Chapitre III : Matériel et Méthodes
2. Manipulations in vitro
2.1. Culture de M. tuberculosis
Nous utilisons trois types de milieu de culture pour réaliser la croissance de M. tuberculosis : le milieu solide « Middlebrook 7H11 » et les milieux liquides : « Middlebrook 7H9 » (Becton Dickinson) et « Sauton » (Parish & Stoker, 1998) (voir leur composition ci-dessous). Les milieux sont autoclavés 15 minutes à 121°C et enrichis avec 10% d’ADS (à l’exception du milieu Sauton). Après préparation et filtration (0.45 µm, Nalgène), le supplément ADS est conservé à 4°C jusqu’à son utilisation. Les cultures sont réalisées à 37°C, et sous agitation dans le cas de cultures liquides. Lorsqu’un mutant spontané résistant à un antibiotique est mis en culture, l’antibiotique concerné est toujours additionné au milieu de culture afin de conserver la pression de sélection (PAS : 8 µg/ml, ETH : 10 µl/ml, RIF : 1 µg/ml).
Composition des milieux de culture :
•Middlebrook 7H11 : Poudre Middlebrook 7H11 : 21 g/L ; Glycérol : 0,5%; ADS 10%
•Sauton : KH2PO4 : 0,5 g/L ; MgSO4.7H2O: 0,5 g/L ; acide citrique: 2 g/L ; citrate ammonium ferrique: 0,05 g/L ; Glycérol : 60 ml/L ; Asparagine : 4 g/L
•ADS : Albumine (BSA fraction V) : 50 g/L ; Dextrose (D-glucose) : 20 g/L ; Sel (NaCl) : 8.1 g/L
2.2. Stockage des souches de M. tuberculosis
Afin d’assurer leur conservation, les souches sont stockées à la température de -80°C dans un volume de 1 ml de milieu 7H9 complémenté de 30% de glycérol. Les bactéries sont récoltées à partir d’une culture solide 7H11+ADS à l’aide d’un écouvillon stérile et homogénéisées dans ce milieu de conservation avant d’être congelées.
2.3. Sélection de mutants devenus spontanément résistants à un antibiotique
Des mutants spontanés résistants au PAS, à la RIF et à l’ETH ont été sélectionnés sur boîtes de Pétri 7H11+ADS contenant, respectivement, 16 µg/ml de PAS, 1 µg/ml de RIF et 20 µg/ml d’ETH. Le protocole utilisé pour la sélection de mutants spontanés est adapté de ceux proposés par Luria (Luria & Delbruck, 1943) et Morlock (Morlock et al., 2000). Brièvement, pour chaque souche tuberculeuse « mère » (sensible), une culture est réalisée en conditions standards dans du milieu Sauton pendant 3 semaines. La culture bactérienne est ensuite
ajustée à une DO600nm de 1,2 (correspondant à ~7,2 x 107 CFU/ml) puis diluée dans un grand
volume de Sauton de façon à obtenir une concentration proche des 2000 CFU/L. Cette suspension fortement diluée est ensuite déposée dans 220 tubes de culture à raison de 5 ml/tube ce qui correspond à environ 10 bactéries/tube). Après 32 jours de culture, les bactéries sont concentrées par centrifugation de la culture, élimination du surnageant et resuspension du culot de centrifugation dans 1 ml de milieu Sauton. Les bactéries provenant de chaque tube de culture sont ensuite étalées in toto sur une boîte de Pétri 7H11+ADS contenant l’antibiotique pour lequel on désire obtenir des mutants résistants. Les colonies qui se développent sur ces boîtes sont des mutants devenus spontanément résistants à l’antibiotique respectivement utilisé. Seule une colonie mutante est sélectionnée par boîte de Pétri afin de s’assurer de la diversité des évènements génétiques étudiés. Les mutants sont prélevés à l’aide d’un écouvillon stérile et remis en culture sur boite 7H11+ADS contenant l’antibiotique adéquat, afin d’obtenir une suspension suffisante de bactéries pour réaliser l’extraction d’ADN et la conservation de la souche étudiée.
Afin d’éviter tout biais lié aux souches choisies pour notre étude, nous avons sélectionné des mutants spontanés obtenus à partir de 8 souches cliniques bien caractérisées, représentatives des 8 groupes génétiques (clusters) de M. tuberculosis (Gutacker et al., 2002, Gutacker et al., 2006). Nous avons utilisé les souches W4, J, CDC1551, OO6, BE, AF, AU et AI.
2.4. Inactivation des cultures et extraction d’ADN mycobactérien pour
amplification par PCR
Les cultures de M. tuberculosis sont inactivées par la chaleur. Pour ce faire, les bactéries en culture sur milieu solide 7H11 sont récoltées à l’aide d’un écouvillon stérile et placées dans
un tube Eppendorf® contenant 300 µl d’eau milliRo autoclavée. Les tubes sont ensuite
vortexés et placés dans un four à 95°C pendant 30 min. Ce traitement assure l’inactivation et la lyse des bactéries et, par conséquent, la libération de l’ADN bactérien. Les tubes sont ensuite centrifugés et le surnageant contenant l’ADN est utilisé pour les analyses.
2.5. Isolement d’ADN génomique pour séquençage
Les bactéries cultivées sur milieu solide 7H11+ADS sont récoltées à l’aide d’un écouvillon
stérile et placées dans un tube Eppendorf® contenant 500 µl d’eau milliRo autoclavée. Le
tube est ensuite incubé pendant 30 min à 80°C (inactivation) avant d’être placé dans un bain-marie à 60°C sous agitation lente. Septante µl d’une solution aqueuse contenant 10 % de SDS
et 50 µl de protéinase K à 10 mg/ml sont ajoutés au tube avant d’être à nouveau placés à
60°C. Après 1 heure d’incubation, 100 µl d’une solution de NaCl 5M et 100 µl d’une solution CTAB (10 % CTAB, 0.7M NaCl) préchauffées sont rajoutés. Entre chaque addition, le tube est mélangé par inversion et replacé dans le bain. Cette étape est suivie d’une incubation finale de 15 min à 60°C sous agitation lente. Le tube est alors placé 15 min à –
70°C puis dégelé à 60°C. Sept cents µl d’un mélange chloroforme/alcool isoamyl (24:1) sont
alors ajoutés au tube et celui-ci est inversé 20 à 25 fois de façon à mélanger les composés organiques et aqueux jusqu’à l’obtention une solution blanche homogène. Après
centrifugation pendant 10 min à 13000 rpm, la phase supérieure (aqueuse, ~700µl) est
transférée vers un nouveau tube Eppendorf® contenant 700 µl d’isopropanol froid. Le
mélange est homogénéisé en inversant le tube quelques fois. A cette étape, un précipité ADN devient visible. Les tubes sont alors placés à -20°C pour au moins 30 min ou à 4°C toute la
nuit. Le tube est ensuite centrifugé à 14000 rpm pendant 10 min à température ambiante. Le culot qui en résulte est lavé avec de l’éthanol à 80% et centrifugé à nouveau pendant 5-10 min. Le culot d’ADN est alors séché et resuspendu dans 55 µl d’eau. Cinq µl sont déposés sur gel d’agarose 1% afin de contrôler la qualité de l’ADN extrait.
2.6. Amplification par PCR et séquençage des gènes cibles étudiés
Les gènes cibles sont amplifiés par PCR (Polymerase Chain Reaction) à partir de l’ADN mycobactérien extrait. Les gènes séquencés dans notre étude sont listés dans la table 8.
Le mélange réactionnel utilisé contient 25 pmol de chaque amorce, 1,25 mM de MgCl2, 10%
de diméthylsulfoxyde (DMSO), 200 µM de chaque déoxynucléoside triphosphate (dNTPs) et 2,5 U de Taq polymérase (QIAgen) dans un volume final de 45 µl auxquels sont ajoutés 5 µl d’ADN mycobactérien. Les amplifications sont réalisées à l’aide de l’amplificateur « Gen Amp PCR System 2700 » (Applied Biosystems). Les conditions d’amplification standards sont: 94°C pendant 10 min, suivi de 30 cycles comprenant les 3 étapes suivantes : 94°C pendant 1 min, 60°C pendant 1 min et 72°C pendant 1 min. L’amplification est terminée par une élongation finale à 72°C pendant 10 min. Les produits d’amplification sont visualisés par électrophorèse en gel d’agarose 1%, coloration au bromure d’éthidium et transillumination sous lumière ultra-violette (UV).
Antibiotiques (résistance étudiée) Gènes séquencés
PAS thyA, thyX, dfrA, folP1, folP2, folC, Rv3566c (nhoA), Rv0262 (aac1), Rv1347c (aac2)
RIF rpoB
INH katG
2.7. Détermination du groupe génétique des isolats cliniques (PGG : « Principal
Genetic Group »)
Il est possible de classer tous les isolats cliniques de M. tuberculosis en 3 groupes génétiques différents appelés PGG1, PGG2 et PGG3 (Sreevatsan et al., 1997a). Ces 3 groupes génétiques se distinguent l’un de l’autre par des polymorphismes au niveau des gènes katG (codon 463) et gyrA (codon 95), codant respectivement pour la catalase-peroxidase KatG impliquée dans la résistance à l’isoniazide et pour la gyrase GyrA impliquée dans la résistance aux quinolones (Figure 35).
Figure 35 : description des polymorphismes caractérisant les 3 PGG
Les mutations ponctuelles présentes au niveau de ces deux gènes peuvent être mises rapidement en évidence à l’aide de 2 doubles réactions de PCR. Le principe repose sur l’utilisation, pour chaque gène, d’une amorce « anti-sens » et de deux amorces « sens » identiques en tout point à l’exception du dernier nucléotide en 3’ (Dubiley et al., 2005). Les amorces « sens » se fixent en amont de la région du gène présentant le polymorphisme et le nucléotide 3’ se situe parfaitement au niveau de la mutation ponctuelle. Pour l’une des amorces « sens », ce nucléotide 3’ sera complémentaire du nucléotide dit « sauvage » et pour l’autre, il sera complémentaire du nucléotide dit « muté » (Figure 36). Ainsi, selon la présence ou l’absence de la mutation dans le gène cible, la première ou la deuxième amorce « sens » permettra l’obtention d’un produit PCR visualisé ensuite sur gel d’agarose 1% (Ignatova et al., 2006).
Figure 36 : principe de la réaction PCR capable de mettre en évidence une mutation ponctuelle
PGG2
katG
463CGG (Arg)
gyrA
95ACC (Thr)
PGG3
katG
463CGG (Arg)
gyrA
95AGC (Ser)
PGG1
katG
463CTG (Leu)
gyrA
95ACC (Thr)
mutation 3’ Amorce anti-sens 3’ Amorce anti-sens 5’ 3’ 5’ 3’ Amorces sens Gène sauvage Gène muté Amorces sens 5’ 5’Afin de tester rapidement la présence ou l’absence de mutations dans les deux gènes impliqués, nous réalisons 2 PCR multiplex (2 x 2 amplifications). Pour chaque réaction de PCR, selon le PGG, il est possible d’obtenir 1 ou 2 amplicons (Table 9). L’organisation des amorces impliquées dans les deux réactions PCR a été réalisée de façon à obtenir des amplicons de taille différentes identifiables après électrophorèse en gel d’agarose (Ignatova et
al., 2006).
Réaction PCR 1 Réaction PCR 2
Amorces utilisées
gyrA anti-sens
gyrA sens (muté-Ser95) katG anti-sens
katG sens (muté-Arg 463)
gyrA anti-sens
gyrA sens (sauvage-Thr95) katG anti-sens
katG sens (sauvage- Leu463)
Buts Mettre en évidence la présence
éventuelle d’une sérine (AGC) dans GyrA et d’une arginine (CGG) dans KatG
Mettre en évidence la présence
éventuelle d’une thréonine
(ACC) dans GyrA et d’une leucine (CGG) dans KatG L’interprétation des résultats s’effectue de la manière suivante:
Reaction 1 Reaction 2 PGG
- + 1
+ + 2
+ - 3
Table 9 : composition des 2 réactions PCR et interprétation des résultats
2.8. Séquençage des gènes cibles étudiés
Les différents gènes étudiés ainsi que leur région située en amont (~100 nucléotides) sont séquencés dans les 2 directions (« sens » et « anti-sens »). Les séquençages sont réalisés sur les produits d’amplification de PCR avec les mêmes amorces d’amplification. Le séquençage est assuré par la société Genoscreen au moyen du kit de séquençage « Big Dye Terminator » (PE Applied Biosystems) et du système « GeneAmp PCR system 9600 » (Perkin Elmer). Les produits d’amplification sont analysés sur un séquenceur de modèle 373 ou 3100 (Applied Biosystems). Brièvement, une amplification PCR de la région à étudier est réalisée en présence des 4 déoxynucléotides habituels (dATP, dTTP, dGTP et dCTP) ainsi que de 4 didéoxynucléotides (ddATP, ddTTP, ddGTP et ddCTP) associés chacun à un fluorophore spécifique. Lorsque la polymérase, qui allonge l’amorce, insère un didéoxynucléotide,
l’élongation est bloquée. Cette amplification linéaire et le hasard de l’incorporation des didéoxynucléotides font que l’on obtient une série de fragments marqués par un fluorophore en position terminale. Les fragments d’ADN marqués sont séparés en fonction de leur taille par électrophorèse en capillaire et leur fluorescence respective est analysée lors de leur passage devant le détecteur du séquenceur. L’ordinateur fournit ensuite les résultats sous forme d’un chromatogramme et d’un fichier texte qui sont analysés au sein de notre laboratoire. Les séquençages « sens » et « anti-sens » ont été réalisés afin de confirmer la présence d’éventuelles mutations.
2.9. Analyse des séquences d’acide nucléique
L’analyse des séquences textes obtenues après séquençage est réalisée par comparaison des séquences obtenues avec celles qui sont répertoriées dans les banques de séquences d’acides nucléiques. On parle plus communément de la réalisation d’un « Blast » (Altschul et al., 1990, Altschul et al., 1997). Plusieurs programmes et banques, accessibles librement sur Internet, permettent de réaliser cette analyse. Le programme « Blast » de « Tuberculist » permet, par exemple, de comparer une séquence étudiée avec la séquence connue du génome de M. tuberculosis H37Rv (Cole et al., 1998) (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/). Le programme recherche, par calcul de similarité, les séquences de la banque se rapprochant le plus de la séquence étudiée et propose des alignements de ces séquences. Ces alignements permettent la mise en évidence d’éventuelles différences de nucléotides, c’est-à-dire la présence de mutations. Le site du NCBI (National Center for Biotechnology Information) propose également un programme « Blast » permettant de comparer une séquence étudiée à une banque plus large comprenant, entre autres, les génomes de M. tuberculosis H37Rv, H37Ra, CDC1551, M. bovis BCG Pasteur,…. (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Cette analyse plus large permet notamment de voir si une mutation mise en évidence est phylogénétique ou non, c’est-à-dire si on la retrouve spécifiquement chez certaines souches de mycobactéries.
2.10. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
Afin de mettre en évidence une éventuelle relation entre une mutation identifiée par séquençage et le niveau de résistance à un antibiotique de la souche qui la porte, la
concentration minimale inhibitrice (CMI) fut déterminée pour toutes les souches cliniques et mutants spontanés impliqués dans l’étude. Dans ce but, nous avons utilisé 3 techniques différentes en fonction de l’antibiotique pour lequel la résistance était testée. En effet, pour
l’éthionamide, la rifampicine, l’isoniazide,….la technologie Etest® est disponible dans le
commerce. Pour le PAS, nous avons eu recours à la méthode de dilution sur agar et celle en
milieu liquide sur BacT/ALERT® 3D.
Pour déterminer si une souche est « sensible » ou « résistante » à un antibiotique, nous comparons son niveau de résistance avec les CMI connues chez M. tuberculosis. Les CMI déterminées sur milieu 7H11 ainsi que les diluants utilisés pour la préparation des différents antibiotiques sont repris dans la table 10.
Antibiotiques CMI 7H11 (µg/ml) Concentration stock (mg/ml) Dilution Diluants
RIF 1 32 32000 Méthanol
INH 1 10 10000 H2O
ETH 10 40 4000 DMSO
PAS 8 32 4000 H2O
5-FU < 0,1 50 500000 H2O
Table 10 : CMI connues chez M. tuberculosis sur milieu 7H11 et informations concernant la préparation des antibiotiques (adapté de NCCLS, 03)
Méthode de dilution sur gélose
Brièvement, 5 µl de 5 dilutions successives de 10 en 10 réalisées en milieu 7H9+ADS à partir d’une culture mycobactérienne (1 Mc Farland) sont déposés sur différentes géloses de milieu 7H11+ADS contenant des doses croissantes d’antibiotiques. Après 5 à 6 semaines d’incubation à 37°C, l’absence ou la présence d’une croissance est notée et la CMI est déterminée comme étant la plus petite concentration d’antibiotique pour laquelle on observe une perte de 2 logarithmes (99%) au niveau de la croissance.
Méthode du BacT/ALERT®3D (bioMérieux, France)
Pour cette technique, 500µl de suspension bactérienne (d’une densité comprise entre 0.5 et 1 Mc Farland) sont injectés dans des flasques BacT/ALERT dans lesquelles ont été
préalablement injectés 500µl de solution de reconstitution (MB/BACT® Reconstitution
résistance est testée. Les fioles sont ensuite introduites dans l’automate BacT/ALERT® 3D, équipé d’un détecteur colorimétrique. En cas de croissance, le dégagement de dioxyde de carbone produit par les bactéries provoque un changement de coloration du senseur colorimétrique situé à la base du flacon, détecté par la machine. Cette technologie permet une détection précoce des croissances mycobactériennes (Angeby et al., 2003).
Méthode du Etest® (AB BIODISK)
La technique du Etest® repose sur l’utilisation de bandelettes imprégnées de concentrations
croissantes d’antibiotique. Brièvement, des boites 7H11+ADS sont ensemencées à l’aide d’un écouvillon préalablement imprégné de la culture mycobactérienne à étudier (1 Mc
Farland). Lorsque la surface de la gélose est sèche, une bandelette Etest® y est déposée et les
boites sont incubées à 37°C jusqu’à l’obtention d’une croissance mycobactérienne. La présence éventuelle d’une ellipse d’inhibition de croissance autour de la bandelette est notée. La CMI est interprétée comme la concentration au niveau de laquelle l’ellipse d’inhibition de croissance bactérienne se termine (Wanger & Mills, 1996). Les Etest disponibles dans le commerce pour l’étude de souches tuberculeuses, concernent les antibiotiques : isoniazide, rifampicine, éthambutol, éthionamide,… (AB BIODISK, BioMérieux).
2.11. Courbes de croissance des mycobactéries
Un suivi est réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle différence de comportement de croissance entre des mutants spontanés de M. tuberculosis résistants à un même antibiotique mais présentant des mutations différentes (ou pas de mutation) dans le gène cible étudié. Les cultures sont réalisées en milieu Middlebrook 7H9+ADS en absence et en présence de concentrations croissantes de l’antibiotique concerné. La croissance bacillaire est suivie par
mesures de densité optique (DO600nm) réalisées à l’aide d’un densitomètre (C0800, WPA)
toutes les 72 heures pendant 32 jours. La mesure est réalisée en triplicata à partir de 3 cultures indépendantes contenant exactement les mêmes composants. L’analyse des données et les courbes sont réalisées en utilisant le programme Graphpad.