, sitôt parti.

Et les nouveaux : Isabelle et François, lâchez-vous, délirez et prenez des photos, le jetable dans le tiroir de Domi sert à ça !

Et tous les autres dans l’ordre des labos pour ne vexer personne :

Groupe Stéphane (pourquoi t’as laissé partir Evelyne ?) : Serge (pourquoi t’as laissé partir Evelyne ?), Evelyne (pourquoi t’es partie ?), Valérie (l’escalade, ça c’est une corde qui manque à mon arc), Sophie (avec moi, ça fait 3 docteurs sur un temps si court … de tennis ( ouah quel vanne !)), Eileen (surveille Hakim lorsque je ne serai plus là), Marianne ( 0 ),,Odile, Céline, Monique (dites, les filles, avez-vous remarqué que Stephane recrute autant de femmes ?), Christophe (tiens ? un mec ? Stéphane a-t-il essayé de donner le change ?) et Yoann (l’humour lourdingue ne va disparaître après moi !).

Groupe Christophe : Bruno (tu ne m’as jamais trouvé de surnom…tant mieux), Gilles (toi non plus, tu ne manque pas d’humour),Reginald (t’es le suivant, j’te mets pas la pression, mais t’es le suivant), et tous les mémorants actuels que je n’ai pas encore eu le temps de bien connaître (et mémorantes passées … pas de commentaires, Hakim !).

Groupe Annick (tu crois vraiment qu’un gars avec le physique de Johnny Deep viendra faire un

mémoire en thérapie génique ?), Jean-Denis (du cor de Roland au projet d’une société privée

pour remonter le capital … l’esprit humain est vraiment très … comment dire ? …

!),

Chiat (why did you pass you dive exam in a swimmingpool? it’s so cool in the Carabian sea),

Charlotte (pourquoi plonger en piscine et dans des carrières glacées?), Bénédicte (j’te jure, je ne suis pas l’allumé que je semble être) et la dernière recrue : Isabelle (rares sont celles qui bénéficient d’un accueil aussi personnalisé) .

Je ne peux évidemment pas oublier de parler d’Erasme où j’y ai faut mes début et nombre d’aortes depuis (peu ragoutantes aux yeux de ceux qui passaient par la salle culture le mardi matin ... faut avouer que juste après le petit dej’ quand on ne s’y attend pas …).

Au début il y a eu un mémoire au 4e : certains et certaines sont partis plus ou moins loin. Il en reste encore quelques uns et unes : Nathalie, Sarah, Fabrice, …

Ensuite, je monte d’un étage. Autre bureau, autre ambiance : Didier (tu m’a démontré que le travail le plus sérieux se contre-balance des plus gros délires … et ne met pas tout sur le dos de Rodolphe, il n’est plus là pour se défendre), et Rodolphe (toujours très fin), Mais le béton a séché à Gosselies (si, si, le chantier était fini, les cailloux c’est pas les déchets c’est la déco !) et me voilà parti laissant de la place à Nath (qui m’avait montré le chemin des abattoirs … la mort du bœuf et son dépeçage de grand matin n’est pas ce qu’il y a de plus magique), Nicole (merci pour le coup de main pour toutes ces aortes à nettoyer et ligaturer) Xavier et Fred (bien vite adaptés à l’ambiance de ce bureau).

Et un énorme remerciement à David (aux discussions scientifiques sur fond d’humour) avec sa machine SM sans qui ces protéines n’auraient pas laissé d’autres traces que des taches sur une autoradiographie …

Et tous les autres (iribhmlist+ibmmlist),, à la croisées des couloirs …

La seule chose que je regrette c’est qu’il y a sûrement dans ce bâtiment IBMM d’autres personnes avec lesquelles je me serait bien entendu, mais que je n’ai jamais rencontré faute d’espace commun …

« La thèse est un long chemin » me disait-on. Effectivement, le compteur kilométrique de ma voiture affiche 130.000 …

Fred.

Ce travail a pu être réalisé grâce au soutien financier du F.R.I.A. (fond pour la recherche en industrie et agriculture), de l’I.R.I.B.H.M. (institut de recherche en biologie humaine et moléculaire) et de la fondation Van Buuren.

RÉSUMÉ...1

ABRÉVIATIONS ...2

INTRODUCTION...3

I. L’APOPTOSE...3

I. 1. Les protéases de la famille caspase. ...4

I. 2. Les protéines de la famille Bcl-2. ...5

I. 3. Les étapes du processus de mort cellulaire par apoptose. ...6

I. 3. 1. L’induction...7

A. Les voies extrinsèques : l’exemple de membres de la superfamille des récepteurs au TNF. ...7

A.1. Les mécanismes de transduction du récepteur Fas...7

A.2. Les mécanismes de transduction du récepteur au TNF...9

A.3. Contrôle des voies de signalisation FASL/FAS et TNF/TNFRI au niveau du récepteur. ...9

B. Les voies intrinsèques : l’exemple des dommages à l’ADN. ...10

I. 3. 2. L’intégration. ...11

A. La perméabilisation mitochondriale membranaire...11

B. La libération des protéines de l’espace mitochondrial inter-membranaire...12

C. La formation de l’apoptosome...12

D. Régulation de la propagation du signal apoptotique. ...13

D. 1. La famille des IAP...13

D. 2. Smac/DIABLO...14

D. 3. HtrA2/Omi...14

I. 3. 3. L’exécution. ...15

A. L’activation des caspases effectrices...15

B. L’activation de nucléases...16

B. 1. Le système ICAD/CAD...16

B. 2. Le facteur AIF. ...16

B. 3. L’endonuclease G. ...17

C. Les modifications membranaires...18

II. LE TNF ET LA CELLULE ENDOTHÉLIALE...19

II. 1. Effets physiologiques du TNF sur les cellules endothéliales...19

II. 2. Activité anti-tumorale du TNF et les cellules endothéliales...19

II. 3. Les voies de signalisation du TNF...20

A. La voie d’activation des kinases de stress p38 et JNK...21

B. La voie d’activation de NF-κB...21

C. La voie d’activation des ERK...22

II. 4. Présentation du modèle expérimental : la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) traitée au TNF. ...22

III. LES PROTÉINES DE LA FAMILLE DES HNRNP. ...24

III. 1. La famille des hnRNP...24

III. 2. La protéine hnRNP K. ...24

III. 3. Implication potentielle de hnRNP K lors de l’apoptose...25

BUT DU TRAVAIL ...26

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS ...28

SECTION 1 : ETUDE DES VOIES DE SIGNALISATION IMPLIQUÉES LORS DES PHASES PRÉCOCES DE L’APOPTOSE PAR L’APPROCHE PHARMACOLOGIQUE. ...28

Résultats et discussion...28

I. Etude des voies activables par le TNF...28

1) La voie NF-κB. ...28

2) La voie des kinases de stress p38 et JNK. ...29

3) La voie des MAP kinases ERK...31

II. Etude d’autres voies kinases potentiellement impliquées lors du processus apoptotique. ...32

1) La voie de la PKA...32

2) La voie des PKC. ...32

3) La voie des PI3K...32

Conclusions de la SECTION 1. ...33

SECTION 2 : ETUDE DES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONELLES DE PROTEINES PAR PHOSPHORYLATION LORS DES PHASES PRECOCES DE L’APOPTOSE PAR UNE APPROCHE PROTEOMIQUE. ...34

Résultats. ...34

I. Comparaison des profils électrophorétiques bidimensionnels (profils 2D-PAGE) de phospho-protéines de BAEC stimulées au TNF+CHX et de CHO-K1 stimulées à la STS. ...35

1) Etude sur les BAEC. ...35

2) Etude sur les cellules CHO-K1. ...36

II. Caractérisation des modifications de phosphorylations observées dans les BAEC en réponse au traitement TNF+CHX. ...37

1) Relation avec l’induction d’apoptose...37

2) Spécificité cellulaire...38

III. Identification des protéines 5 à 7 et 11 à 15...38

1) Identification des protéines 5 à 7. ...40

2) Identification des protéines 11 à 15. ...40

IV. Caractérisation de la diminution de phosphorylation de RIIα dans les BAEC...41

1) Caractérisation de la modification subie par RIIα dans les BAEC...41

2) Etude de la distribution sub-cellulaire de RIIα dans les BAEC...41

3) Etude du rôle potentiel de RIIα dans le processus de mort cellulaire par apoptose des BAEC...42

V. Caractérisation de la diminution de phosphorylation de HDGF dans les BAEC...43

1) Caractérisation de la modification subie par HDGF dans les BAEC ...43

2) Etude de la localisation cellulaire de HDGF...43

3) Etude du rôle potentiel de HDGF dans le processus de mort cellulaire par apoptose des BAEC stimulées au TNF+CHX...45

a) Etude de l’effet de la surexpression d’une protéine chimérique GFP-HDGF lors de l’apoptose des BAEC induite par TNF+CHX. ...45

b) Etude de l’effet de HDGF exogène lors de l’apoptose des BAEC induite par TNF+CHX...45

Discussion et perspectives...46

Conclusions de la SECTION 2. ...53

SECTION 3 : ETUDE DU RÔLE POTENTIEL DE LA PROTÉINE HNRNP K DANS LE CONTRÔLE DU

PROCESSUS APOPTOTIQUE. ...54

Résultats. ...54

I. Obtention de clones surexprimant chaque isoforme de la protéine hnRNP K. ...55

II. Etude de l’effet de la surexpression de la protéine hnRNP K sur l’induction de mort cellulaire des cellules CHO K1 induite par la staurosporine. ...55

III. Analyse de la modification de la protéine hnRNP K lors de l’apoptose des cellules CHO K1 induite par la staurosporine...56

Discussion. ...56

Conclusions et perspectives de la SECTION 3...59

CONCLUSIONS GÉNÉRALES...60

MATÉRIEL ET MÉTHODES...61

I. Cultures cellulaires et traitement des cellules...61

1) Culture des cellules endothéliales bovine (BAEC)...61

2) Culture des cellules CHO-K1. ...61

3) Culture des cellules COS-7...61

4) Culture des cellules U937. ...62

5) Transfection de cellules eucaryotes. ...62

6) Sélection clonale. ...62

II. Mise en évidence de marqueurs associés à la mort cellulaire par apoptose. ...62

1) Inducteurs utilisés. ...62

2) Drogues utilisées...63

3) Quantification de la fragmentation de l’ADN. ...63

4) Mise en évidence de l’exposition des phosphatidyl-sérines au feuillet externe de la membrane plasmique...64

5) Mise en évidence de la libération du cytochrome c dans le cytosol. ...65

6) Dosage de l’activité Caspase-3. ...65

III. Techniques relatives à l’étude des protéines. ...66

1) Dosage protéique par méthode sur filtre en papier. ...66

2) Dosage selon Siekevitz de la radioactivité incorporée aux protéines. ...67

3) Expérience de retard sur gel (NF-κB)...67

4) Electrophorèse de protéines et technique de « western blotting ». ...68

5) Anticorps utilisés. ...69

6) Electrophorèse bi-dimensionnelle de protéines (2D-PAGE)...70

7) Mise en évidence du profil bidimensionnel électrophorétique (2D-PAGE) des phospho-protéines. ...71

8) Révélation des protéines par coloration à l’argent...72

9) Révélation des protéines par coloration au zinc. ...72

10) Purification des phospho-protéines 5 à 7 et 11 à 15. ...72

11) Digestion des échantillons et analyse au spectromètre de masse. ...73

12) Immunofluorescence indirecte...73

13) Dosage de l’AMP cyclique. ...74

14) Test d’activité kinase (PKA)...74

15) Purification de la protéine recombinante HDGF ...75

- par concentration de milieu conditionné...75

- sur colonne de nickel chélaté. ...75

16) Incorporation de [³H]thymidine dans les BAEC. ...76

IV. Techniques relatives à la manipulation de l’ADN. ...76

1) Minipréparation d’ADN plasmidique par la méthode de lyse alcaline...76

2) Construction des vecteurs pcDNA3, pcDNA3.1His et pEGFP contenant la séquence codante de HDGF bovin. ...77

3) Construction de vecteurs pcDNA3.1His contenant la séquence codante des 4 isoformes de hnRNP K humain...78

BIBLIOGRAPHIE ...79

ANNEXES...93

PUBLICATIONS ...99

RE R ES SU U ME M E

Résumé

RÉSUMÉ

Il est maintenant admis que l’activité anti-tumorale du TNF implique une destruction de la vascularisation de la tumeur par induction d’apoptose des cellules endothéliales. Si le traitement au TNF en thérapie humaine permet des rémissions complètes, il n’est applicable qu’aux membres isolés de la circulation systémique car les doses requises de TNF sont létales pour le patient. Mettre en évidence les mécanismes qui contrôlent l’apoptose de la cellule endothéliale devrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques favorisant l’effet thérapeutique du TNF tout en évitant le choc septique qu’il engendre.

Nous avons abordé cette question en utilisant le modèle de la cellule endothéliale d’aorte bovine (BAEC) stimulée au TNF afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent le processus apoptotique et ce au cours des phases précoces de celui-ci.

D’une part, nous avons identifié par une approche pharmacologique au moins trois voies de contrôle négatif d’induction de mort cellulaire par le TNF dans les cellules endothéliales : la première faisant intervenir une des protéines kinases C, une seconde la PI3-kinase et une troisième la protéine kinase p38. Cette dernière semble spécifiquement activée par le TNF et pourrait donc constituer une nouvelle cible pharmacologique visant à sensibiliser les cellules endothéliales de la vascularisation de la tumeur à l’action apoptotique du TNF.

D’autre part nous avons mis en évidence et identifié par une approche protéomique au moins deux protéines montrant une rapide diminution de phosphorylation lorsque les cellules endothéliales sont stimulées par le TNF en présence de cycloheximide. Ces deux événements semblent en aval de l’activation d’une protéase de la famille des caspases. La première protéine est la sous-unité régulatrice de type II alpha (RIIα) de la protéine kinase A. Cependant, la relation entre cette déphosphorylation et le processus d’apoptose n’a pas pu être mise en évidence, une stimulation de l’activité PKA n’affectant pas l’induction d’apoptose des BAEC.

La seconde est la protéine HDGF (« hepatoma-derived growth factor »), connue pour être sur- exprimée dans certains cancers, mais dont la régulation par phosphorylation ainsi que son implication éventuelle lors du processus apoptotique n’avaient encore jamais été envisagées.

Enfin, nous avons voulu mettre en évidence le rôle potentiel de la protéine hnRNP K qui subit une modification post-traductionnelle précoce lors de l’apoptose des BAEC. Notre étude, menée après surexpression de la protéine étiquetée, suggère une modification autre qu’une dégradation.

Cependant, il ne nous a pas été permis de lui attribuer un rôle puisque la surexpression de cette protéine n’affecte pas l’apparition de différents marqueurs associés à l’apoptose.

1

AB A BR R EV E VI IA AT TI IO ON N S S

Abréviations

ABRÉVIATIONS

2D-PAGE : gel d'électrophorèse à 2 dimensions ADN (DNA) : acide désoxyribonucléique

ADNc (cDNA) : acide désoxyribonucléique complémentaire

AIF : "apoptosis inducing factor"

AMPc (cAMP) : adénosine 3',5'-monophosphate cyclique

ANT : translocateur de l'adénine AO : acide okadaïque

AP-1 : “activating protein 1”

APAF : "apoptosis protease-activating factor"

ARN (RNA) : acide ribonucléique

ARNm (mRNA) : acide ribonucléique messager ASK1 : "apoptosis signal-regulating kinase 1"

ATP : adénosine triphosphate

BAEC : cellule endothéliale d’aorte bovine Bcl : "B cell lymphoma"

BH : "Bcl-2 homology"

BIR : "baculovirus IAP repeat"

BSA: albumine de sérum bovin C. elegans : Caenorhabditis elegans CAD : "caspase-activated DNase"

CARD : "caspase recruitment domain"

CDK : kinase dépendante de cycline ced : "C. elegans death"

CHO : lignée cellulaire dérivée d'une cellule ovarienne d'un hamster chinois

CHX : cycloheximide

COS-7 : lignée cellulaire dérivée d'un hépatocyte de singe

CRE : élément de réponse à l'AMPc CREB : "CRE binding protein"

CREM : protéine modulatrice de CREB CTX : toxine cholérique

DAG : 1,2-diacylglycérol db-cAMP : dibutyryl-cAMP DD : "death domain"

DIABLO : "direct IAP-binding protein with very low pI"

DISC :"death-inducing signaling complex"

ERK1/2 (=p44 et p42 MAPK) : "extracellular-regulated kinase 1 et 2"

FADD : "Fas-associated death domain"

FCS : sérum de veau fœtal

FGF : facteur de croissance fibroblastique FLIP : "FLICE-inhibitory protein"

FSK : forskoline

GDP : guanosine diphosphate GFP : "green fluorescent protein"

GTP : guanosine triphosphate

HDGF : "hepatoma derived growth factor"

hnRNP K : "heterogenous ribonucleoprotein K"

HSP27 : protéine de choc thermique de 27 kDa HUVEC : cellule endothéliale de veine de cordon

IAP : "inhibitor of apoptosis protein"

IBM : "IAP-binding motif"

ICAD : inhibiteur de CAD IFN : interféron

IGF-1 : facteur de croissance insuline-like 1 IP3 : inositol 1,4,5-trisphosphate

IPG : "immobilized pH gradient"

IRS: “insuline receptor substrat”

IκB : inhibiteur de NF-κB JNK : "cJun N-terminus kinase"

kb : kilobase kDa : kiloDalton KH : "K homology"

MAP : “mitogen activated protein”

MAPK : "mitogen-activated protein kinase"

MEK : MAPK kinase MS : spectrométrie de masse NF-κB : "nuclear factor -kappa B"

PARP: polyADP-ribose polymérase pb : paire de bases

pI : pH isoélectrique

PI3K : phosphatidylinositol 3- kinase PIP2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PKA : protéine kinase A (dépendante de l'AMPc) PKC : protéine kinase C

PLC : phospholipase C PM : poids moléculaire

PMM : perméabilisation des membranes mitochondriales PtdSer : phosphatidylsérine

RIIα : sous-unité régulatrice de type II alpha de la PKA RIP : "receptor-interacting protein"

RZF : "RING zinc finger"

SDS : sodium dodecyl sulfate SH-2 : domaine 2 d'homologie à src

SIMP : "soluble inter membrane mitochondrial proteins"

Smac : "second mitochondria-derived activator of caspases"

SODD : "silencer of death domains"

STS : staurosporine

TNF : facteur de nécrose tumorale TNF-RI : récepteur de type I au TNF TNF-RII : récepteur de type II au TNF TPA : 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate TRADD : "TNF receptor-associated death domain"

TRAF : "TNF receptor-associated factor"

U937 : lignée de cellules monocytaires UV : rayonnement ultraviolet

VDAC : porine mitochondriale Wo : wortmannine

zVADfmk : N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Lys- fluoromethylkétone

2

IN I NT TR RO OD D UC U CT TI IO O N N

Figure 1 : Représentation schématique des modifications morphologiques se produisant au cours de la nécrose (gauche) et de l’apoptose (droite) (tiré de Kerr et Harmon, 1991).

Figure 2 : Représentation schématique de mécanismes de contrôle de l’apoptose chez C elegans.

CED-9 (l’homologue des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2) en interagissant avec CED-4 (l’homologue de la protéine pro-apoptotique APAF-1), l’empêche d’activer CED-3 (l’homologue de la Caspase- 1/ICE). La mort cellulaire est déclenchée quand la protéine EGL-1 (l’homologue des protéines pro-apototiques de la famille Bcl-2 à domaine BH3) se lie à CED-9 et l’inactive, libérant ainsi CED-4 qui peut alors s’oligomériser avec CED-3 et provoquer son auto-activation.

Introduction

INTRODUCTION

I. L’

.

L’apoptose (étymologiquement « apo » : éloignement et « ptose » : chute) est un processus physiologique de mort cellulaire. Ce terme a été introduit par Kerr et coll. en 1972 (Kerr et al., 1972) pour l’opposer à la mort cellulaire pathologique par nécrose. Il définit une série d’altérations comprenant une condensation cytoplasmique et chromatinienne, un clivage de l’ADN en fragments réguliers d'environ 180 paires de bases, un bourgeonnement de la membrane plasmique et une externalisation de la phosphatydilsérine membranaire (Wyllie et al., 1980), (Wyllie et al., 1984).

Ce processus nécessite la participation active de la cellule qui enclenche donc un mécanisme prédéterminé et ordonné, qui aboutit à la formation de vésicules intactes (les corps apoptotiques) contenant les éléments dégradés de la cellule. Ces vésicules sont phagocytées in vivo par les macrophages ou les cellules voisines. A l’inverse, la nécrose est une mort cellulaire où l'ADN nucléaire est dégradé de manière aléatoire. Cette dernière est une mort cellulaire toujours pathologique et déclenchée par une agression et conduisant au relargage dans le milieu environnant du contenu cytoplasmique générant une réponse inflammatoire.

L’apoptose est un processus essentiel au développement et à l’homéostasie des organismes pluricellulaires, ainsi qu’au bon fonctionnement de leur système immunitaire. Tant le déficit que l’excès d’apoptose peut avoir de sévères conséquences pathologiques. Ainsi, la répression de la machinerie apoptotique est cause de maladies auto-immunes et est associée à de nombreux cancers. A l’inverse, une induction non contrôlée d’apoptose contribue aux maladies neuro- dégénératives (Thompson, 1995).

C’est l’observation et l’étude par le groupe de Horvitz de mutations pouvant prévenir la mort cellulaire chez le nématode Caenorhabditis elegans qui a mis en évidence le contrôle génétique de ce processus et permis la découverte des premiers éléments moléculaires impliqués.

C’est ainsi que furent identifiées les mutations ced-1 et ced-2, qui interfèrent avec la phagocytose des cellules mortes (Hedgecock et al., 1983) et les mutations ced-3 et ced-4 qui bloquent la mort cellulaire au cours du développement (Ellis et Horvitz, 1986). D’autres mutations affectant la mort cellulaire ont été mises en évidence par la suite.

3

Figure 3 : La famille des Caspases.

A l’exception des Caspase-11 (murine), -12 (murine) et –13 (bovine), toutes les autres Caspases sont d’origine humaine. Leur relation phylogénétique (à gauche) semble corrélée à leur fonction dans l’apoptose ou l’inflammation. Les caspases initiatrices et effectrices sont écrites respectivement en mauve et rouge. La position des sites de clivage est indiquée par une flèche. Les quatre boucles (L1-L4) qui forment la poche contenant le site catalytique sont indiquées et le résidu cystéine est représenté par une ligne rouge.

(Tiré de Shi, 2002)

Introduction Les études ultérieures ont permis de déterminer que le produit du gène ced-3 est une protéase à cystéine (Yuan et al., 1993), d’identifier CED-9 comme l’orthologue de la protéine Bcl-2, connue pour être sur-exprimée dans les lymphomes (Hengartner et al., 1992). Depuis, d’autres molécules impliquées dans la réalisation du processus, dans les voies de signalisation ou la phagocytose des cellules mortes (Gumienny et Hengartner, 2001) ont également été mises en évidence.

Si les recherches sur ce nématode ont eu un apport essentiel dans l’étude du processus apoptotique, il est important de noter que C elegans est loin d’être un modèle universel puisque des événements ou éléments importants chez des organismes supérieurs, comme la libération de cytochrome c des mitochondries, les IAP (« inhibitor of apoptosis proteins ») ou des voies extrinsèques, n’y ont pas été identifiés.

Avant de décrire les mécanismes biochimiques contrôlant le processus apoptotique, il est nécessaire pour plus de clarté, de présenter deux familles de protéines exerçant un rôle important dans ce processus : la famille des protéases caspases et celle des protéines apparentées à Bcl-2.

I. 1. Les protéases de la famille caspase.

L’implication de la protéase à cystéine CED-3 dans l’apoptose fut initialement mise en évidence en 1993 par le groupe de Yuan et coll. chez le nématode C elegans (Yuan et al., 1993). Depuis, les travaux qui suivirent démontrèrent le caractère évolutivement conservé du processus apoptotique, exécuté par cette famille de protéases à cystéine (c), dont les membres clivent leur substrat après un résidu aspartate (Asp-X, aspase), ce qui leur a valu le nom de « Caspase ».

14 caspases ont été identifiées chez les mammifères dont on retrouve des orthologues chez le nématode et la drosophile (Lamkanfi et al., 2002). La première caspase identifiée chez les mammifères, Caspase-1 ou anciennement nommée ICE (« Interleukin 1β-converting enzyme ») fut identifiée comme un élément important dans la régulation de la réponse inflammatoire (Cerretti et al., 1992), (Thornberry et al., 1992).

La famille des caspases est généralement subdivisée en deux catégories selon l’étape où elles interviennent au cours du processus (voir plus loin) : les caspases initiatrices, qui regroupent Caspase-2, -8, -9, -10 et -12, caractérisées par un long pro-domaine amino-terminal, et les caspases effectrices, qui regroupent Caspase-3, -6 et -7, caractérisées par un pro-domaine amino- terminal plus court (figure 3).

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Figure 4 : Représentation schématique du mode d’activation des caspases.

La position du premier site de clivage (entre la grande et la petite sous-unité) est indiquée par une flèche large alors que le site additionnel est indiqué par une petite flèche. Le résidu cystéine est représenté par une ligne rouge.

Introduction L’activation des caspases effectrices est réalisée par les caspases initiatrices, alors que l’activation de ces dernières résulte d’une auto-protéolyse. Cette auto-protéolyse se réalise grâce au rapprochement de précurseurs pro-caspases (modèle de proximité (Salvesen et Dixit, 1999)) au niveau de protéines adaptatrices (comme l’exemple de Caspase-8 au niveau du DISC, voir plus loin). L’interaction avec la protéine adaptatrice se fait au niveau du pro-domaine de la pro- caspase. Caspase–8 et –10 contiennent un domaine DED (« death effector domain »), alors que Caspase–2 et –9 contiennent un domaine CARD (« caspase activation and recruitment domain »). Les caspases initiatrices peuvent être activées au niveau des récepteurs à domaine de mort (Caspase-8 et -10), au niveau de la mitochondrie en réponse au changement de potentiel mitochondrial (Caspase-2 et -9) ou au niveau du réticulum endoplasmique, probablement après détection de reploiement anormal des protéines (Caspase-12).

Toutes les caspases sont donc activées par une protéolyse au niveau de lien Asp-X à partir d’un zymogène inactif, ce qui aboutit d’abord à la libération d’une petite sous-unité d’environ 10 kDa et d’une grande sous-unité d’environ 20 kDa portant le site catalytique. Ces sous-unités sont capables de dimériser ce qui est suivi par l’élimination du pro-domaine N-terminal (figure 3 et 4). La caspase fonctionnellement active se constitue d’un tétramère composé de deux petites sous-unités et de deux grandes sous-unités.

Tous les membres de cette famille possèdent un site catalytique comprenant un résidu cystéine (C) localisé dans un motif QACXG. Les caspases actives reconnaissent un motif cible de 4 acides aminés, nommé P4-P3-P2-P1, et clivent après le résidu P1 qui est généralement un aspartate. Le résidu P3 est invariablement une glutamine pour toutes les caspases de mammifères étudiées. Dès lors certains auteurs définissent trois sous-familles sur base de la spécificité de substrat déterminée par la nature du résidu P4 (WEXD (Caspase-1, -4 et –5), DEXD (Caspase-6, -8, -9 et –11) ou [L/V]EXD (Caspase-2, -3 et –7)) (Thornberry, 1997), (Cory et Adams, 1998).

Outre l’activation par (auto)-protéolyse, les caspases voient leur activité régulée par différentes protéines. La description de ces régulations additionnelles sera faite plus loin dans ce chapitre.

I. 2. Les protéines de la famille Bcl-2.

Ces protéines sont les régulateurs agissant au niveau de la mitochondrie. Le premier membre fut initialement découvert sur base de sa surexpression dans le lymphome de cellule B (d’où le nom de Bcl pour « B cell lymphoma »). Cette surexpression inhibe la mort par apoptose de ces cellules tumorales (Tsujimoto et al., 1984).

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Figure 5 : La famille des protéines apparentées à Bcl-2.

Les positions des différents domaines d’homologies BH sont indiquées par les rectangles colorés et celle du domaine carboxy-terminal hydrophobe transmembranaire par le rectangle orange.

(Tiré de Ranger et al., 2001)

Introduction Cette famille est divisée en trois groupes sur base de la présence ou non de 4 courts domaines d’homologie conservés entre les différents membres, baptisés domaines BH (« Bcl-2 homology ») (figure 5). De plus, la majorité des membres disposent d’un domaine carboxy- terminal hydrophobe qui assure l’ancrage membranaire des protéines.

Les membres du 1^er groupe sont anti-apoptotiques (ex : Bcl-2, Bcl-xL) et disposent des 4 domaines BH (BH 1 à 4). Les membres du second groupe sont pro-apoptotiques (ex : Bax, Bak) et ne contiennent pas le domaine BH4. Enfin, les membres du troisième groupe sont également pro-apoptotiques (ex : Bid, Bik) mais ne contiennent que le seul domaine BH3.

Les membres anti-apoptotiques (ex : Bcl-2) sont localisés au niveau de la mitochondrie alors que les membres pro-apoptotiques sont retenus dans le cytosol (ex : Bax, Bid) ou au niveau des microtubules (ex : Bim). Les protéines à domaine BH3 fonctionnent comme des senseurs de l’intégrité cellulaire : Bid au niveau des récepteurs à domaine de mort (Esposti, 2002), Bad en réponse à la déprivation en facteurs de croissance (Datta et al., 1997), Bim au niveau du cytosquelette (Puthalakath et al., 1999).

Les signaux apoptotiques induisent une relocalisation de membres pro-apoptotiques à domaine BH3 vers la membrane externe de la mitochondrie où ils y induisent l’oligomérisation de Bax et Bak. On observe alors la perméabilisation des membranes mitochondriales (PMM) (voir plus loin).

Ces protéines peuvent interagir entre elles en formant des homo- ou des hétéro-dimères via leurs domaines BH. Les protéines pro-apoptotiques à domaines BH3, telles que Bid ou Bad agiraient en neutralisant par dimérisation les membres anti-apoptotiques tels que Bcl-2 ou Bcl-XL. Ainsi, le rapport entre les membres pro- et anti- apoptotiques déterminerait la décision cellulaire à engager ou non la mort par apoptose.

Le niveau d’expression de ces protéines peut être régulé au niveau transcriptionnel (ex : Bax, Noxa, Puma). L’activité est également contrôlée au niveau post-traductionnel par phosphorylation (ex : Bcl-2, Bad) et par protéolyse (ex : Bid) (voir plus bas).

I. 3. Les étapes du processus de mort cellulaire par apoptose.

Dans ce paragraphe, nous décrirons les mécanismes biochimiques impliqués dans la réalisation du processus de mort cellulaire par apoptose ainsi que différents niveaux de contrôle.

L’apoptose peut être définie comme un processus tri-phasique. Le déclenchement (induction) est activé par de nombreux agents et met en place des seconds messagers spécifiques de l’agent

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Introduction inducteur. Ces seconds messagers vont converger vers les mitochondries au cours de la phase de décision (intégration) en augmentant la perméabilité de leurs membranes. Les protéines normalement séquestrées dans l’espace intermembranaire des mitochondries sont alors libérées et enclenchent la dégradation (exécution) cellulaire par l’activation des caspases et de nucléases.

I. 3. 1. L’induction.

Le processus de mort cellulaire par apoptose peut être induit à la demande de l’organisme suite à l’activation de récepteurs membranaires par des stimuli externes à la cellule (on parlera de voies extrinsèques) mais également par la cellule elle-même suite à des perturbations de l’homéostasie intracellulaire décelables au niveau des différents organites (noyau, golgi, réticulum endoplasmique, lysosome) : ce sont les voies intrinsèques d’induction.

A. Les voies extrinsèques : l’exemple de membres de la superfamille des récepteurs au TNF.

Les récepteurs de la superfamille des récepteurs au TNF sont des protéines trans-membranaires de type I. Les récepteurs de cette famille se caractérisent par la présence dans la partie extra- cellulaire de domaines riches en cystéines qui assurent la liaison du ligand. Cette superfamille qui regroupe plus de 30 membres peut être subdivisée en 3 groupes sur base de la séquence cytoplasmique. Seul le premier groupe comprend les récepteurs qui sont capables d’induire l’apoptose (dont Fas et TNF-RI) grâce à la présence d’un domaine intracellulaire, baptisé domaine de mort (DD, « death domain »). Le deuxième groupe comprend les récepteurs contenant un ou plusieurs domaines TIM (« TRAF-interacting motif ») avec lesquels interagissent les protéines de la famille TRAF. Ces dernières assurent l’activation de nombreuses voies de signalisation (telles que les voies activant NF-κB, p38, JNK, ERK ou PI3K). Les membres du troisième groupe ne disposent d’aucun domaine particulier et ne transduisent aucun signal intra-cellulaire, mais ils entrent en compétition avec les membres des deux autres groupes pour la liaison du ligand, constituant donc des récepteurs-pièges (« decoy receptors ») (pour revue : (Locksley et al., 2001)).

A.1. Les mécanismes de transduction du récepteur Fas.

Fas (TNFRSF6/CD95/APO-1) est un membre ubiquitaire de la superfamille des récepteurs au TNF. Celui-ci joue un rôle déterminant dans la régulation physiologique de la mort cellulaire et

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Figure 6 : Représentation schématique des mécanismes de transduction du signal apoptotique suite à l’activation du récepteur Fas.

Introduction est impliqué dans la pathogenèse de nombreuses maladies du système immunitaire (Krammer, 2000).

Il induit l’apoptose suite à l’activation par son ligand naturel Ligand Fas (TNFSF6/FasL/CD95L), molécule transmembranaire de type II, apparentée au TNF, dont l’expression est beaucoup plus restreinte que celle de son récepteur (au niveau des cellules T activées et des « natural killers ») (Suda et al., 1993), (Suda et al., 1995).

En l’absence de FasL, des complexes trimériques de Fas pré-existent sous forme inactive par une interaction au niveau d’un domaine extracellulaire (domaine PLAD) différent du domaine de liaison du ligand (Siegel et al., 2000b). L’interaction avec des FasL membranaires induit une réorganisation de ces complexes homotrimériques et permet la formation du complexe intracellulaire responsable de la transduction du signal apoptotique, le DISC (« death-inducing signaling complex ») (figure 6). Ce complexe est constitué de la protéine adaptatrice FADD (« Fas-associated death domain »)/Mort1 qui s’associe au domaine de mort de Fas. FADD recrute via un autre domaine, baptisé domaine DED (« death-effector domain »), la protéase Caspase-8/FLICE/MACH et/ou Caspase-10 qui s’y lient via leur propre domaine DED. Ces dernières se retrouvent activées et sont alors responsables de l’enclenchement du processus apoptotique.

Deux voies de transduction en aval de Fas sont à distinguer (figure 6). Celles-ci ont été mises en évidence par le groupe de Scaffidi, qui distingue de facto deux types cellulaires (type I et type II) (Scaffidi et al., 1998). Dans les cellules de type I, Caspase-8 est recrutée au niveau du DISC, activée, s’en suit très rapidement un clivage de Caspase-3. Cette voie est indépendante de la voie mitochondriale (voir plus loin) et donc du contrôle par les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. Dans les cellules de type II, il n’y a qu’un très faible recrutement de Caspase-8 au niveau du DISC. L’activation des caspases en aval nécessite une amplification par la voie de la mitochondrie. Caspase-8 clive Bid, un membre de la famille Bcl-2, la forme tronquée de Bid migre après myristoylation (Zha et al., 2000) vers la mitochondrie (Li et al., 1998b). Il s’ensuit la libération du cytochrome c et l’activation consécutive de Caspase-3 (voir plus loin). Dans ce type II, l’induction d’apoptose est sous le contrôle négatif de la protéine Bcl-2.

Fas peut également recruter une autre protéine adaptatrice au niveau du domaine de mort, baptisée DAXX (mais qui ne dispose pas de domaine de mort) et qui interagit avec ASK1 (« apoptosis signal-regulating kinase 1 »), responsable de l’activation de la kinase de stress JNK.

Cette voie contribuerait à l’apoptose induite par Fas en parallèle à la voie FADD-Caspase-8 (Yang et al., 1997).

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Figure 7 : Représentation schématique des mécanismes de transduction du signal apoptotique suite à l’activation du récepteur au TNF.

Introduction Enfin, bien que le système FasL-Fas soit principalement impliqué dans l’induction de mort cellulaire, il peut néanmoins contrôler la prolifération de fibroblastes humains et de cellules T mais par des mécanismes encore peu clarifiés (Krammer, 2000), (Siegel et al., 2000a).

A.2. Les mécanismes de transduction du récepteur au TNF.

Contrairement au système FasL/Fas, le TNF induit l’activation de 2 voies de signalisation aux effets opposés : la première conduit à l’activation et à la synthèse de nombreuses protéines et en particulier des cytokines pro-inflammatoires (cette voie sera décrite au point II.3.) alors que la deuxième voie, que nous décrivons maintenant, conduit à l’apoptose.

En conditions normales, la majorité des cellules sont résistantes à la cytotoxicité du TNF.

Cependant, cette résistance peut être abrogée en bloquant la synthèse protéique, ce qui suggère que les cellules synthétisent des facteurs de survie ou/et que le TNF active à la fois des mécanismes pro- et anti- apoptotiques, ces derniers étant dominants sur les premiers.

L’étape initiale de l’induction d’apoptose implique la liaison du TNF au domaine extra-cellulaire du TNF-RI pré-formé (Chan et al., 2000). Cette liaison entraîne une libération des protéines SODD (« silencer of death domains ») liées aux domaines de mort (Jiang et al., 1999) (figure 7).

Comme pour Fas, le domaine de mort peut alors être reconnu par des protéines adaptatrices.

Mais, à la différence du domaine de mort de Fas, celui du TNF-RI ne recrute FADD que par l’intermédiaire d’une autre protéine adaptatrice, TRADD (« TNF receptor-associated death domain ») (Hsu et al., 1996). FADD est responsable du recrutement de la protéase Caspase-8, ce qui permet son auto-activation et la propagation du signal apoptotique analogue à celui déclenché par Fas. Cependant, il a été suggéré tout récemment que le complexe comprenant TRADD-FADD-Caspase-8 ne soit formé qu’après dissociation du récepteur au TNF (Micheau et Tschopp, 2003). Ce complexe, baptisé complexe II, serait donc cytosolique.

TRADD peut également recruter TRAF2 qui mène à l’activation de la kinase de stress JNK (Reinhard et al., 1997), (Yeh et al., 1997). L’activation soutenue de cette kinase semble nécessaire à l’activation de Caspase-8 (Deng et al., 2003).

A.3. Contrôle des voies de signalisation FASL/FAS et TNF/TNFRI au niveau du récepteur.

La propagation du signal apoptotique subit un contrôle supplémentaire par des protéines de la famille FLIP. Ces protéines appartiennent à la famille des protéines virales v-FLIPs (viral FADD-like interleukin-1-β-converting enzyme (ICE) inhibitory proteins) et sont caractérisées par la présence de deux domaines DED. Dans des cellules transfectées, v-FLIP inhibe l’apoptose induite par beaucoup de récepteurs à domaine de mort (Fas, TNF-RI, TRAMP/DR3, TRAIL-RI).

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Introduction Ces protéines inhibent le recrutement des caspases au niveau du DISC par compétition au niveau du domaine de liaison DED de FADD (Krueger et al., 2001).

c-FLIP (/Casper/I-FLICE/FLAME/CASH/CLARP/MRIT/Usurpin) est l’homologue mammifère de v-FLIP et contient également 2 domaines DED. c-FLIP existe principalement sous 2 isoformes, une forme longue, c-FLIPL, et une forme courte, c-FLIPS résultant de l’épissage alternatif d’un même ARN messager. c-FLIPS ne contient que les 2 domaines DED, alors que c- FLIPL dispose d’un domaine carboxy-terminal supplémentaire qui le rend structurellement similaire à Caspase-8 mais dépourvu d’activité enzymatique (Krueger et al., 2001). Cependant, c-FLIPL contribuerait à l’activation de Caspase-8 par hétérodimérisation (Caspase-8/cFLIPL), alors que la forme courte, c-FLIPS, serait effectivement un inhibiteur de cette protéase (Chang et al., 2002), (Micheau et al., 2002).

B. Les voies intrinsèques : l’exemple des dommages à l’ADN.

L’ADN endommagé est l’initiateur d’apoptose le plus étudié.

Les cassures dans le double brin d’ADN sont détectées par les protéines ATM (« ataxia teleangiectasia mutated ») (Kastan et al., 1992) et DNA-PK (« DNA-dependent protein kinase ») (Lees-Miller et al., 1990), 2 enzymes de la famille des PI3-kinases (Hartley et al., 1995) alors que les dommages induits par les UV sont détectés par la protéine ATR (« ataxia teleangiectasia Rad3 related »). ATM, ATR et DNA-PK phosphorylent p53 sur les résidus sérine en amino- terminal, augmentant son activité transactivatrice et/ou sa stabilité en inhibant son interaction avec la protéine MDM2 (Shieh et al., 1997). Cette dernière est responsable de l’ubiquitination de p53 et donc de sa dégradation par la voie du protéasome (Fuchs et al., 1998).

p53 provoque alors un arrêt du cycle cellulaire et réparation de l’ADN ou l’apoptose selon l’intensité du dommage de l’ADN (Amundson et al., 1998).

p53 induit l’apoptose via la perméabilisation des membranes mitochondriales en transactivant des gènes codant pour :

- des protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 (Bax (Miyashita et al., 1994), Noxa (Oda et al., 2000a) et PUMA (Nakano et Vousden, 2001)) qui migrent à la mitochondrie et y induisent cette perméabilisation membranaire, ainsi que de la protéine Peg3 qui provoque la migration de Bax à la mitochondrie par un mécanisme encore non-élucidé (Deng et Wu, 2000),

- des enzymes mitochondriaux (proline oxidase) qui génèrent localement des espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Donald et al., 2001),

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Figure 8 : Représentation schématique de l’ouverture du PTPC.

Ce complexe multi-protéique est constitué de la porine mitochondriale (VDAC), du translocateur de l’adénine (ANT), de la cyclophiline D (Cph D) et d’un récepteur aux benzodiazépines (BPR).

Introduction - p53AIP1, une protéine de la matrice mitochondriale dont la surexpression induit la diminution de potentiel membranaire (Oda et al., 2000b).

De plus, p53 peut également induire l’apoptose indépendamment de son activité transcriptionnelle (Caelles et al., 1994).

I. 3. 2. L’intégration.

Cette étape du processus apoptotique fait intervenir la mitochondrie. Si cette dernière est indispensable à la production d’ATP nécessaire au bon fonctionnement d’une cellule, elle joue également un rôle central dans le contrôle de l’apoptose. En effet, de nombreux signaux pro- apoptotiques convergent vers cet organite et provoquent la perméabilisation de ces membranes (PMM, perméabilisation mitochondriale membranaire) : la membrane externe devient perméable à nombreuses protéines contenues dans l’espace inter-membranaire mitochondrial (PSIM, protéines solubles inter-membranaires mitochondriales) qui sont dès lors relarguées dans le cytoplasme où elles participent à la propagation du signal apoptotique. La membrane interne (qui retient toujours les protéines de la matrice) voit se dissiper le potentiel transmembranaire mitochondrial (∆Ψm, généré par l’activité des pompes à protons de la chaîne respiratoire).

Les cellules dont le potentiel transmembranaire mitochondrial est dissipé sont irréversiblement engagées dans le processus apoptotique. La perméabilisation mitochondriale membranaire marque donc le point de non-retour du processus de mort cellulaire (Zamzami et al., 1995).

A. La perméabilisation mitochondriale membranaire.

Le mécanisme responsable de cette perméabilisation mitochondriale membranaire (PMM) n’est pas encore clairement élucidé.

Le PMM pourrait résulter de l’ouverture du PTPC (« permeability transition pore complex »), un complexe multi-protéique situé aux points de contact entre la membrane externe et interne de la mitochondrie (figure 8). Le cœur de ce complexe est constitué de la porine mitochondriale (VDAC, « voltage-dependent anion channel ») à la membrane externe, du translocateur de l’adénine (ANT, « adenine nucleotide translocase ») à la membrane interne et de la cyclophiline D dans la matrice. VDAC et ANT peuvent former des pores non-spécifiques et s’ouvriraient suite à l’action d’effecteurs pro-apoptotiques (tels que le Ca²⁺, les espèces réactives de l’oxygène (ROS), un faible ∆Ψm ou Bax). Cette ouverture provoquerait la dissipation du ∆Ψm et une perméabilité de la membrane interne aux molécules inférieures à 1500 daltons. Le gonflement de la matrice mitochondriale suite à la rentrée d’eau et de solutés provoquerait la rupture de la

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Figure 9 : Représentation schématique de la formation de l’apoptosome.

Introduction membrane externe (Marzo et al., 1998), (Crompton, 1999). Ce modèle est principalement étayé par l’effet des inhibiteurs spécifiques (l’acide bongkrékique ou la cyclosporine A)/d’agents pharmacologiques (l’atractyloside) qui bloquent/favorisent le gonflement de la matrice et l’apoptose.

B. La libération des protéines de l’espace mitochondrial inter-membranaire.

L’espace inter-membranaire mitochondrial contient une centaine de protéines différentes. La perméabilisation mitochondriale membranaire provoque la libération de ces protéines dans le cytoplasme. Seul le rôle de certaines d’entre-elles a pu être démontré.

Le cytochrome c est la première protéine pour laquelle la libération dans le cytosol et son implication dans la propagation du signal apoptotique ont été démontrés (Liu et al., 1996).

Parmi les autres protéines présentes dans l’espace intermembranaire, on retrouve certaines pro- caspases (Caspase-2, -3 et -9) (Mancini et al., 1998), (Krajewski et al., 1999), (Susin et al., 1999a). Après induction du processus apoptotique, ces caspases relarguées dans le cytosol participent certainement à l’amplification du processus. La séquestration des pro-caspases, et de la pro-Caspase-9 en particulier, dans l’espace inter-membranaire pourrait constituer un mécanisme supplémentaire de contrôle de l’activation des caspases. Néanmoins, la présence de ces pro-caspases dans l’espace intermembranaire de la mitochondrie est controversé (van Loo et al., 2002).

D’autres protéines comme Smac/DIABLO, l’endonucléase G et AIF participent également à l’apoptose après libération dans le cytosol, leur mode d’action sera décrit plus bas.

C. La formation de l’apoptosome.

Le cytochrome c (cyt c) joue un rôle important dans la phosphorylation oxydative comme transporteur d’électron entre le complexe III (activité cyt c reductase) et IV (activité cyt c oxydase) de la chaîne respiratoire située à la membrane interne de la mitochondrie. Les stimuli apoptotiques induisent la libération du cytochrome c dans le cytosol chez les mammifères. Le cytochrome c se lie à APAF-1 en présence de dATP ou d’ATP, cette liaison provoque une modification conformationnelle de APAF-1 qui permet la liaison de pro-Caspase-9 via leurs domaines CARD (« caspase recruitment domain ») respectifs (Li et al., 1997) (figure 9). Ce complexe, baptisé apoptosome, est heptamérique (Cain et al., 2000), (Acehan et al., 2002).

Caspase-9 peut alors homodimériser et va enclencher la cascade de caspases (Pan et al., 1998).

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Figure 10 : Représentation schématique de la propagation du signal apoptotique.

Figure 11 : Représentation schématique des membres de la famille des IAP.

(Tiré de Liston et al., 2003)

Introduction Il est important de noter que la formation de l’apoptosome n’est certainement pas un événement indispensable au processus apoptotique (cf mort cellulaire de type I), mais constitue le mécanisme d’amplification de la cascade de caspases.

D. Régulation de la propagation du signal apoptotique.

La caspase initiatrice Caspase-9 mais aussi les caspases effectrices Caspase-3 et -7 (voir plus loin) sont inhibées par une famille de protéines présentes dans le cytosol, les IAP (« inhibitor of apoptosis protein »). Cette inhibition est levée par la libération de l’espace mitochondrial inter- membranaire des protéines Smac/DIABLO et HtrA2/Omi qui se lient à ces IAP (figure 10).

D. 1. La famille des IAP.

Chez les mammifères, les membres de la famille des IAP (« inhibitor of apoptosis protein ») se caractérisent par la présence d’un ou plusieurs domaines BIR (« baculovirus IAP repeat ») (figure 11). Ce domaine a été initialement découvert dans la protéine p35 du baculovirus. Ce dernier a la capacité d’inhiber l’apoptose de la cellule infectée (Clem et al., 1991).

Les IAP se lient aux caspases actives Caspase-9, -3 et -7 via des domaines BIR spécifiques (Deveraux et al., 1999). Cette liaison inhibe Caspase-3 et -7 par bloquage du site actif de ces protéases, alors que l’inhibition de Caspase-9 semble médiée par une modification conformationnelle de celle-ci.

Les IAP disposent également d’un domaine RZF (« RING zinc-finger ») qui exerce une activité E3 ubiquitine ligase. Le mécanisme régulant l’activité du domaine RING reste peu connu. Il a d’abord été montré que XIAP et cIAP1 provoquent leur auto-ubiquitination et la dégradation en réponse aux stimuli apoptotiques (Yang et al., 2000). Il a ensuite été montré que XIAP et cIAP2 ubiquitinent Caspase-3 et Caspase-7 (Huang et al., 2000), (Suzuki et al., 2001b), suggérant une dégradation des caspases par la voie du protéasome. Puis, il a été montré que XIAP, cIAP1 et cIAP2 ubiquitinent Smac, un inhibiteur des IAP (MacFarlane et al., 2002), (Hu et Yang, 2003), suggérant que ces IAP provoquent la dégradation de leur inhibiteur. Il semble donc que la domaine RZF puisse contribuer à l’activité anti-apoptotique des IAP, mais également à antagoniser leur propre activité.

L’activité anti-apoptotique des IAP peut être antagonisée par une variété de protéines non- apparentées (Smac/DIABLO et HtrA2/Omi chez les mammifères (voir plus bas), Reaper, Hid, Sickle et Grim chez la drosophile) qui partagent seulement un motif amino-terminal impliqué dans la liaison aux IAP, baptisé motif IBM (« IAP-binding motif »). Cette liaison aux IAP libère alors les caspases. De plus, chez la drosophile, différents groupes ont montré que les protéines

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Introduction Reaper et Grim induisent l’auto-ubiquitination et dégradation consécutive de DIAP1 après libération des caspases (Holley et al., 2002), (Yoo et al., 2002). Ceci pourrait constituer un mécanisme qui préviendrait toute ré-association éventuelle IAP-caspase.

En plus de la dégradation, Reaper et Grim induisent également une baisse du niveau de DIAP1 par un blocage de la synthèse protéique, donc indépendamment de la liaison à DIAP1 (Yoo et al., 2002).

Enfin, il est fort probable que les IAP jouent d’autres rôles biologiques. Ainsi Survivin n’est exprimée qu’à la transition G2/M du cycle cellulaire et est présente uniquement dans le noyau.

Elle semble plutôt jouer un rôle important lors de la mitose dans la ségrégation des chromosomes (Li et al., 1998a), (Altieri, 2003).

D. 2. Smac/DIABLO.

Smac (« second mitochondria-derived activator of caspases ») (Du et al., 2000)/ DIABLO (« direct IAP-binding protein with very low pI ») (Verhagen et al., 2000) agit comme dimère et est relargué lors de l’apoptose dans le cytosol à partir de l’espace intermembranaire mitochondrial en même temps que le cytochrome c (figure 10). Cependant, la libération semble nécessiter l’activation de caspases, suggérant que la libération de Smac/DIABLO soit en aval de celle du cytochrome c (Adrain et al., 2001).

Ce facteur libère les caspases en se liant aux IAP, sa séquence amino-terminale se lie aux domaines BIR2 et 3 des IAP masquant le site de liaison des IAP aux caspases (Du et al., 2000).

Les souris invalidées pour Smac/DIABLO ne présentent aucun phénotype, les fibroblastes embryonnaires de ces souris répondent normalement à un large spectre de stimuli apoptotiques et les cellules B et T activées présentent une prolifération et une survie normale, suggérant l’existence d’un mécanisme de compensation (potentiellement rempli par le protéine HrtA2/Omi) (Okada et al., 2002).

D. 3. HtrA2/Omi.

En utilisant XIAP comme proie, quatre groupes ont identifié simultanément HtrA2/Omi et ont montré son rôle inhibiteur des IAP (Suzuki et al., 2001a), (Verhagen et al., 2002), (Martins et al., 2002), (Hegde et al., 2002).

HrtA2/Omi appartient à la famille des protéases à sérine et est homologue à l’endoprotéase bactérienne HtrA (« high temperature requirement »). Dans les cellules humaines, HtrA2/Omi est confiné à l ‘espace inter-membranaire mitochondrial. En réponse à différents agents apoptotiques, HrtA2/Omi est relargué dans le cytosol (Suzuki et al., 2001a), (Verhagen et al.,

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Figure 12 : Représentation schématique de l’activation de la cascade de caspases.

Introduction 2002), (Martins et al., 2002), (Hegde et al., 2002) où elle se lie aux IAPs de manière similaire à Smac/DIABLO (figure 10). Elle favorise de ce fait l’activation des caspases.

Si Smac/DIABLO et HtrA2/Omi présentent des caractéristiques communes (localisation et mode d’action), ils diffèrent dans leur structure et par leur distribution tissulaire. Enfin, la surexpression de HtrA2/Omi dans le cytosol induit une forme particulière de mort cellulaire sans protubérances ni formation de corps apoptotiques (l’intégrité de la membrane plasmique est préservée) et ce aussi bien en présence d’inhibiteurs de caspases que dans des cellules APAF-1^-/- et Caspase-9^-/- (Hegde et al., 2002). Cette mort cellulaire est médiée par son domaine sérine protéase (Verhagen et al., 2002).

Ainsi, HtrA2/Omi favorise la mort cellulaire via deux mécanismes différents, le premier implique une inhibition des IAP et cause une augmentation de l’activité caspase et le second dépend de son activité protéase et est indépendant des caspases (Suzuki et al., 2001a), (Hegde et al., 2002).

I. 3. 3. L’exécution.

Cette dernière phase du processus apoptotique voit se réaliser la dégradation cellulaire par l’activation principalement des protéases caspase et de nucléases. Ceci aboutit à la formation de vésicules intactes (les corps apoptotiques) contenant les éléments dégradés de la cellule. Ces vésicules sont phagocytées in vivo par les macrophages ou les cellules voisines.

A. L’activation des caspases effectrices.

Caspase-9, activée au niveau de l’apoptosome (voir plus haut), va permettre l’activation par clivage en cascade des caspases effectrices (figure 12) (Slee et al., 1999).

Une fois activées, les caspases effectrices vont cliver un grand nombre de protéines cibles, entraînant une perte ou un gain de fonction de ces protéines et menant ainsi à la réalisation du processus de mort cellulaire. Parmi les caspases effectrices, Caspase-3 est responsable de la majorité des altérations observées durant la phase d’exécution (Slee et al., 2001).

Parmi les substrats connus (plus de 200), on trouve des protéines régulatrices comme la DNA- PK et la PARP-1 (clivage entraînant l’inhibition de ces protéines), des inhibiteurs de désoxyribonucléases comme ICAD, l’inhibiteur de la DNase CAD (« caspase-activated DNase »), ce qui permet l’activation de l’activité catalytique (clivage entraînant l’activation le protéine par libération de son inhibiteur), d’autres protéines pro-apoptotiques comme les

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Figure 13 : Représentation schématique des mécanismes de la dégradation des acides nucléiques.

Introduction caspases (clivage partiel entraînant l’activation) et des éléments structuraux comme l’actine, la fodrine, la gelsoline et la lamine nucléaire (clivage entraînant l’altération des propriétés de polymérisation).

B. L’activation de nucléases.

B. 1. Le système ICAD/CAD

La dégradation de l’ADN aux sites internucléosomiques est le marqueur d’apoptose le plus utilisé.

L’incubation d’extraits cellulaires avec une caspase générait un facteur qui fragmentait l’ADN et qui fut nommé CAD (« Caspase-Activated DNase ») (Enari et al., 1998). Simultanément, deux autres groupes font la même découverte et nomment respectivement ce facteur DFF-40 (« DNA fragmentation factor ») (Liu et al., 1998) et CPAN (Halenbeck et al., 1998).

CAD est une DNase séquestrée dans le cytoplasme par son inhibiteur ICAD (DFF-45). ICAD assure en plus une fonction de protéine chaperonne puisqu’il doit être présent dans le cytoplasme pour assurer le reploiement correct de CAD (Enari et al., 1998), (Sakahira et al., 2000). De cette manière, les cellules expriment CAD comme un enzyme inactif complexé avec ICAD. Les stimuli apoptogéniques activent Caspase-3 qui clive l’inhibiteur ICAD. CAD libéré migre dans le noyau et y clive l’ADN en fragments de faible poids moléculaire (Sakahira et al., 1998) (figure 13).

Une lignée déficiente pour CAD n’est pas affectée pour le clivage de haut poids moléculaire, ni pour la condensation de la chromatine (Samejima et al., 2001) et la condensation nucléaire s’observe toujours dans des cellules exprimant une ICAD non-clivable par Caspase-3, suggérant l’implication d’autres facteurs dans le clivage de l’ADN lors de l’apoptose (tels que AIF et l’endonucléase G).

B. 2. Le facteur AIF.

AIF (« apoptosis inducing factor ») est une flavoprotéine (lie le FAD) présente en conditions normales dans l’espace intermembranaire mitochondrial. Suite à un signal apoptogénique, AIF migre de la mitochondrie vers le noyau (figure 13) et engendre la condensation chromatinienne à la périphérie du noyau et le clivage de l’ADN en fragments de haut poids moléculaire (50 kDa) (Susin et al., 1996).

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Introduction L’étude des souris dont le gène codant pour AIF a été invalidé suggère un rôle essentiel lors de l’apoptose durant la cavitation des corps embryonnaires et montre une réduction de l’apoptose des cellules embryonnaires souches induites par une déprivation en sérum (Joza et al., 2001).

Le mécanisme par lequel AIF exerce son effet cytotoxique n’est pas élucidé, il est indépendant des caspases, ne dépend pas de son activité oxydo-réductase (Miramar et al., 2001), mais il est bloqué par la sur-expression de Bcl-2 (Susin et al., 1996), (Susin et al., 1999b), (Daugas et al., 2000). Enfin, AIF ne dispose pas d’activité nucléase intrinsèque.

Cependant, AIF micro-injecté dans le cytoplasme de cellules intactes induit l’apparition des marqueurs d’apoptose comme la dissipation du ∆Ψm, l’externalisation des phosphatidylsérines et la fragmentation de l’ADN (Susin et al., 1999b), (Ferri et al., 2000), (Loeffler et al., 2001) alors que la microinjection d’anticorps dirigés contre AIF abolit la libération du cytochrome c et l’activation consécutive des caspases dans les cellules Rat-1 traitées à la staurosporine et les cellules HeLa stimulées par le complexe glycoprotéique de HIV-1, suggérant que AIF soit en amont de la voie cyt c-APAF-caspase-CAD (Susin et al., 1999b), (Ferri et al., 2000).

B. 3. L’endonuclease G.

L’endonucléase G (Endo G) est une nucléase mitochondriale. Récemment, Li et coll. ont montré que Endo G est relarguée dans le cytosol et migre dans le noyau où il engendre un clivable internucléosomal de l’ADN. Ce phénomène n’est pas affecté par les inhibiteurs de caspases (Li et al., 2001) (figure 13). Un autre groupe a montré que Endo G clive à la fois l’ADN en hauts poids moléculaires et en faibles poids moléculaires, mais de manière séquentielle et en coopération avec l’exonucléase et la DNase I (Widlak et al., 2001).

Cette nucléase semble importante dans le processus de mort cellulaire puisque le nématode C elegans déficient pour CPS-6, l’homologue de Endo G, possède des cellules excédentaires (Parrish et al., 2001). De plus, CPS-6 agit en synergie avec WAH-1 (l’homologue de AIF) (Wang et al., 2002).

Dès lors, il semble que AIF et Endo G fassent partie d’une voie parallèle à celle des caspases dans la dégradation de l’ADN. Cette voie pourrait être importante lorsque l’activation de ces protéases est entravée comme lors d’infections virales. Cependant, les données de Arnoult et coll. contredisent ce modèle, en effet leurs données suggèrent que la libération de AIF et Endo G soit en aval des caspases, et donc dépendant de ces dernières (Arnoult et al., 2003).

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