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Université Libre de Bruxelles Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences Faculté des Sciences

Recherche de partenaires protéiques du facteur de transcription HRT1 par la technique du double-hybride :

Identification de BOIP, nouvel ADNc codant une protéine interagissant avec le domaine Orange de HRT1

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Reginald Van Wayenbergh Reginald Van Wayenbergh

Promoteur :

Promoteur : Dr D. Christophe Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (I.R.I.B.H.M.)

Co-Promoteur : Dr E. J. Bellefroid Laboratoire d’Embryologie Moléculaire

Année Académique 2004-2005

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Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Recherche de partenaires protéiques du facteur de transcription HRT1 par la technique du double-hybride :

Identification de BOIP, nouvel ADNc codant une protéine interagissant avec le domaine Orange de HRT1

Reginald Van Wayenbergh

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM), Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (IBMM)

Thèse présentée en soutenance privée le 20 octobre 2004 et en soutenance publique le 16 décembre 2004

Composition du jury :

Président Prof. V. Stalon Institut de Recherches Microbiologique J.M. Wiame, CERIA, Faculté des Sciences, ULB

Secrétaire Prof. G. Huez Laboratoire de Chimie Biologique, IBMM, Faculté des Sciences, ULB

Promoteur : Dr D. Christophe Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire, IBMM, Faculté de Médecine, ULB

Co-Promoteur : Dr E. Bellefroid Laboratoire d’Embryologie Moléculaire, IBMM, Faculté des Sciences, ULB

Examinateur Dr E. Dubois Institut de Recherches Microbiologique J.M. Wiame, CERIA, Faculté des Sciences, ULB

Examinateur Dr C. Van Lint Laboratoire de Chimie Biologique - Service de Virologie moléculaire (HIV-BLV-HPV), IBMM, Faculté des Sciences, ULB

Expert de la faculté Prof. R. Herzog Service de Bioinformatique, IBMM, Faculté des Sciences, ULB

Expert de la faculté Dr L. Droogmans Institut de Recherches Microbiologique J.M. Wiame, CERIA, Faculté des Sciences, ULB

Expert extérieur Prof. M. Muller Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génie

Génétique, Département des sciences de la vie, Faculté

des Sciences, ULg

(3)

Remerciements

Je voudrais tout d’abord remercier les Professeurs J.E. Dumont et G. Vassart de m’avoir accueilli dans leur laboratoire ainsi que pour leurs questions pertinentes et conseils avisés lors des séminaires et de nos entretiens.

Daniel, merci de m’avoir acceuilli dans ton équipe pendant un peu plus de quatre ans. Tu m’as beaucoup apporté pendant ce temps. Tu m’as transmis ton savoir, ton art des contrôles et ta rigueur scientifique. Tu m’as toujours poussé dans mes derniers retranchements et prouvé que l’on pouvait toujours se dépasser.

Christiane, merci, pour ta disponibilité et tes conseils.

Bruno, c’est toi qui m’as proposé de venir à l’IRI et de participer au projet bc8. Pendant les deux premières années de la thèse, tu m’as préparé à avancer dans l’aventure bc8 et à la terminer.

Gilles, merci pour les éclats de rire et les discussions tous azimuts.

Un grand merci aux chercheurs et membres passés ou présents de l’IRIBHM de Gosselies que ce soit pour leur apport scientifique, leur aide technique ou leur soutien moral :

* l’équipe de Stéphane : Stéphane (merci pour ton aide lorsque j’ai dû manipuler les souris), Sophie (bonne continuation à LA), Evelyne (partie vers de nouveaux cieux), Valérie (dit Pouic-Pouic, toujours prête à aider, tu n’as pas été guide ???), Odile (Mais qu’est-ce que ça veut bien dire O.D.I.L. ? private joke), Eileen (toujours prête à proposer une sucrerie), Marianne (STP, Attends que je sois parti pour faire sauter le labo), Monique (déjà dans ta deuxième année, ça va vite !!!!!), Céline (merci pour l’aide lors des séquençages), Serge (ne martyrise pas trop tes étudiants :p ), Christophe (ne t’inquiète pas tu finiras par trouver), Yoann (entre tes gardes et ta recherche au labo, tu as toujours le mot pour rire) ;

* celle de Bernard : BOBO (eh oui, je t’appellerai par ce sobriquet jusqu’à la fin), Dominique (surnommée Minidou, merci pour tes coups de main), Fred (fais gaffes aux

(4)

américaines et à la gente féminine que tu croiseras à San Fransico, merci pour les moments déconnades pendant lesquels nous étions pratiquement les seuls à se comprendre), Hakim (partenaire des week-ends de labeur à Gosselies), Isabelle (nouvelle recrue de la BOBO-Team) ;

* celle d’Annick : Annick ( Merci pour tes conseils), Chiat (Thank you for your kindness and support, you are the next), Charlotte (Cha-Cha, quand vas-tu remplir l’appareil à bonbons !!!!!!), Bénédicte (partie pour l’IMI) et Isabelle (tu es au début d’une belle épopée, courage). Merci à Jean-Denis qui lors de ces passages au 3ème étage de l’IBMM, apportait une ambiance assez spéciale au labo.

Marie-Jeanne, merci pour la vaisselle propre tous les jours, les commandes rapides et ton soutien (désolé pour les quantités importantes de verreries à laver les lundis).

Cathy et Joëlle, merci pour votre aide administrative.

Un grand merci aux personnes qui m’ont permis d’évoluer dans la connaissance des levures et du système double-hybride : Isabelle Pirson (IRIBHM), David Pérez-Morga (Parasitologie Moléculaire), Hubert Renauld, Mohamed El Bakkoury (Physiologie moléculaire de la cellule) et Stephan Vissers (Physiologie moléculaire de la cellule)

Mes plus sincères remerciements aux membres du laboratoire d’Embryologie Moléculaire que ce soit pour leur accueil, leur apport scientifique ou leur soutien opportun : Eric (merci de m’avoir permis de sacrifier autant de xénope sur l’autel de BOIP), Vincent, Katia, Flavio, Sadia, Fred, Claude, Angela. Merci également aux membres du laboratoire de Jean-Christophe Marine : Sarah, Ludivine, Alain et Gilles (tu as changé de labo pour avoir le double de remerciements, avoue !).

Un énorme merci à Edwige et Sarah pour leur soutien, leur aide pour la bibliographie (certains articles sont durs à trouver) et leurs conseils lors de la rédaction du manuscrit à la bibliothèque de l’IBMM.

(5)

Merci à Françoise, semi-expatriée du laboratoire de chimie-biologique chez Eric tout comme moi, pour nos discussions et soutien mutuel. Ne t’inquiètes pas tu es presque à la fin.

Merci à tous ceux de l’IBMMList et de l’IRIBHMList qui d’une façon ou d’une autre m’ont permis d’arriver à la fin de ce travail.

Je remercie mes amis qui ont compris mes choix et ne m’ont pas tenu rigueur de mon éloignement pendant ces dernières années.

Un merci particulier à ma famille : mes parents, vous m’avez permis d’entamer les études que je souhaitais et soutenu depuis ; mes plus profonds remerciements vont à mes beaux-parents Arlette et Ugo, pour leur soutien, leurs conseils et les rechargements de batteries du week-end et des rares vacances que nous avons partagées.

La plus grande récompense devrait t’être décernée, Murielle. Toi qui partages, depuis quatre ans et demi (six mois, ça compte), mes sacrifices, mes angoisses et mes réussites. Ton soutien et ton amour m’ont permis de tenir jusqu’au bout. Maintenant que cette étape est franchie, nous pouvons récolter ce que nous avons semé et passer à la suite.

Manuel du double- hybride, si ça pouvait être aussi facile

(6)

Ce travail a pu être réalisé grâce au soutien financier du « Fond pour la Recherche dans

l’Industrie et l’Agriculture » (F.R.I.A.) et de l’Institut de Recherche en Biologie Humaine et

Moléculaire (I.R.I.B.H.M.).

(7)

Table des Matières

Table des Matières

Résumé………...V Abréviations……….VI

I. Introduction………1

I.A. La chromatine et les modifications des histones……….1

I.B. Le complexe basal de transcription………..…4

I.C. Les facteurs de transcription régulateurs : Principaux domaines………4

I.C.1. Les motifs de liaison à l’ADN………5

I.C.2. Les domaines régulateurs………5

I.C.3. Les co-facteurs : une aide dans l’activité transcriptionnelle………...6

I.D. Modèle de la régulation transcriptionnelle……….7

I.E. Les facteurs de type bHLH….………..8

I.E.1. Les différentes familles bHLH………..………..8

I.E.2. Liaison à l’ADN et le domaine bHLH………9

I.F. Les bHLH-O ou les Hairy and Enhancer of Split related family………11

I.F.1. Structure des bHLH-O et le domaine Orange………...12

I.F.2. HES………13

I.F.2.a. Induction des HES……….14

I.F.2.b. Fonctions biologiques, cibles et partenaires………15

Neurogenèse………...15

Somitogenèse………..17

Myogenèse………..18

I.F.3. HRT………...18

I.F.3.a. Induction des HRT……….19

I.F.3.b. Fonctions biologiques, cibles et partenaires………20

Système cardiovasculaire………...20

Myogenèse………..21

I

(8)

Table des Matières

Neurogenèse………...22

But du travail………...23

II. Résultats et discussion..………..24

II.A. Criblages double-hybride en levures...………...24

II.A1. Les clones de levure exprimant les appâts XHRT1………..24

II.A.2. La banque d’ADNc d’embryons de xénope au stade neurula……….26

II.A.3. Les criblages double-hybride………..27

II.A.3.a. Domaines bHLH et Orange………27

II.A.3.b. Motif TEIGAF………...30

II.A.3.c. Partie IYT………..31

II.B. Protéine de type bHLH-O………35

II.B.1. Interaction XHairy1 / XHairy 2b avec XHRT1………..35

II.B.2. Homodimérisation de XHRT1……….37

II.C. BOIP (bc8 Orange Interacting Protein)…………...………..40

II.C.1. Analyse des séquences nucléiques et protéiques……….40

II.C.2. Expression de BOIP chez le xénope et la souris………..…………42

II.C.3. Interaction BOIP-HRT..………..….43

II.C.3.a. Interaction BOIP-HRT chez le xénope… ……….43

II.C.3.b. Interaction BOIP-HRT chez les mammifères……….47

II.C.4. Homodimérisation de BOIP………..…..49

II.D. GPS2 et AES……….50

II.D.1. GPS2………50

II.D.2. AES………..51

III. Conclusions et perspectives ……….53

Annexes….……….i

A1. Matériel et Méthodes………..………i

A1.1. Techniques liées à la manipulation d’ADN………...i

II

(9)

Table des Matières

A1.1.a. Plasmides utilisés………..i

Plasmides d’expression en levure………ii

Plasmides d’expression en lignée cellulaire……….ii

A1.1.b. Minipréparation d’ADN plasmidique par lyse alcaline………...ii

A1.1.c. Minipréparation d’ADN à partir de culture de levure………iii

A1.1.d. Préparation de la banque d’ADNc d’embryons de xénope au stade neurula……….………...iii

A1.1.e. Préparation d’une sonde ADN hexamère radioactive………..v

A1.1.f. Criblage d’ADN sur bactérie……….vi

A1.1.g. Séquençage………..vii

A1.2. Techniques liées à la manipulation d’ARN………....vii

A1.2.a. Extraction d’ARN d’embryons ou de tissus de xénope ou de souris…………vii

A1.2.b. Extraction d’ARN de levure………viii

A1.2.c. Analyse par transfert de type Northern………viii

A1.2.d. Transcription Reverse suivie de réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). ……….………..ix

A1.2.e. Analyse par protection à la RNase (RPA)………x

A1.3. Techniques liées à la manipulation des protéines……...……….xi

A1.3.a. Extraction de protéines………..xi

A1.3.b. Immunoprécipitation par anticorps anti-Flag………...xi

A1.3.c. Analyse par transfert de type Western…..……….xii

A1.4. Culture et manipulation de bactéries………...xii

A1.4.a. Culture sur milieu solide ou liquide...………xii

A1.4.b. Préparation de bactéries électrocompétentes……….xiii

A1.4.c. Transformation de bactéries par électroporation………..………xiii

A1.5. Culture et manipulation de levures………xiv

III

(10)

Table des Matières

A1.5.a. Culture sur milieu solide ou liquide………..xiv

A1.5.b. Transformation de levure par la méthode d’acétate de lithium……….xiv

A1.5.c. Conjugaison de levures……….xv

A1.5.d. Double-hybride de levure………xvi

Test de sélection par les gènes rapporteurs………..…….xvi

Criblage double-hybride………..….xvii

A1.6. Manipulation de lignées cellulaires……….…xviii

A1.6.a. Culture.….………xviii

A1.6.b. Transfection transitoire……….xviii

A1.7. Bioinformatique………...xviii

A2. Bibliographie………....xx

A3. Publications………...xxxviii

IV

(11)

RESUME

(12)

Résumé Résumé.

Un nouveau facteur de transcription, appartenant à la famille des protéines à domaine bHLH, a récemment été isolé dans notre laboratoire. Initialement appelé « clone bc8 » puis HRT1, ce facteur présentait des similitudes avec les protéines Hairy and Enhancer of split qui interviennent notamment dans le phénomène d’inhibition latérale lors de la formation du tissu neural. Des études d’hybridation in situ réalisées chez l'embryon de xénope ont suggéré un rôle important de XHRT1, la protéine HRT1 de xénope, dans le développement neural. Nous avons recherché les partenaires protéiques de XHRT1 par la technique du double-hybride afin de mieux comprendre son mécanisme d’action moléculaire dans la neurogenèse.

Tout d’abord nous avons construit les outils appropriés pour l’élaboration du travail, à savoir, les clones de levures exprimant les appâts spécifiques des domaines de la protéine étudiée et la création d’une banque d’ADNc du xénope au stade de la neurulation. Ensuite, trois criblages ont été réalisés. Dans le premier cas, nous avons recherché les partenaires des domaines bHLH et Orange (bHLH-O). Le domaine bHLH est en effet responsable de la dimérisation de ce type de protéine. Le domaine Orange qui suit le domaine bHLH, pourrait participer dans le choix du partenaire d’hétérodimérisation. Nous avons isolé deux facteurs de type bHLH-Orange apparentés à HRT1, XHairy1 et XHairy2b et confirmé leur interaction avec XHRT1. Les domaines impliqués dans ces interactions sont les bHLH-O pour les trois facteurs. Ce même criblage nous a permis d’isoler un nouvel ADNc qui code une protéine sans domaine apparent connu actuellement. Nous avons montré que cette protéine reconnaissait spécifiquement le domaine Orange de HRT1 mais pas celui des autres facteurs de type bHLH-O. Elle a été baptisée BOIP pour Bc8 Orange Interacting Protein. Le rôle physiologique de cette interaction n’a pu être démontré. Nous avons établi que la protéine BOIP pouvait aussi s’homodimériser. Nous avons aussi déterminé son profil d’expression chez le xénope et la souris. Son transcrit est hautement présent dans les testicules adultes. La protéine pourrait donc jouer un rôle important dans la spermatogenèse. Les deux autres criblages, utilisant les domaines situés dans la partie C-terminale de XHRT1, ont apporté des nouveaux partenaires potentiels, mais ces interactions n’ont pu être confirmées dans un système indépendant.

Enfin, en étudiant plus en détail les interactions entre XHRT1 et XHairy1 ou XHairy2b, nous avons mis à jour une possible fonction de spécificité dans le choix du partenaire dans la région C-terminale de HRT1. La formation de ces dimères pourrait jouer un rôle dans la formation du tube neural mais également dans d’autres différenciations tissulaires.

V

(13)

ABREVIATIONS

(14)

Abréviations Abréviations

3-AT : 3-amino-1,4-triazole

3’-UTR : 3’ untranslated / 3’ non traduit 5’-UTR : 5’ untranslated / 5’ non traduit aa : acide aminé

AD : Activator Domain ; domaine activateur

ADE2 : phosphoribosylamino-imidazole-carboxylase.

ADN (DNA) : acide désoxyribonucléique ADNc (cDNA) : ADN complémentaire ADNg (gDNA) : ADN génomique AES : amino enhancer of split Amp : ampicilline

ARN (RNA) : acide ribonucléique ARNnc (ncRNA) : ARN non codant ARNm (mRNA) : ARN messager ARNr (rRNA) : ARN ribosomal

ARN pol : (RNA pol) : polymérase d’acide ribonucléique ARN poly A (polyA RNA) : ARN polyadénylé

bHLH-O : domaines basique hélice-boucle-hélice et Orange β-gal : β-galactosidase

BOIP : bc8 Orange interacting protein BSA: albumine de sérum bovin

CIAP : Calf Intestine Alcaline Phosphatase CHF : Cardiovascular helix-loop-helix factor.

DBD : DNA binding domain, domaine de liaison à l’ADN DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO : Diméthylsulfoxyde DNase : Désoxyribonucléase.

DO : densité optique-DO

xyz

: DO à xyz nm DTT : dithiothreitol

EDTA : acide éthylène diamine-N,N,N’,N’-tétra-acétique E(Spl) : Enhancer of split

FCS : sérum de veau fœtal

GPS2 : G-protein pathway suppressor 2 H : Hairy

HAT(s) : Histone-acétyltransférase(s) HDAC(s) : Histone-désacétylase(s) Helt : Hey-like transcriptional repressor HERP : HES-related repressor protein HES : Hairy and Enhancer of split Hesr : H & E(Spl) related

Hey : H & E(Spl) related with YRPW motif HIS3 : imidazole glycérolphosphate déhydratase HRP : Horse radish peroxydase

HRT : Hairy-Related Transcripition Factor IgG : immunoglobuline de type G

IYT : domaine intermédiaire + motif YRPW + motif TEI/VGAF IW : domaine intermédiaire + motif WRPW

kb : kilobase

VI

(15)

Abréviations kDa : kiloDalton

krpm : kilo rpm, 1000 rpm k x g : kilo x g, 1000 x g lacZ : β-galactosidase Lip : Liprine

LEU2 : b-isopropylmalate déshydrogénase

LZip : Leucine Zipper, tirette à leucines, domaine d’interaction protéique pb : paire de bases

PAS : PER/ARNT/Single minded (SIM), domaine d’interaction protéique PBS : tampon phosphate salin

PCI : Phénol (25)-Chloroforme (24)-Alcool Isoamylique (1)

PCR : polymerase chain reaction, réaction en chaîne de la polymérase PIC : pre-initiation complex, complexe de pré-initiation.

PEG : Polyéthylène glycol.

PM : poids moléculaire

PVDF : polyfluorure de vinylidène

RPA : RNase protection assay, analyse par protection à la RNase.

rpm : round per minute, tour par minute RNase : Ribonucléase

RT-PCR : Rétro-transcription suivie d’une PCR SDS : sodium dodécylsulfate

SDS-PAGE : gel d'électrophorèse de polyacrylamide avec SDS TNI (Tampon) : tampon Tris-NaCl-Igepal

TRP1 : N (5’ phosphorybosyl) anthranilate isomérase TSA : trichostatine A

SC-X : milieu synthétique complet carencé en nutriment X SSC : standard saline citrate

Tris : 2-amino-2-(hydroxyméthyl-1,3-propanediol.

UAS : upstream activating sequence, sequence activatrice en amont X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside

YPAD : milieu complet de croissance pour levure

Abréviations des acides aminés Acide aspartique :

Asp,D

Asparagine : Asn, N Histidine : His, H Méthionine :Met, M Tryptophane : Trp, W

Acide glutamique : Glu,E

Cystéine : Cys, C Isoleucine : Ile, I Phénylalanine : Phe, F Tyrosine : Tyr, Y

Alanine : Ala, A Glutamine : Gln, Q Leucine : Leu, L Proline : Pro, P Sérine : Ser, S

Arginine : Arg, R Glycine : Gly, G Lysine : Lys, K Thréonine : Thr, T Valine : Val, V

Abréviations des acides nucléiques / bases.

A, C, G, T, UTP : Adénosine, Cytosine, Guanosine, Thymidine, Uridine 5’-triphosphate Adé : Adénine

dNTP : désoxynucléotide triphosphate où le N peut être soit A, C, G ou T ddNTP : didésoxynucléotide triphosphate où le N peut être soit A, C, G ou T

VII

(16)

INTRODUCTION

(17)

(Griffits et al., 1996)

(Fischel et al., 2001)

Stucture coiled-coil 700 nm de diamètre

Chromatide en métaphase 1400 nm de diamètre

Fibre chromatinienne 300 nm de diamètre Structure en solénoïde

30 nm de diamètre

Structure en « collier de perle » 11 nm de diamètre

Duplex ADN 2 nm

(Hartl et Jones, 1998)

Figure 1 : Les différents niveaux de la condensation de la chromatine et la composition du nucléosome.

(18)

Introduction I. Introduction.

Le génome des cellules eucaryotes contient plusieurs milliers de gènes. Mais elles ne les expriment pas tous en même temps. La spécificité de chaque cellule dépend de la présence de telle ou telle macromolécule à un moment et à un endroit donnés. La nature et le taux d’expression des gènes doivent être régulés de manière spatio-temporelle. Plusieurs acteurs sont impliqués dans la régulation transcriptionnelle.

I.A. La chromatine et les modifications des histones.

La chromatine est une des caractéristiques majeures qui différencient les eucaryotes des procaryotes. Pour compacter 2 m d’ADN génomique (ADNg) humain dans les 5 µm du noyau eucaryote, la nature a inventé la condensation (Figure 1). Les principales protéines de la chromatine actrices de cette condensation sont les histones. La chromatine donne l’image d’un chapelet de perles où des segments d’ADN nu séparent des repliements globulaires composés d’ADN et d’histones. Ce complexe forme le nucléosome. Chaque nucléosome, d’un diamètre de 10 nm, est constitué de deux hétérodimères d’histones H2A-H2B et d’un tétramère d’histones H3-H4. Autour de cet octamère, l’ADN s’enroule en faisant 1,65 tours sur une longueur totale de 146 paires de base (Figure 1). Les régions des histones formant le cœur globulaire de l’octamère sont responsables des interactions histone-ADN. Quant aux régions N-terminales qui pointent vers l’extérieur des nucléosomes, elles sont la cible de plusieurs modifications covalentes. Cet assemblage nucléoprotéique est verrouillé par l’histone H1 (Figure 1).

La structure compacte de la chromatine est d’elle-même un obstacle à la transcription. De plus, elle subit des modifications favorisant ou inhibant l’expression des gènes.

Trois types d’enzymes peuvent modifier la structure de la chromatine (Lee et Young, 2000; Fuks, 2003). Nous ne parlerons pas des modifications non-covalentes (ou de remodelage) des histones (par l’intermédiaire des protéines à activité ATPase SWI/SNF, ISWI et Mi-2) (Narlikar et al., 2002) et de la méthylation de l’ADN (via les protéines Dnmt ou MBD) (Fuks, 2003). Les modifications covalentes des histones seront uniquement abordées dans ce travail. Elles provoquent, en général, des changements de la charge des histones et de leur affinité pour l’ADN.

1

(19)

Introduction L’acétylation des lysines des extrémités N-terminales des histones neutralise la charge des groupements NH

3+

, diminuant l’affinité des histones pour l’ADN. Cela a pour conséquence le relâchement de la structure chromatinienne. Cette activité histone-acétyltransférase (HAT) a été mise en évidence dans une douzaine de protéines, dont GNC5, les SRC-1 et les CBP/p300 (Marmorstein, 2001; Eberharter et Becker, 2002).

Les histone-désacétylases (HDACs) conduisent à l’effet contraire. Elles sont réparties en trois classes en fonction de leur structure, de leur localisation et de leur mode d’action (Marks et al., 2003). Les HDACs de classe 1 sont au nombre de cinq chez les mammifères (HDAC 1, 2, 3, 8 et 11) et sont apparentées à la protéine RPD3 de la levure. Elles sont compactes, exprimées de manière ubiquitaire et contiennent principalement le domaine catalytique. Les HDACs de classe 2 sont plus grandes et exprimées, en général, de manière tissu-spécifique.

Homologues de HDA1 de levure, les HDAC 4, 5, 6, 7, 9 et 10 comprennent, en plus du domaine enzymatique, un autre domaine en N-terminal ou en C-terminal (de Ruijter et al., 2003). Les protéines des deux premières classes sont recrutées via les co-répresseurs SMRT/N-CoR ou mSin3A. La troisième classe, homologue de la protéine Sir2 de Saccharomyces cerevisiae, appelée Sirtuine, est composée de sept membres chez les mammifères. Leur activité requiert le co-facteur NAD+ et elle n’est pas sensible à la trichostatine A (TSA), un inhibiteur spécifique des HDACs 1-11 (sauf HDAC6) (North et Verdin, 2004).

Les histones peuvent être méthylées sur les lysines ou sur les arginines. Les enzymes responsables de cette modification sont les histone-méthyltransférases (HMTs) principalement actives sur les histones H3 et H4. La formation de l’hétérochromatine est souvent associée, mais non exclusivement, à la méthylation des lysines alors qu’une transcription active semble être liée à la méthylation des arginines. Les lysines 4 et 9 de H3 sont modifiées en alternance. En effet, la méthyl-lysine en position 4 de H3 est liée à l’euchromatine tandis que la modification de Lys9 est retrouvée dans la chromatine à l’état inactif (Berger, 2002; Lacoste et Cote, 2003).

La phosphorylation sur les sérines ou thréonines des histones facilite l’accès à l’ADN. L’ajout d’un groupement phosphate sur la sérine 10 de l’histone H3 est important à la fois pour l’activation de la transcription et pour la condensation de la chromatine durant la mitose (Lacoste et Cote, 2003). La phosphorylation des histones peut être également liée à la réparation de l’ADN ayant subi des cassures doubles brins. D’autres résidus sont susceptibles d’être phosphorylés : la sérine 28 de H3, la sérine 1 de H4 et H2A ainsi que la sérine 14 de

2

(20)

A

S G R G K G G K G L G K G G A K R H R K V L

1 3 5 8 12 16 20

A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L A T K A A R K S A P S T G G V K K …….. F K T

2 4 9 10 14 17 18 23 26 27 28 36 79 P

P P

Ac Ac Ac Ac

Ac

Ac Ac Ac

Me Me

Me Me

Me Me Me

Me

Me Me

Histone H4

Figure 2 : Les modifications post-traductionnelles des histones et le code histone (Lacoste et Cote, 2003).

(A) Principales modifications covalentes des histones.

Les quatre modifications covalentes sont représentées par les symboles suivants : Acétylation Ubiquitinylation Méthylation Phosphorylation

Les résidus des histones H3, H4, H2A et H2B qui subissent ces modifications sont renseignés.

La lysine 9 de l’histone H3 peut-être soit acétylée, soit méthylée; ces modifications sont mutuellement exclusives.

(B) Interrelations régulatrices entre les différentes modifications covalentes des histones.

La regulation en cis des modifications covalentes des histones H3 et H4 ainsi que la régulation en trans par la lysine 120 ubiquitinylée sur les résidus méthylés de l’histone H2B sont indiqués par les flèches (active) et

(répressive).

Ac Ub Me P

Histone H3

S G R G K Q G G K V R ……..L P K K T E

1 3 5 9 119

P Me Ac Ac Ub

Histone H2A

P E P A K S A P A K K G S K K A V T K A ……..V T K Y T S

5 12 14 15 20 120 P

Ac Ac Ac Ac Ub

Histone H2B

A R T K Q T A R K S T G G K A P R …….. F K T

4 9 10 14 79 P

Ac

Me Ac

Me

B

Me

Histone H3

RAV T K Y T S

120 Ub

Histone H2B

S G R G K G G K G L G K G G A K R H R K V L

1 3 5 8 12 16 20

P Me Ac Ac Ac Ac Me

Histone H4

(21)

Introduction H2B. La caractérisation des enzymes participant à cette activité est en cours (Nowak et Corces, 2004; Lacoste et Cote, 2003).

Une dernière modification covalente est l’ubiquitinylation. En général, la présence en plusieurs copies de l’ubiquitine est associée à la dégradation par le protéasome des protéines modifiées. Dans ce cas-ci, les histones sont principalement mono-ubiquitinylées au niveau d’un résidu lysine dans leur domaine C-terminal. Cette modification rapportée pour les histones H1, H2A, H2B et H3 est non dégradative. Elle aurait un rôle dans la condensation de la chromatine et la régulation de la transcription (Muratani et Tansey, 2003; Zhang, 2003).

Les principales modifications des histones H2A, H2B, H3 et H4 sont reprises à la Figure 2A.

Il existe une interdépendance entre les différentes modifications covalentes des histones (Berger, 2002; Lacoste et Cote, 2003). En effet, la phosphorylation de la sérine 10 de l’histone H3 induit une acétylation accrue de la lysine 14 de la même histone. De plus, il a été montré que la phosphorylation de la sérine 10 inhibe la méthylation de la lysine de H3 et inversement. Egalement, l’acétylation de la lysine 14 inhibe la méthylation de la lysine 9. Les modifications covalentes de l’histone H4 induisent des effets régulateurs les unes par rapport aux autres. Lorsque l’arginine 3 est méthylée, l’acétylation des lysines 8 et 12 est augmentée.

L’addition d’un groupement acétyle sur les lysines 5, 8, 12 et 16 inhiberait la méthylation de l’arginine 3. Enfin, l’état phosphorylé de la sérine 1 inhibe fortement in vitro l’acétylation des lysines sur la même histone. Cet effet serait contrecarré par la méthyl-arginine 3. Ces modifications ont une influence les unes sur les autres en cis mais également en trans. Par exemple, l’ubiquitinylation de la lysine 123 de H2B est essentielle pour la méthylation des lysines 4 et 79 de H3. Les principales régulations entre les modifications covalentes des histones H2B, H3 et H4 sont reprises à la Figure 2B.

Ces interrelations ont permis d’émettre l’hypothèse du « code histone » initiée par Strahl et Allis (2000) qui propose qu’une combinaison spécifique de modifications des histones peut dicter une association particulière de facteurs pour accomplir des fonctions bien précises.

3

(22)

TFIID TFIIA

TFIIF TFIIB

TFIIE

Pol II

TFIIH

TATA TATA

A

PIC

RE RE RE

RE

+/-

Promoteur de base Promoteur

proximal Promoteur distal

B

+/-

+/-

Figure 3 : Schéma représentant le complexe de pré-initiation (PIC) de la transcription (A) et la position des facteurs régulateurs vis-à-vis du PIC (B).

RE : élément de réponse.

Les symboles + et – dans une ellipse représentent respectivement les activateurs et les répresseurs.

(23)

Introduction I.B. Le complexe basal de transcription.

Le modèle le plus souvent proposé pour l’assemblage de la machinerie basale est le suivant.

Lorsque la chromatine est sous sa forme relâchée, l’ARN polymérase II et les facteurs généraux de la transcription (GTF pour General Transcription Factor) prennent place sur le promoteur de base. Cela comprend les entités suivantes TF

II

A, TF

II

B, TF

II

D, TF

II

E, TF

II

F et TF

II

H (Roeder, 1991). Le complexe de pré-initiation PIC (pre-initiation complex) est alors formé (Figure 3A). La séquence reconnue par le PIC se nomme la boîte TATA. Elle est de consensus TATA(A/T)A(A/T) et se situe à environ 25 à 30 pb en 5’ du site d’initiation. La protéine TBP (TATA binding protein) est l’intermédiaire à cette liaison. Les autres protéines sont appelées TAF pour TBP Associated Factor. Si les promoteurs sont dépourvus de la boîte TATA, le PIC peut se fixer sur des séquences riches en pyrimidines (séquence d’initiation) (Zhou et Chiang, 2001).

Deux modèles existent pour expliquer la formation du PIC. Le modèle séquentiel propose que l’assemblage du complexe de pré-initiation se passerait par additions successives des unités du PIC. Ce modèle est basé sur des observations faites lors de la reconstitution de la réaction de transcription in vitro permettant l’ajout un à un des facteurs (Lee et Young, 2000; Coin et Egly, 2000). De nombreux laboratoires indépendants ont mis en évidence l’existence de très gros complexes permettant de développer un second modèle, celui de l’holoenzyme. Ce dernier est un grand complexe contenant l’ARN polymérase II, des co-facteurs et une partie

des GTF. Ce complexe est recruté en une fois sur l’ADN pour former le complexe de pré-initiation (Lee et Young, 2000; Coin et Egly, 2000).

I.C. Les facteurs de transcription régulateurs : Principaux domaines.

La machinerie basale n’est pas suffisante pour assurer un contrôle spatio-temporel sur l’expression des gènes. Ce sont les facteurs régulateurs qui jouent ce rôle. Ils reconnaissent des séquences spécifiques dans les régions proximale et distale du promoteur de base (Figure 3B). La structure de ces protéines comporte au moins un domaine de liaison à l’ADN et un domaine de régulation de la transcription. Parfois un domaine de dimérisation est présent.

4

(24)

bHLH HTH bZip ZnF

Figure 4 : Les principaux domaines de liaison à l’ADN.

Les éléments de réponse correspondent aux rectangles oranges.

Les hélices et les glissières à leucines sont représentées par les cylindres verts et roses en fonction du monomère.

La liaison à l’ADN des facteurs de type basique hélice-boucle-hélice (bHLH) et basique glissière à leucines (bZip) s’effectue vialeur domaine basique (indiqué par des flèches) ; tandis que les hélice-tour-hélice (HTH) s’y lient par une de leur hélice.

Les résidus cystéines (C) et histidines (H) des facteurs en doigts de zinc (ZnF) coordonnent l’ion Zn2+(Zn).

(25)

Introduction I.C.1. Les motifs de liaison à l’ADN.

La structure des facteurs de transcription leur permet d’adopter un agencement compatible avec la séquence d’ADN cible. Ils reconnaissent non seulement une séquence d’ADN spécifique mais sont également sensibles à l’environnement de cet élément d’ADN.

La conformation 3D contient souvent une hélice α qui peut s’insérer dans le sillon majeur de l’ADN (Marmorstein et Fitzgerald, 2003).

Les facteurs de transcription liant l’ADN peuvent être classés en quatre familles principales en fonction du motif de liaison à l’ADN (Patikoglou et Burley, 1997) (Figure 4).

(1) Le domaine hélice-tour-hélice (Helix-Turn-Helix, HTH) est composé de deux hélices α reliées par un tour β. Les facteurs à homéodomaine comprennent entre autres les PAX (Mansouri et al., 1999) et les POU (Remenyi et al., 2002).

(2) Les doigts de Zinc (Zinc Fingers, ZnFs) sont caractérisés par des séquences riches en résidus histidines/cystéines. Parmi ces facteurs se trouvent les Gli (Kinzler et al., 1988) et GAl4 (Pan et Coleman, 1989).

(3) Le motif glissière à leucines (Leucine Zipper, LZip) est composé d’une hélice riche en leucines qui peut dimériser. La liaison à l’ADN s’effectue via un domaine basique. Les protéines de la famille CREB contiennent ce motif (Mayr et Montminy, 2001).

(4) Le domaine basique hélice-boucle-hélice (Helix-Loop-Helix, HLH) de liaison à l’ADN (voir point I.D.)

I.C.2. Les domaines régulateurs.

Les domaines régulateurs sont moins bien caractérisés que les domaines de liaison à l’ADN. Ils peuvent être soit activateurs, soit répresseurs. Leur activité peut être corrélée à leur composition en acides aminés.

Par exemple, le facteur Gal4 possède un domaine activateur riche en résidus acides notamment en acides aspartiques et glutamiques. Des études génétiques et des expériences mesurant l'activité in vivo de domaines activateurs intacts ou mutés ont récemment montré l'importance de certains résidus hydrophobes dans ce type de domaine (Leuther et al., 1993;

Melcher, 2000). Sp1, quant à lui, active la transcription via un domaine riche en glutamines

(Courey et al., 1989). La répression transcriptionnelle peut être associée à un domaine riche

5

(26)

Introduction en résidus hydrophobes comme l’alanine ou le tryptophane (Hanna-Rose et Hansen, 1996). Le facteur CTF, par exemple, possède un domaine riche en prolines (Mermod et al., 1989).

I.C.3. Les co-facteurs : une aide dans l’activité transcriptionnelle.

A l’opposé des facteurs de transcription, certaines protéines contenant notamment des

activités de modifications d’histones ne peuvent pas se lier à l’ADN. Elles sont appelées co-facteurs et sont réparties en deux classes.

La première classe comprend les co-activateurs qui ont des rôles diversifiés. Ils peuvent servir de pont entre les facteurs de régulation et la machinerie basale. S’ils possèdent des activités catalytiques, ils sont capables de modifier les facteurs ainsi que les nucléosomes. Les protéines TAF(II) et CBP possèdent des activités HAT (Marmorstein, 2001).

Récemment, un complexe co-activateur, le médiateur, a été mis en évidence chez la levure.

Des homologues chez les eucaryotes supérieurs, dont certaines sous-unités sont plus conservées que d’autres, ont été isolés. Ils se lient directement aux GTFs (Lewis et Reinberg, 2003; Taatjes et al., 2004). Ce complexe peut en fonction de sa composition réguler spécifiquement l’ARN polymérase (Hengartner et al., 1998). Le médiateur et les facteurs SWI/SNF ont été également isolés en tant que sous-unités de l’holoenzyme (Coin et Egly, 2000).

La seconde classe comprend les co-répresseurs. Ces protéines peuvent empêcher la formation du PIC en interagissant avec les GTFs. C’est le cas de N-CoR (Nuclear receptor Corepressor) qui dissocie le complexe TBP-TAF

II

32 (Muscat et al., 1998).

Ils sont aussi capables de recruter des enzymes de modifications des histones pour favoriser l’activité des régulateurs négatifs de la transcription. SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors) et N-CoR sont les mieux connus. Ils interagissent avec les HDAC de classes 1 et 2. Différents complexes répresseurs les contenant peuvent se former (Li et al., 2000; Jepsen et Rosenfeld, 2002).

6

(27)

1

FA FA

2

FA FA CA CA

FA FA CA CA

3

FA FA

FA’

FA’

Figure 5 : Modèle de l’activation transcriptionnelle.

Au départ, l’ADN est sous forme compactée (1). Après que le facteur activateur (FA) se soit lié à son élément de réponse (2), il interagit avec son co-activateur (CA). Cela induit une ouverture locale de la chromatine (3). Le

recrutement des complexes de modification (CMH) et de remodelage (CRH) des histones provoque la décondensation de l’ADN (4). Un autre activateur (FA’) se lie à des sites ainsi révélés et recrute le médiateur (Med). Les facteurs de transcripion de base et l’ARN polymérase peuvent maintenant se fixer sur le promoteur basal. La transcription peut commencer (5).

(Adapté de Lee et al. 2000 - Li YA et al. 2004)

CMH

CMH CRHCRH

4

Med Med CA 5

CA

Promoteur basal et PIC

(28)

FAFA

X X

FA FA CA CA

PIC

CA 1 CA

Promoteur de base

Figure 6 : Modèle de la répression transcriptionnelle.

La première étape consiste à inhiber la liaison à l’ADN des facteurs de transcription de base et de l’ARN polymérase (1). Ensuite le facteur activateur (FA) peut être dégradé viale protéasome ou séquestré par un facteur répresseur (FR).

Il est aussi possible qu’il y ait un échange de co-facteur : le co-activateur est remplacé par un co-répresseur (CR) (2). Si ce dernier cas n’est pas réalisé, un facteur de répression (FR) se fixe sur son élément de réponse et recrute un co- répresseur. Ce dernier interagit avec les complexes de modification (CMH). L’effet supplémentaire des complexes de remodelage (CRH) provoque la condensation de l’ADN (3-4).

(Adapté de Gaston K et al. 2003 - Thiel G et al. 2004)

3 2

4 FA

FA FRFR CR

CR

FR FR CR CR

CMH

CMH CRHCRH

(29)

Introduction I.D. Modèle de la régulation transcriptionnelle.

Maintenant que les différents acteurs ont été présentés, nous allons pouvoir exposer un modèle de la régulation transcriptionnelle. Nous expliquerons d’une part l’activation de la transcription à partir d’un gène inactif (Figure 5) et d’autre part la répression d’un gène actif (Figure 6).

Au départ, la chromatine est dans un état de compaction élevé. La première étape de l’expression d’un gène spécifique consiste en la fixation d’un facteur activateur sur son élément de réponse. Ce facteur interagit avec son co-activateur. Ce multimère ouvre la chromatine localement. Cela permet aux complexes de modifications (exemple HAT) et de remodelage (exemple SWI) des histones d’agir sur leurs substrats. Une zone plus grande de la chromatine s’en trouve moins condensée. Un facteur activateur se fixe sur un élément de réponse ainsi révélé et recrute le médiateur. Le promoteur basal est ainsi prêt à recevoir les facteurs de transcription de base et l'ARN polymérase. La transcription du gène peut alors commencer (Narlikar et al., 2002; Taatjes et al., 2004; Li et al., 2004).

Lorsque la transcription d’un gène n’est plus nécessaire à la cellule, elle en induit la répression. Pour ce faire, trois voies principales sont possibles : l’inhibition sélective de la machinerie transcriptionnelle de base, l’élimination de l’activateur ou de sa fonction régulatrice positive et le remodelage ou la modification de la chromatine.

Tout d’abord, il faut empêcher le PIC de se fixer sur le promoteur basal. L’ARN polymérase peut être modifiée sélectivement mais l’inhibition spécifique de la liaison à l’ADN des TBP ou des interactions entre les facteurs de transcription de base peuvent aussi se réaliser.

Ensuite, le facteur activateur doit être enlevé de son élément de réponse ou voir son activité transcriptionnelle modifiée. Il peut être rendu instable par des modifications post- traductionnelles. Sa liaison à l’ADN peut être inhibée par compétition ou séquestration par un facteur répresseur. Par un changement de co-facteur, l’activateur peut aussi devenir un répresseur. Il est encore possible qu’un facteur répresseur se fixe sur un élément de réponse et recrute un co-répresseur. Le multimère répresseur interagit avec les complexes de modifications des histones. Le complexe de remodelage est aussi recruté sur la chromatine.

Cela induit la condensation de l’ADN et rend la transcription impossible sans modification de la structure chromatinienne (Jepsen et Rosenfeld, 2002; Narlikar et al., 2002; Gaston et Jayaraman, 2003; Thiel et al., 2004).

7

(30)

Classification d’après Murre et al.

1989

Sites de liaisons à l’ADN

CACGAG

Hrt Hrt Hairy Hairy E(spl) E(spl)

bHLH-Zip B

bHLH-PAS C bHLH-O

E HLH

D bHLH-Zip

B Coe-HLH

F

Ebox A bHLH

A

CACCTG CAGCTG

CACGTG CATGTG

CACGCG

Nbox Ebox B

CACGTG CATGTG

TNCGTG

Ebox C Ebox B site canonique Ebox =

CANNTG

Pas de liaison à l’ADN ATTCCCNNGGGAATT

= EPAS

Figure 7 : Arbre phylogénétique des différentes familles des facteurs de type bHLH.

La relation phylogénétique est adaptée de Ledent et al. (2002). Les facteurs sont classés par famille. Les sites de liaison spécifiques à l’ADN sont renseignés à l’extrême droite de la figure. La classification d’après Murre et al. (1989) est représentée par des chiffres romains.

En bleu, le groupe A correspond aux facteurs bHLH sans domaines supplémentaires qui se lient sur la E-Box de type A. Le Groupe B (en rouge) est composé des protéines contenant la glissière à leucines (Zip), elles se fixent sur les E- box de type B. Les facteurs du groupe C, en vert, présentent en plus du domaine bHLH un domaine PAS; leurs sites de liaison sont les éléments de réponse aux xénobiotiques ou à l’hypoxie (XRE / HRE). Le groupe D, en rose, contient des protéines qui ne se fixent pas sur l’ADN par défaut de domaine basique. Le groupe E en noir est composé des facteurs bHLH avec un domaine Orange (bHLH-O). Ils se lient sur des boîtes E de type C ou des boîtes N.

Group E

V III IV III IV I

VI

VII

XREHRE

(31)

Introduction I.E. Les facteurs de type bHLH.

Les protéines de type basique hélice-boucle-hélice (bHLH) forment une superfamille de régulateurs transcriptionnels présents dans les cellules eucaryotes. Plusieurs revues leur ont déjà été consacrées en fonction de l’espèce étudiée : les levures (Robinson et al., 2000), la drosophile (Peyrefitte et al., 2001), l’homme (Ledent et al., 2002) et les plantes (Toledo-Ortiz et al., 2003). Ces facteurs de transcription jouent un rôle important dans les processus de développement comme la détermination sexuelle, la neurogenèse et la myogenèse.

I.E.1. Les différentes familles bHLH.

Lors de la découverte des bHLH, leur classification était basée sur les dimérisations potentielles, la spécificité de liaison à l’ADN et la distribution tissulaire (Murre et al., 1994).

Cette classification a révélé six familles. Une approche phylogénétique les a classés en six groupes après addition des COE-HLH : A à F respectivement les bHLH, les bHLH-Zip, les bHLH-PAS, les HLH, les bHLH-O et les COE-HLH (Ledent et al., 2002). Nous avons retenu cette dernière classification pour notre travail (Figure 7).

Les bHLH sont, en général, des activateurs transcriptionnels. Parmi les plus connus se trouvent NeuroD, Acheate-Scute, Atonal et leurs homologues respectifs. Ils sont responsables des différenciations des neurones au sein de la rétine et du système nerveux (pour revue : Guillemot, 1999; Bertrand et al., 2002; Hatakeyama et Kageyama, 2004). MyoD est un facteur myogénique (Davis et al., 1990; Walker et al., 2001). Tandis que les deux HAND sont importants pour la morphogenèse cardiaque (Firulli, 2003; Firulli et Conway, 2004).

Les bHLH-Zip Myc-Max-Mad forment un réseau de facteurs activateurs-répresseurs importants dans la différenciation, la prolifération et la mort cellulaires. Le domaine additionnel « glissière à leucines » permet une sélection de la dimérisation supplémentaire. Ils se lient sur la séquence CACGTG (Pour revue : Luscher, 2001; Baudino et Cleveland, 2001).

Les Coe-HLH ne possèdent pas de domaine basique. Leur liaison à l’ADN est due à la présence d’un doigt de zinc dans leur région N-terminale. La dimérisation de ces facteurs

8

(32)

Introduction s’effectue par la présence de trois hélices. Ils sont impliqués dans l’embryogenèse, le système nerveux adulte, le développement des lymphocytes B et des adipocytes (Dubois et Vincent, 2001; Fraser et al., 2004).

Les bHLH-PAS possèdent un domaine qui est probablement responsable de la stabilisation du reploiement et de la dimérisation des protéines. Ce domaine est situé juste en position C-terminale du domaine bHLH. Il est dénommé PAS en rapport avec le nom des facteurs qui contiennent ce domaine : PER/Aryl hydrocarbon receptor translocator (ARNT)/Single minded (SIM). Ils interviennent notamment dans la réponse aux xénobiotiques et à l’hypoxie, le rythme circadien et le développement embryonnaire (Hahn, 2002; Panda et al., 2002; Bracken et al., 2003).

Les HLH comprenant les facteurs Id 1-4 et Emc sont des répresseurs indirects. Ne possédant pas un domaine basique, ils ne peuvent se lier à l’ADN. Ils inhibent l’activité des bHLH et d’autres protéines en les séquestrant. Induits par la voie TGFβ/BMP, ils régulent le cycle cellulaire, le développement des cellules épithéliales mammaires et neural. Ils auraient aussi un rôle dans la transformation maligne (Desprez et al., 2003; Ik Tsen et Tan, 2003;

Ruzinova et Benezra, 2003; Iavarone et Lasorella, 2004).

I.E.2. Liaison à l’ADN et le domaine bHLH.

Différents groupes d’études ont démontré l’existence d’une spécificité de liaison de ces protéines à l’ADN. Les techniques d’interférence par méthylation et de retard de migration en gel d’électrophorèse ont permis d’en déterminer la séquence d’ADN cible. Les deux exemples suivants sont loin d’être exhaustifs.

Le facteur bHLH nommé E47 peut se lier au site κE2 du promoteur des immunoglobulines qui contient la séquence de liaison GGCAGGTGG (Murre et al., 1989). Des résultats similaires ont été obtenus en étudiant la liaison du facteur bHLH appelé MyoD sur le promoteur de la kinase de la créatine de muscle (MCK). MyoD reconnaît les séquences CACCTG et CATGTG (Lassar et al., 1989). Chaque famille bHLH se lie donc, en général, à une séquence consensus CANNTG dénommée boîte E ou E-box. Les deux nucléotides au

9

(33)

Figure 8 : Alignement de certains bHLH (Ferre-D'Amare, et al. 1993 ).

Le domaine basique (BASIC), la première hélice (H1), la boucle (loop), la deuxième hélice (H2) et la glissière à leucines (ZIPPER) ainsi que les résidus caractéristiques de ces régions sont colorés respectivement en rouge, jaune, violet, bleu et orange.

A B C

Figure 9 : Structure tridimensionnelle du dimère Max (A), USF(B) et E47 (C) sur leur site de reconnaissance.

Les bHLH sont colorés en rouge et jaune (A-B) ou vert et jaune (C). L’ADN est représenté en bleu (A-B) ou en rose (C) (A-B: Ferre-D'Amare, et al. 1994; C: Ellenberger, et al. 1994 ).

(34)

B A

Arg 36 Arg 35

C A C G T G

D C

Figure 10 : Structure tridimensionnelle de la partie basique des bHLH sur leur site de reconnaissance ou libre.

(A) Vue de la région basique d’un des monomères Max (Ferre-D'Amare, et al. 1993). En rouge sont représentés les acides aminés. Les paires de base GC et AT sont respectivement colorées en bleu et vert. Le consensus CACGTG est renseigné.

(B) Comparaison du domaine basique d’un monomère Max à l’état libre (bleu) ou sur son site de reconnaissance (protéine en gris, ADN en rouge). Les Arg 35 et 36 de Max sont représentées en bâtonnets jaunes pour la forme libre ou en gris pour la forme complexée à l’ADN (Sauvé et al.2004).

(C) Comparaison des dimères Max (en jaune) et USF (en rouge). Les résidus de Max sont notés en minuscule et pour USF en majuscule. L’ADN reconnu par Max ou USF est réprésenté en bleu ou en rose (Ferre-D'Amare, et al.

1994).

(D) Vue de la moitié CAC (en rose) du site reconnu par le domaine basique de E47 (en vert) (Ellenberger, et al. 1994 ).

(35)

A B

Figure 11 : Schéma des contacts entre les facteurs bHLH Max (A) ou E47 (B) et leur site de reconnaissance.

(A) Un seul des monomères est représenté sur ce schéma. Les interactions entre les acides aminés et les bases nucléotidiques sont désignées par des flèches continues; les contacts avec les phosphates par des flèches discontinues. Les interactions avec les bases situées en dehors du consensus sont indiquées entre parenthèses.

L’ellipse au centre de la figure correspond à l’axe du dimère formé (Ferre-D'Amare, et al. 1993).

(B) Les monomères sont dénommés ‘CAC’ou ‘CAG subunit’ d’après la moitié du site de reconnaissance en contact avec le domaine basique de chaque monomère. Les interactions sont représentées par des lignes discontinues. Les consensus CAGGTG sont encadrés en rouge (adapté d’ Ellenberger, et al. 1994 ).

(36)

Introduction centre de cet hexamère sont spécifiques à différentes classes de bHLH. D’autres protéines de type bHLH comme les COE-HLH ou les bHLH-PAS se lient à d’autres séquences (Figure 7).

L’étude du profil hydrophobe des résidus prédit la présence de deux domaines hélicoïdaux séparés par une région sans structure apparente. Environ quinze résidus à l’extrémité N- terminale de la première hélice sont à caractère basique (domaine basique). Mis en présence d’ADN, les bHLH présentent, dans leur spectre par dichroïsme circulaire, une augmentation de la structure en hélice (Anthony-Cahill et al., 1992). Le fait que des mutations dans le domaine basique perturbent la liaison à l’ADN suggère que ce domaine adopterait une structure en hélice en présence d’ADN (Davis et al., 1990).

Les analyses de cristaux bHLH /ADN ont permis de déterminer la structure tridimensionnelle de certains de ces complexes. Plusieurs exemples sont illustrés ci-après. Un alignement des séquences protéiques de quelques bHLH est présenté à la Figure 8.

Comparons les cristaux des protéines bHLH Max, USF et E47 sur leur site de reconnaissance d’ADN (Ferre-D'Amare et al., 1993; Ferre-D'Amare et al., 1994; Ellenberger et al., 1994).

Chacun de ces trois facteurs se fixe à l’ADN sous forme d’homodimère en adoptant une structure à quatre hélices parallèles en forme de tenaille enserrant l’ADN (Figure 9 A-B-C).

Chaque monomère se fixe à une moitié du site CANNTG dans le sillon majeur de l’ADN.

Max possède une structure hélicoïdale observable à partir du résidu Arg25 du domaine basique à la sérine 49 de l’hélice 1 (Figure 10A). Une récente analyse de la structure du dimère Max en solution par RMN a démontré qu’à l’état « libre » (c’est-à-dire non lié à l’ADN), le domaine basique n’a pas de structure secondaire hélicoïdale (Figure 10B). Ces observations confirment donc le changement de structure du domaine basique lors de sa fixation à l’ADN.

En plus de ce domaine, une partie de la première hélice interagit également avec l’ADN (Figure 10 A). Les Figures 8 et 10C-D permettent de déterminer que les résidus Glu et Arg conservés dans la plupart des facteurs bHLH sont importants pour la fixation à l’ADN.

La Figure 11 schématise les interactions entre les acides aminés du domaine basique des bHLH Max ou E47 et la molécule d’ADN au site de reconnaissance, telles qu’elles ont pu être déduites de la structure tridimensionnelle des complexes cristallisés. Les acides aminés sont en contact avec le squelette désoxyribose-phosphodiester et avec les bases de l’ADN elles- mêmes. Avant l’obtention de la structure tridimensionnelle des bHLH, plusieurs équipes avaient déjà déterminé un rôle des hélices dans la dimérisation. Davis et al. (1990) ont testé

10

(37)

b HLH O I

A WRPW

HES

25 % 48 % 29 % 9 % YXXW

TE(I/V)GAF HRT

HES7 HES5 HES2 hHES4

HES1 HES3 HES6

HRT3 HRT1 HRT2

HELT DEC1

DEC2

22 % 39 % 19 % 22 %

Helt

20 % 41 % 21 % 6 %

DEC

B

Figure 12 : Schéma de la structure des bHLH-O (A) et arbre phylogénétique (B).

(A) Les domaines conservés sont représentés en bleu pour le domaine basique (b) ; en rouge pour le domaine hélice-boucle-Hélice (HLH) et en Orange, le domaine Orange (O). La région en aval du domaine Orange est la moins conservée. Dénommée région intermédiaire (I), elle sépare le motif conservé chez les HES (WRPW en jaune) ou le motif dégénéré YXXW (en jaune égalemant) chez les HRT du reste de la protéine. Chez les HRT,un nouveau motif TEI/VGAF est conservé; il est coloré en vert. Les protéines des familles Helt et DEC ne

contiennent aucun de ces motifs. Les similitudes de séquence entre HES et les autres sous-familles des bHLH-O sont exprimées en pourcentages en regard des domaines et régions concernés.

(B) Arbre phylogénétique des bHLH-O (adapté de Miyoshi et al 2004).

(38)

Introduction une protéine de fusion Max-Maltose binding protein (MBP) avec des protéines chimériques entre Myc et E12. Ils ont observé que l’échange d’une ou l’autre hélice éliminait de manière significative la formation de l’hétérodimère Myc-Max (E12 n’interagit pas avec Max). Ces mêmes protéines de fusion étaient incapables de lier la séquence d’ADN utilisée lors des expériences de retard sur gel (Davis et Halazonetis, 1993).

Lors des immunoprécipitations réalisées avec différentes protéines E47 mutées dans le domaine basique et dans la boucle, la formation de dimères fut observée. Lorsque que des résidus de l’hélice 1 ou de l’hélice 2 présentaient des variations, les dimères n’étaient pas obtenus. Aucun retard sur gel n’était observé avec la séquence consensus d’E47 et les mêmes protéines chimériques (Voronova et Baltimore, 1990).

Cela donnait aux deux hélices une importance dans la liaison entre bHLH. La confirmation de

ce rôle fut obtenue par la détermination des structures cristallines. On observe sur les Figures 9A-B-C que les hélices 1 et 2 interagissent entre partenaires et que l’hélice 1 est

également en contact avec l’ADN.

En conclusion, le domaine basique est impliqué dans la liaison à l’ADN et le domaine HLH est responsable de la dimérisation de ce type de facteur. Comme mentionné dans le point précédent, certaines des protéines bHLH possèdent, en plus du HLH, un domaine supplémentaire. Ce dernier est impliqué dans la dimérisation ou dans leur activité transcriptionnelle. Plusieurs combinaisons de dimères sont donc possibles. Cela ajoute, à l’hétérogénéité des séquences boîtes E, une spécificité et une variété dans le contrôle de la transcription.

I.F. Les bHLH-O ou les Hairy and Enhancer of Split related family.

Les facteurs de type bHLH-O sont répartis en quatre familles : (i) les HES qui comprennent les Hairy (H) et les Enhancer of Split ( E(Spl) ) ; (ii) Heslike ou Helt; (iii) les HRT et (iv) la famille DEC. Récemment identifiée et seule représentante de sa famille, Helt est exprimée dans le système nerveux central en cours de développement (Nakatani et al., 2004; Miyoshi et al., 2004). Bien qu’impliqués dans la différenciation neuronale (Boudjelal et al., 1997), les DEC sont mieux connus pour leur aptitude à réguler l’horloge circadienne (Honma et al., 2002). Heslike et les DEC n’ayant pas été étudiés au cours de ce travail, nous nous concentrerons que sur les HES et les HRT.

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 M y o D R R K A A T M R E R R R L S K

E 4 7 R R M A N K A R E R V R V R D M a x K R A H H N A L E R K R R D H U S F R R A Q H N E V E R R R R D K H E S 1 R K S S K P I M E K R R R A R H E S 2 R K N L K P L L E K R R R A R H R T 1 R K R R R G I I E K R R R D R H R T 2 R K R R R G I I E K R R R D R H R T 3 R K K R R G I I E K R R R D R D E C 1 Y K L P H R L I E K K R R D R D E C 2 Y K L P H R L I E K K R R D R H E L T T P V S H K V I E K R R R D R

Figure 13 : Comparaison des domaines basiques de certains bHLH, bHLH-ZIP et bHLH-O.

Les résidus conservés au sein de tous les bHLH et plus particulièrement parmi les bHLH-O sont respectivement colorés en rouge et en bleu.

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Introduction I.F.1. Structure des bHLH-O et le domaine Orange.

Les protéines bHLH-O sont regroupées au sein de la même famille de part leur similitude de séquence au niveau du domaine bHLH (39-48 %) et d’un deuxième domaine conservé caractéristique, le domaine Orange (19-29 %) (Figure 12A). La région située entre le domaine Orange et l’extrémité C-terminale (région intermédiaire) est très peu conservée entre les membres de cette famille (6-9%), excepté entre les HES et Helt (22%). A l’extrémité C- terminale, les HES possèdent un motif conservé WRPW. La fonction répressionnelle du WRPW est bien connue, elle sera développée dans la section consacrée aux HES. Chez les HRT, ce motif est dégénéré en YXXW, tandis que le motif TE(I/V)GAF est conservé au sein de cette sous-famille. Il ne semble être présent que dans les HRT et aucun mécanisme d’action ne lui a été attribué. La Figure 12B représente l’arbre phylogénétique de ces facteurs.

En comparant les domaines basiques des facteurs MyoD, E47, USF, Max et ceux d’une partie des protéines bHLH-O (Figure 13), on peut observer que l’Arg9 et la Glu12 du

domaine basique (voir I.E.2.), sont conservées dans tous les bHLH-O. Parmi cette sous-famille, une Lys10 et une Arg15 sont exclusivement conservées. En se rapportant aux

modèles tridimensionnels, il se pourrait que la Lys10 soit impliquée dans le choix de la boîte E ou N. En effet, le facteur E47 possède en position 10 une arginine qui interagit avec la deuxième guanine du consensus CAGGTG (Ferre-D'Amare et al., 1993; Ferre-D'Amare et al., 1994; Ellenberger et al., 1994). Lorsqu’elle est mutée en lysine, la protéine E47 est incapable de se lier à l’ADN (Voronova et Baltimore, 1990).

Le second domaine conservé est appelé Orange (Dawson et al., 1995) ou Hélice 3-4 (Knust et al., 1992). Nous continuerons avec l’appellation Orange dans la suite de ce travail. Ce domaine est composé en moyenne de quarante acides aminés et n’a jamais été trouvé jusqu’à présent dans une protéine non-bHLH (Davis et Turner, 2001). Différentes fonctions lui sont attribuées.

L’activation du gène Sex-lethal par le bHLH Scute peut être réprimée par Hairy. Au contraire, le E(Spl) m8 ne peut l’inhiber (Parkhurst et al., 1990). L’échange des domaines bHLH des deux protéines ne modifie pas leur activité vis-à-vis de l’activateur Scute. Par contre, une protéine chimérique, contenant le domaine Orange de Hairy et le reste issu de m8, est capable

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Figure 14 : Arbre phylogénétique des protéines de la famille HES (extrait de Davis, RL et al., 2001).

La famille des bHLH-O HES peut être subdivisée en deux sous-familles les Hairy et les Enhancer of split (E(spl)).

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