Des inhibiteurs synthétiques d’EthR stimulent l’activité anti-tuberculeuse de

« Synthetic EthR inhibitors boost antituberculous activity of ethionamide »

Willand, N., B. Dirie, X. Carette, P. Bifani, A. Singhal, M. Desroses, F. Leroux, E. Willery, V. Mathys, R. Deprez-Poulain, G. Delcroix, F. Frenois, M. Aumercier, C. Locht, V. Villeret, B. Deprez & A. R. Baulard, (2009). Nature Medicine 15: 537-544.

Les tuberculoses multi-résistantes (MDR-TB) représentent un problème croissant pour le contrôle de la tuberculose. Dans le cas de MDR-TB, il convient d’utiliser des antibiotiques de deuxième ligne qui sont en général moins efficaces et moins bien tolérés par le patient. L’un des antibiotiques de deuxième ligne les plus efficaces est l’éthionamide (ETH). Malheureusement, celui-ci est hautement toxique et son utilisation s’accompagne fréquemment d’effets indésirables tels que troubles gastro-intestinaux et toxicité hépatique. La survenue de ces effets secondaires (en particulier les nausées, vomissements et diarrhées) est principalement due à la nécessité d’utiliser de hautes doses d’ETH pour observer un effet thérapeutique (Lees, 1964).

Ces dernières années, plusieurs découvertes ont permis de mieux comprendre le mécanisme d’action et d’activation de l’éthionamide. On sait maintenant que l’ETH est un pro-médicament transformé en forme active par l’enzyme monooxygénase EthA. Son expression est contrôlée par le répresseur EthR, encodé par le gène voisin ethR, qui inhibe la transcription d’ethA en se fixant sur un opérateur localisé dans la région intergénique

ethA-ethR.

Précédemment, l’étude d’un mutant déficient en EthR a montré une augmentation de la sensibilité de celui-ci à l’ETH, comparée à la souche parentale. Ceci indique que EthR, en bloquant l’expression de EthA est responsable, par le manque d’activation, de la résistance naturelle de M. tuberculosis à l’éthionamide, nécessitant des doses élevées de cet antibiotique pour traiter les patients atteints de tuberculose.

La cristallisation et l’analyse structurelle d’EthR ont été réalisées par deux groupes scientifiques indépendants qui ont fait les mêmes constatations. Premièrement, lors de la

cristallisation, chaque monomère EthR fixe un ligand fortuit présent dans le tampon de cristallisation (hexadécyl octanoate ou 1,4-dioxane). Deuxièmement, suite à la liaison de ce ligand, EthR prend une conformation incompatible avec la fonction de répresseur. De ces observations, est née l’idée de développer un ligand capable de bloquer les fonctions de répression d’EthR sur EthA, afin d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’ETH par amélioration de son activation.

Cet article décrit le processus qui a mené à l’élaboration et à la sélection de composés (ligands) capable d’inhiber l’interaction d’EthR avec son opérateur ADN. Parmi ces composés, deux ligands (BDM31343 et BDM31381) ont été retenus comme candidats potentiels. La sélection de ces 2 ligands reposait sur les résultats d’activité in vitro, sur les tests d’analyse physico-chimique (test de solubilité, …) réalisés à l’Institut Pasteur de Lille et sur les études pharmacocinétiques que nous avons réalisées à l’ISP. Ces dernières consistaient à déterminer, in vivo, la meilleure voie d’administration (gavage ou intra-péritonéale) ainsi que la demi-vie des composés intéressants par l’étude de l’ASC (Aire sous la courbe).

Les tests d’efficacité in vitro des deux ligands sélectionnés, révélèrent que BDM31343 et BDM31381 augmentaient l’activité anti-bactérienne de l’ETH, respectivement, d’un facteur 10 et 25. Nous avons alors entamé, au sein du laboratoire de haute sécurité (type P3) de l’ISP, les études d’activité in vivo de ces composés au moyen d’un modèle d’infection tuberculeuse murine. Les souris furent infectées par voie intra-trachéale avec M. tuberculosis H37Rv-lux et un traitement (ETH seul ou en combinaison avec un des deux ligands étudiés) fut initié 7 jours après l’infection pour une durée de 21 jours (6 jours/semaine) (voir table S9 du supplément). La détermination du nombre de CFU, comptées à partir des broyats de poumons de souris ensemencés, a permis d’évaluer la capacité (in vivo) des deux ligands (BDM31381 et BDM31343) à réduire la charge mycobactérienne en présence d’ETH.

Nous avons montré que le ligand BDM31381 administré avec l’ETH, ne présentait pas d’effet significatif sur la diminution de la charge bactérienne par rapport au traitement utilisant l’ETH seul. Par contre, la co-administration d’ETH et du ligand BDM31343 réduit la charge bactérienne avec 3 x plus d’efficacité que l’ETH seul. Concrètement, après 21 jours de traitement, la même réduction de charge mycobactérienne fut observée en utilisant,

respectivement, 9 ou 27 mg/kg d’ETH qu’avec 3 ou 9 mg/kg d’ETH en association avec 100 mg/kg du ligand BDM31343.

Ce travail a donc démontré qu’il est possible d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’éthionamide en agissant pharmacologiquement sur le mécanisme régulateur de l’activation de cet antibiotique. Cette approche est originale car elle n’implique ni l’utilisation d’un nouvel antibiotique, ni de molécules activatrices du médicament, mais un ligand capable d’augmenter la production de la forme active du médicament, en bloquant la répression de sa voie activatrice. Dès lors, il est possible de conserver l’efficacité du traitement tout en réduisant les doses d’ETH utilisées ainsi que les effets secondaires liés.

L’obligation d’utiliser le DMSO pour mettre en solution l’éthionamide et les ligands, et l’obligation d’utiliser la voie d’administration intra-péritonéale, furent les principales contraintes rencontrées lors de ce travail. Actuellement, le travail en cours vise à modifier les conditions expérimentales afin d’augmenter la solubilité et l’activité des ligands étudiés.

3. L’anti-cancéreux 5-fluorouracil peut-il être utilisé comme

médicament alternatif pour le traitement d’infections tuberculeuses

multi-résistantes (MDR-TB ou XDR-TB) ?

« Can the anti-cancer drug 5-fluorouracil be used as a salvage drug for the treatment of

XDR and MDR Mycobacterium tuberculosis? »

Mathys, V., A. Singhal, M. Kiass, P. Lefevre, Seow Hwee Ng, K. Pethe, N. Kurepina, W. Boukhouchi, X.M. Wang, B. Mathema, A. Baulard, B.N. Kreiswirthet P. Bifani., (2009). Antimicrobial Agents and Chemotherapy (submitted: TMP02080-09).

Le 5-fluorouracil (5-FU) est un médicament anti-cancéreux connu depuis un peu plus de 50 ans (Bosch et al., 1958, Duschinsky et al., 1957). Actuellement, il est toujours l’agent chimiothérapeutique le plus utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé et ce malgré sa haute toxicité (Adjei, 1999). En effet, chez les eucaryotes, le 5-FU est rapidement transformé en métabolites cytotoxiques inhibant la thymidylate synthase mais aussi la réplication et la synthèse protéique (Longley et al., 2003). Pour tenter de réduire la toxicité systémique, plusieurs précurseurs du 5-FU ont été développés. L’un d’eux, la capécitabine, est absorbée au niveau de l’intestin puis métabolisée en forme active, 5-FU, via trois réactions métaboliques eucaryotes (Seidman & Aapro, 2002). La première métabolisation prend place dans le foie, la deuxième dans le foie ou dans les cellules et la troisième exclusivement dans les cellules et tout spécialement dans les cellules cancéreuses car l’enzyme impliquée (thymidine phosphorylase) est surexprimée 3 à 10 fois dans les cellules tumorales (Miwa et al., 1998, Schuller et al., 2000). Ceci a pour effet d’augmenter la concentration de 5-FU au site cible. Cette toxicité ciblée ainsi que son activité sur des tumeurs résistantes au 5-FU, expliquent l’intérêt porté, actuellement, à cette molécule (Ishikawa et al., 1997, Cao et al., 1997).

Etant donnée l’augmentation des cas de tuberculose multi-résistante, de nouveaux agents anti-tuberculeux sont nécessaires. Quelques études ont rapporté une efficacité du 5-FU pour le traitement d’infections bactériennes, virales et parasitaires (Bodet et al., 1985, Tomasz & Borek, 1959). C’est pourquoi, nous avons voulu évaluer les propriétés anti-mycobactériennes du 5-FU et de la capécitabine.

La CMI du 5-FU fut évaluée sur un panel d’isolats cliniques de M. tuberculosis incluant des souches sensibles et résistantes (MDR/XDR) aux anti-tuberculeux communément utilisés. Toutes les souches testées présentèrent une sensibilité au 5-FU à des concentrations allant de 0.2 µg/ml à 1.8 µg/ml, et ce quelque soit leur profil de sensibilité/résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux. Une sensibilité au 5-FU fut également observée chez les souches résistantes au PAS (présentant ou non une mutation du gène thyA). Cette observation présente un intérêt particulier étant donné que dans 37% des cas, la résistance au PAS est associée à des mutations de la thymidine synthase (thyA) qui semble être également une des cibles du 5-FU (Mathys et al., 2009). L’activité de la capécitabine ne fut pas évaluée in vitro étant donné l’étape d’activation de ce précurseur par trois enzymes eucaryotiques.

Suite à la mise en évidence de la haute efficacité in vitro du 5-FU sur la croissance mycobactérienne, son activité anti-tuberculeuse fut évaluée in vivo en modèle murin de tuberculose active. Nous avons d’abord comparé l’effet de 3 voies d’administration : orale (gavage), intra-trachéale (IT) et intra-péritonéale (IP). Après 14 jours de traitement, une réduction importante (près de 2 log) de la charge bactérienne pulmonaire fut observée chez les souris traitées par gavage, par voie IT et chez les souris « contrôles » traitées à l’isoniazide. La voie IP montra une moindre efficacité. Comme le gavage, contrairement à la voie IT, ne nécessite pas d’anesthésie préalable de l’animal, cette voie fut choisie pour la suite de l’étude. L’efficacité in vivo d’un traitement de 3 semaines par gavage fut ensuite évaluée. Les composés testés furent le 5-FU, la capécitabine en comparaison avec les groupes « contrôle » : traité à l’INH et non-traité. Vingt et un jours après le début du traitement, une réduction de la charge bactérienne pulmonaire de 1.87 et 1.5 logarithme fut observée, respectivement, chez les animaux traités au 5-FU et à la capécitabine, comparé au groupe non-traité. L’efficacité du 5-FU et de la capécitabine est aussi bonne que pour l’INH durant la première semaine de traitement puis l’efficacité chute, probablement à cause de la cytotoxicité du 5-FU. Deux stratégies furent appliquées dans le but de contrer cet effet toxique du 5-FU. D’abord, une plus faible dose de 5-FU fut utilisée pour traiter les souris mais un profil de CFU, similaire à celui observé avec une plus haute dose, fut obtenu. La deuxième stratégie consista à traiter les souris avec du 5-FU+GCSF (granulocyte colony stimulating factor) afin de réduire la neutropénie engendrée par le 5-FU. Cela résulta en une augmentation de l’efficacité du traitement après deux semaines. Cependant, une augmentation de la charge bactérienne fut observée pour le groupe FU-5+GCSF après 3 semaines de traitement.

The anti-cancer drug 5-fluorouracil proves to be efficacious but toxic as a salvage drug for the treatment of MDR and XDR Mycobacterium tuberculosis.

Tentative authorship: Vanessa Mathys^1±, Amit Singhal^1§±, Mehdi Kiass¹, Philippe Lefevre¹,

Seow Hwee Ng⁴, Kevin Pethe⁴, Natalia Kurepina³, Warda Boukhouchi¹, Luis Camacho⁴,

Xiao-Ming Wang¹, Barun Mathema³, Alain Baulard^2,5, Barry N. Kreiswirth³ and Pablo

Bifani^1§*

1

Laboratory of Molecular Pathology of Tuberculosis, Communicable and Infectious Diseases, Scientific Institute of Public Health (ISP), Belgium.

2

Inserm U629, Pasteur Institute, Lille, France.

3

Tuberculosis Center, Public Health Research Institute, University of Medicine & Dentistry, Newark, New Jersey, USA 07103

4

Novartis Institute for Tropical Diseases, Singapore.

*

Corresponding Author. Pablo Bifani. Address: 10 Biopolis Road, #05-01 Chromos,

Singapore 138670. E-mail: pablo.bifani@novartis.com

±

These two authors have contributed equally.

§

Abstract

The last decade we have witness a global steady increase in the emergence and spread of drug resistant Mycobacterium tuberculosis (Mtb) strains. These resistant strains render existing anti-tuberculars obsolete and underline the urgent need to identify new compounds for the treatment of tuberculosis. Our interest on the folate pathway as a possible antibacterial target has leaded us to investigate the activity of 5-fluorouracil (FU) as an anti-tubercular drug in in

vitro and in vivo models. FU is the most extensively used chemotherapeutic agent for the

treatment of advanced colorectal cancer. FU has been shown to be an irreversible inhibitor of the thymidylate synthase (ThyA) in the folate biosynthetic pathway as well as targeting DNA and RNA synthesis. The in vitro minimum inhibitory concentrations (MIC) and time kill curves were determined for selected Mtb isolates, comprising drug-susceptible, multidrug resistant (MDR) and extensively drug resistant (XDR) strains. FU proved to be a potent growth inhibitor against all clinical isolates tested at concentrations ranging from 0.2 to 2.0 µg/ml; regardless of their pre-existing susceptibility profile to other compounds. In vivo efficacy study proved FU to be highly active for the first two weeks of treatment in a murine model, while loosing some activity on the third week.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) remains as a leading pathogen responsible for extensive

morbidity and mortality worldwide. The past decade has seen the decline in the effectiveness of the current anti-tubercular drug regimen due to the emergence of drug resistance. Multidrug resistant (MDR) Mtb strains are resistant to at least rifampicin and isoniazid and most often resistant to other first line drugs (streptomycin, pyrazinamide & ethambutol) and therefore therapy requires long-term use of four or five less active or more toxic second line drugs in combination. Extensively drug resistant (XDR) Mtb strains are MDR strains which additionally are resistant to a fluroroquinolone and at least one an injectable aminoglycoside (amikacin, kanamycin) or capreomycin. XDR-TB has been recorded in 45 countries (44). The rise of MDR and XDR forms of TB around the world emphasizes an urgent need to identify new anti-tubercular agents (13).

We have been working on delineating the molecular genetics of para-aminosalicylic acid (PAS) resistance, one of the two original anti-tubercular compounds and now a second line drug used to treat MDR-TB (29). PAS resistance has been shown in some instances to be

associated with mutations in the thymidylate synthase A, encoded by the thyA gene of Mtb and required for thymine biosynthesis in the folate pathway (34). ThyA catalyzes the reductive methylation of deoxyuridine monophosphate (dUMP) to yield deoxythymidine

monophosphate (dTMP),required for de novo deoxythymidine triphosphate (dTTP) synthesis

(Figure 1A). Inhibition of ThyA causes an accumulation of 2’-deoxyuridine-5’-triphosphate (dUTP). This initiates a cascade of events which leads to thymine-less cell death (10). Interestingly, the Mtb genome encodes ThyX, an alternative flavin (FAD) dependent thymidylate synthase, which can catalyze the reductive methylation of dUMP using 5,10-mTHF as the methyl donor (31, 35). ThyX has been shown to be essential for Mtb growth (37) and thus presents a potential target for the inhibition of the Mtb folate pathway.

Mining of the already clinically approved drugs for known thymidylate synthase inhibition has lead to 5-fluorouracil (FU). FU blocks the process of methylation of dUMP into dTMP by inhibiting thimydilate synthase (Figure 1) (7, 26). The anti-cancer properties of FU were demonstrated in 1957 (4, 14), and remains today as the most extensively used chemotherapeutic agent for the treatment of advanced colorectal cancer, despite its toxicity (1). FU is an analogue of uracil whereby the C-5 hydrogen has been substituted by a fluorine atom. In eukaryotic cells, this compound is rapidly metabolized into fluorodeoxiuridine monophosphate (FdUMP), fluorodeoxiuridine triphosphate (FdUTP) and fluorouridine triphosphate (FUTP). FdUMP and FdUTP are inhibitors of DNA replication and repair while FUTP is incorporated into RNA resulting in the disruption of transcription and RNA processing (Figure 1B). The impact of enzymatic inhibition coupled with the generation of cytotoxic metabolites renders FU highly toxic; thus, clinical use is associated with various adverse side effects including myelosuppression, mucositis and various others. As such, several analogs, prodrugs or precursors of FU have been evaluated for cytotoxicity and

efficacy. One such compound is capecitabine (N-[1-(5-deoxy-β

-D-ribofuranosyl)-5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-4-pyridinyl]-n-pentyl carbamate), a FU precursor prodrug. Capecitabine is metabolized through 3 eukaryotic metabolic steps into FU, the only active form. Capecitabine is readily absorbed through the intestine and converted by a uniquely hepatic carboxylesterase into 5’-deoxy-5-fluorocytidine (5’-DFCR). 5’-DFCR is subsequently converted into 5’-deoxy-5-fluorouridine (5’DFUR) by a cytidine deaminase present in the liver and cells and finally into FU by the thymidine phosphorylase. Interestingly, in humans the thymidine phosphorylase is up-regulated 3 to 10 times in tumour cells resulting in the accumulation of the active FU at the target site (5, 30, 32, 38, 42). In sum, capecitabine is an

inactive prodrug with selective metabolism within tumours which renders it less toxic and more potent than FU. As such, in vitro anti-microbial evaluation of capecitabine is not

possible. In addition, capecitabine has proven to be highly effective to FU resistant tumours

(6, 22). The effect of FU has also been investigated for the treatment of bacterial, viral and parasitic infections (3, 7, 20, 40, 41).

Here we set-out to investigate M. tuberculosis susceptibility to FU in vitro and FU and capecitabine in vivo in a murine TB model. The minimum inhibitory concentrations (MICs) determined for a collection of clinical isolates including susceptible, drug-resistant (DR), multi-drug resistant (MDR) and extensively-drug-resistant isolates (XDR) showed this agent to have potent anti-mycobacterial properties in vitro. Moreover, both FU and capecitabine proved to have activity in vivo using an acute mouse model of Mtb infection.

Materials & Methods.

M. tuberculosis strains. Drug-susceptible (n=15) and drug-resistant (n=15) clinical isolates

were selected from the M. tuberculosis collection (n>24,000) maintained at the TB Center, Public Health Research Institute (PHRI, University of Medicine and Dentistry, New Jersey, (UMDNJ)), Newark, USA. The susceptible isolates evaluated included reference strains H37Rv (ATCC 25618), CDC1551 and W-Beijing strain HN878. Drug-resistant isolates included clinical MDR and XDR isolates (Table 1). All isolates have been previously molecularly characterized (genotyped) and were selected for their representative distribution of the 9 genetic clusters as previously described (18, 19, 28). The susceptibility profiles of these clinical isolates were previously determined as listed in Table 1.

In vitro determination of the minimum inhibitory concentration. The minimum inhibitory

concentration (MIC) of FU was determined by BacT/ALERT 3D (bioMérieux, France). The concentrations used were 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0 and 4.0 µg/ml for strains H37Rv (ATCC 25618), CDC1551 and W4 and 0.2, 0.4, 0.8, 2.0 and 4.0 µg/ml for all other strains. Strains were considered resistant when bacterial growth was observed between the growth of the neat (bacterial inoculums adjusted at 2 McFarland, no antibiotic) and the

1/100^th dilution. The in vitro activity of capecitabine was not determined as it requires to be

Time-kill-curves kinetics of 5-fluorouracil on M. tuberculosis strain H37Rv. The

Bactericidal/bacteriostatic ratio of FU was evaluated using strain H37Rv (ATCC 25618).

Frozen H37Rv stock was diluted and adjusted to a starting inoculum of OD₆₀₀=0.02 in 500 µl

7H9 medium (supplemented with OADC) and grown with rotation at 37C for 6 days. The drugs tested were FU (0.3 – 10 µ g/ml) and two controls, para-aminosalicylic acid (PAS; 0.05 to 10 µg/ml) and isoniazid (INH; 0.069 and 0.1371 µg/ml which correspond to 0.5 and 1 µM), in triplicates. Plating was done in triplicates on days 0, 1, 3 and 6 and counting tabulate on the third week. The killing curve was generated by plotting the CFU decimal logarithm

per millilitre versus time using Graph Pad PRISM^® software.

FU inhibitory effect of M. tuberculosis in C57BL/6 mice. The in vivo anti-tubercular activity

of FU was evaluated in C57BL/6 mice infected with luminescent M. tuberculosis

H37Rv-luxAB strain (39, 45). Mice were infected intra-tracheally with ~ 10² – 10³ RLU (Relative

light unit) of bacilli. Four animals were sacrificed at 24 hrs and 7 days post-infection (p.i.) for determination of the starting inoculum and the CFU at the start of treatment. Thereafter 8 animals were sacrificed per time point. Controls included untreated and INH treated animals. The route of administration of FU was first appraised in a two weeks treatment experiment whereby daily treatment by gavage and intra-peritoneal and every second day intra-tracheal procedure were monitored in the acute infection model. Based on these results, efficacy was evaluated for three weeks of treatment by gavage initiated 1 week post-infection. The compounds evaluated were FU (5 and 20 mg/Kg; Fluracedyl, Teva Pharma, Belgium), capecitabine (Xeloda, 20mg/Kg, Roche Pharmaceutical), INH (25 mg/Kg, Sigma). INH was either administered orally or in the drinking water as previously described (Scanga?).

Enumeration of mycobacteria. The mycobacterial load in the lung of infected mice was

quantified by plating on Middlebrook 7H11 agar supplemented with oleic

acid-albumin-dextrose-catalase or using a bioluminescence assay (for the determination of relative light

units [RLU]) (11). Briefly, at pre-determined time point post-infection/post-treatment mice

were euthanized by CO2 euthanization. Lungs were aseptically excised, washed in PBS and,

homogenized using 1 x PBS with 0.25% tween 80 (PBST25) and a tissue homogenizer (Idea Works Laboratory Devices, Syracuse, NY). For CFU determination various dilutions were plated on Middlebrook 7H11 agar plates in duplicates. Colonies were counted visually after

4 weeks. CFU counts obtained from two or three dilutions were used to calculate the total

RLU measurement by luminometry. For bioluminescence assay homogenate were first treated with Zapglobin (Beckman Coulter) for RBC lysis and then reading was carried out

using a Turner Design20/20 luminometer and 1% n-decylaldehyde in ethanol as the substrate

(39). For statistical analysis (Student's t test), the CFU and RLU values were converted to

log₁₀ values and log₁₀ (mean ± SE)values for CFU/lung/mouse or for RFU/lung/mouse were