Discussion générale

La résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux est une réalité actuelle, elle est aussi une menace pour l’avenir. Elle pèse de son propre poids en matière de morbidité et de mortalité, particulièrement dans les populations de malades les plus fragiles. Elle réduit également la marge thérapeutique. De ce fait, sa maîtrise est un enjeu majeur de santé.

L’étude des mécanismes de résistance aux antibiotiques est une des voies de recherche communément poursuivie. Les informations obtenues par cette démarche peuvent mener aux développements de nouvelles molécules thérapeutiques plus actives, à la mise au point de techniques moléculaires de détermination de la sensibilité/résistance d’une souche,….. Il

s’agit, cependant, d’un processus long, englobant plusieurs étapes et dont le cheminement peut être décrit comme suit :

1. Identification de la cible de l’antibiotique

2. Caractérisation du locus bactérien (opéron, gène, région promotrice,…) impliqué dans

la résistance à un antibiotique

3. Détermination de la nature phylogénétique ou « de résistance » des mutations

identifiées dans le locus étudié via des études de génétique de population réalisées sur des souches cliniques bien caractérisées

4. Détermination de la fréquence des mutations du locus étudié parmi une population de

souches cliniques et de mutants spontanés

5. Analyse du type de mutations rencontrées au sein du locus étudié (substitution, codon

stop,…)

6. Mise en évidence d’éventuelles régions « hotspot »

7. Détermination de la fréquence de mutations spécifiques au sein du locus étudié

8. Notion de « fitness bactérien »

9. Analyses structurelles de la protéine cible

10.Implications cliniques : développement de techniques moléculaires

La première étape de l’étude d’un mécanisme de résistance à un antibiotique consiste en l’identification de la cible bactérienne de celui-ci par des techniques de biologie moléculaire suivie par la caractérisation du locus impliqué (opéron, région promotrice, délétion génomique,…). Une fois identifiée et caractérisée, la séquence cible est analysée parmi une collection de souches cliniques et de mutants spontanés résistants à l’antibiotique. L’analyse se fait par séquençage de la région génomique identifiée à la recherche de mutations ponctuelles communément impliquées dans les processus de résistance aux antibiotiques chez

M. tuberculosis.

Ces études de génétique de populations sont importantes pour caractériser un mécanisme de résistance. Elles permettent, entre autres, de faire la distinction entre les mutations véritablement impliquées dans le processus de résistance et les mutations phylogénétiques (non-associées à la résistance). Cette analyse phylogénétique passe, d’une part, par des analyses in silico basée sur la comparaison des génomes tuberculeux séquencés disponibles et, d’autre part, par le séquençage de souches cliniques caractérisées appartenant aux

différentes branches de l’arbre phylogénétique. L’association entre une mutation particulière de la séquence cible et une branche de l’arbre phylogénétique doit faire suspecter une origine phylogénétique de la mutation et donc son association dans le mécanisme de résistance peut être écartée. A l’inverse, si une mutation spécifique est rencontrée dans les différentes branches de l’arbre phylogénétique et uniquement chez les souches de phénotype résistant (non présente chez les souches sensibles appartenant au même génotype), elle peut être impliquée dans le processus de résistance.

Inclure dans les études génétiques de population, à la fois des souches appartenant à diverses branches phylogénétiques et des souches d’une même appartenance phylogénétique (génotype identique) mais présentant des phénotypes de résistance différents (sensible et résistant à l’antibiotique étudié), est important (ex : étude de souches présentant des génotypes variés versus étude de souches appartenant à un même génotype « P » et « AB » pour notre analyse du mécanisme de résistance au PAS).

Une étude moléculaire de ce type est possible chez Mycobacterium tuberculosis grâce à son faible taux de polymorphisme génomique. En effet, étant donné les variations allèliques restreintes des gènes structurels chez les organismes sensibles, ils présentent « virtuellement » tous le même allèle sauvage. La détection d’une mutation impliquée dans la résistance est donc facilitée et l’interprétation des résultats est fortement simplifiée. Cette situation est assez différente de celle observée chez la plupart des bactéries qui présentent naturellement plusieurs allèles différents chez les organismes sensibles, rendant difficile la mise en évidence de mutations non-phylogénétiques mais associées à la résistance.

Par ces mêmes études génétiques de population, la fréquence avec laquelle des mutants résistants à un antibiotique présentent effectivement une mutation dans le gène cible identifié peut être déterminée. De ces chiffres, le pourcentage de souches résistantes à ce même antibiotique présentant une séquence cible sauvage (sans mutation) peut également être calculé. Ces données permettent d’évaluer les étapes à franchir avant d’envisager une compréhension complète du mécanisme de résistance étudiée.

Les études de population permettent aussi de déterminer la fréquence des différentes mutations spécifiques rencontrées au sein d’un même gène cible et, de ce fait, de mettre en évidence les mutations les plus fréquemment rencontrées chez les organismes résistants à un

antibiotique étudié. En effet, les différentes mutations d’un même gène cible ne sont pas toutes détectées à la même fréquence. Structurellement, certaines mutations sont acceptables pour la protéine (mutations permissives), d’autres sont moins bien tolérées et provoquent une réduction d’activité néfaste pour la bactérie (cfr. notion de fitness discutée ci-dessous). La détection de ces mutations fréquentes au sein de l’ADN génomique d’un échantillon, permet donc d’identifier précocement un grand nombre de patients infectés par une bactérie résistante.

Actuellement, tous les mécanismes moléculaires de résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux ne sont pas connus complètement. En effet, on connaît, pour chaque antibiotique, un certain nombre de gènes impliqués dans la résistance, mais un certain pourcentage de souches résistantes présentant des gènes cibles sauvages persistent. Par exemple, chez 96% des souches résistantes à la rifampicine, une mutation dans le gène cible rpoB codant la

sous-unité β de l’ARN polymérase est détectée mais pour 4% des souches résistantes le gène rpoB

est sauvage (non-muté), et aucune mutation dans un autre gène hypothétique pouvant être associé à la résistance à la rifampicine n’a à ce jour été mise en évidence. De ce fait, la détection d’une mutation associée à la résistance à un antibiotique dans le génome d’une souche tuberculeuse fournit une information clinique claire. Par contre, l’absence de mutation dans ce même gène cible sugère un phénotype sensible, cependant, cette hypothèse doit être interprétée avec précaution étant donné l’absence d’explication moléculaire pour un certain nombre d’organismes résistants.

L’analyse du type de mutations géniques (substitution, introduction d’un codon stop, déphasage du cadre de lecture,…) ainsi que la mise en évidence de leur position sur la séquence génique cible (dispersée le long du gène ou non) fournissent des informations intéressantes.

Lorsque des mutations sont dispersées le long du gène, la position de la mutation ne confère probablement aucun avantage sélectif pour la bactérie. C’est en général le cas, lorsqu’il y a une redondance de la fonction biologique assurée par la protéine mutée, c’est-à-dire si une ou plusieurs autres enzymes peuvent reprendre à leur charge la fonction qu’assure habituellement la protéine mutée. C’est le cas pour l’éthionamide dont les souches résistantes présentent des mutations dispersées tout au long du gène ethA, or on sait que chez M.

assure, chez les organismes résistants à l’ETH (mutés dans ethA), la fonction encore inconnue assurée par EthA chez un organisme sensible.

La même hypothèse est également formulée lorsque l’on observe chez des mutants résistants des mutations de type « knock-out » survenant par l’introduction précoce d’un codon stop ou d’un déphasage du cadre de lecture. Ce type de mutation provoque une perte totale de la synthèse de la protéine sauvage, laissant supposer que la protéine cible n’est pas essentielle à la bactérie, et une redondance biologique peut alors être envisagée. De telles mutations ont été mises en évidence dans ce travail au sein des gènes thyA et ethA, impliqués respectivement dans la résistance au PAS et à l’ETH.

A l’inverse, des régions géniques plus fréquemment mutées que les autres, appelées « Régions de Détermination de Résistance » (RDR) ou encore « hotspot », sont parfois mises en évidence. Si une mutation du type « knock-out » est significative au niveau fonctionnel, la mise en évidence de ces « hotspot » l’est tout autant. En effet, deux hypothèses fonctionnelles peuvent être formulées pour expliquer ce phénomène. Premièrement, on peut imaginer que la zone « hotspot » correspond pour la protéine au site d’interaction entre l’antibiotique et la protéine cible ; les mutations de cette région de la protéine confèrant une résistance à l’antibiotique expliqueraient leur haute fréquence parmi les souches résistantes. Une seconde interprétation possible impliquerait que la protéine cible soit essentielle pour la bactérie ; une mutation en dehors de ces zones « hotspot » ne serait pas viable (ou biologiquement défavorable) et leur détection serait donc peu fréquente parmi les souches résistantes étudiées. En effet, ces « hotspot » correspondent en général, au niveau protéinique, à des régions dont les mutations affectent moins la structure de la protéine et donc aussi sa fonction biologique. Une bactérie qui développe spontanément une mutation conférant la résistance à un antibiotique mais qui ne perturbe pas ou peu la structure et donc la fonction biologique de cette protéine, présente un avantage sélectif par rapport à une autre bactérie qui, elle, développe également une mutation dans le même gène mais dans une région provoquant une perturbation plus importante de la structure protéique et donc de l’activité biologique. Cette adaptation définit la notion de « fitness» des bactéries . Les mutations du gène rpoB associées à la résistance à la rifampicine en sont un exemple classique. La plupart de ces mutations sont concentrées dans une petite région du gène appelée « Rifampin Resistance Determining Region » ou « RRDR ». Le même raisonnement d’ « avantage sélectif » peut être retenu pour expliquer les mutations individuelles (non impliquées dans une zone « hotspot ») détectées

plus fréquemment que d’autres dans un même gène cible. Un exemple est la mutation du codon 315 du gène katG, qui est détectée chez 40-50 % des souches cliniques résistantes à l’INH et chez 98% des souches MDR issues de patients habitant la région de Mourmansk (Ramaswamy & Musser, 1998). Cette haute fréquence peut s’expliquer par le maintien d’environ 50% de son activité catalase-peroxidase, tout en conférant la résistance à l’INH (Suarez et al., 2009, Saint-Joanis et al., 1999).

Suite aux mutations de différentes régions de la protéine, les études de prédictions structurelles protéiques permettent de tester cette hypothèse en mesurant le degré de modification que subirait la structure protéique sauvage (cfr. l’étude sur le PAS). Les analyses structurelles des protéines cibles sont également très contributives pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques plus efficaces.

Les études moléculaires des souches résistantes aux antibiotiques aboutissent fréquemment à la mise au point de nouvelles applications cliniques. En effet, suite à la détermination de la fréquence des différentes mutations au sein d’un gène cible, de nombreux tests moléculaires capables de prédire rapidement le phénotype de résistance ont été proposés. La plupart de ces tests reposent sur la technique d’amplification PCR et une technique de détection des mutations qui, elle, est plus variée (séquençage, hybridation sur sonde, …). Ces tests moléculaires présentent l’avantage non négligeable d’être rapides par rapport aux tests de sensibilité traditionnels (antibiogramme) et de permettre l’initiation rapide d’un traitement adapté au patient.

Ces tests paraissent très prometteurs mais, comme mentionné précédemment, pour un certain pourcentage de souches résistantes, aucune mutation responsable n’a été identifiée. L’étude des mécanismes de résistance aux agents anti-tuberculeux et leur compréhension globale restent donc capitales afin de pouvoir déterminer, sans restriction, les profils de sensibilité/résistance d’une souche au moyen de tests moléculaires.

Le développement de nouveaux antibiotiques actifs sur les bactéries tuberculeuses représente une autre politique de lutte contre la tuberculose résistante. Deux approches sont possibles : le « high troughput screening » et le design rationnel de molécules. Cette deuxième approche est basée sur la compréhension des mécanismes de résistance (ou d’action) élucidés pour les antibiotiques usuellement utilisés. Elle peut mener au développement de nouvelles molécules

efficaces, tout comme à l’amélioration d’une molécule déjà connue pour ses effets thérapeutiques, ou encore, au développement de molécules capables d’améliorer l’efficacité d’un antibiotique utilisé pour le traitement. Notre étude sur l’éthionamide illustre la faisabilité de cette dernière stratégie.

Plusieurs facteurs sont défavorables au suivi et à la réussite du traitement anti-tuberculeux actuel, parmi ceux-ci on trouve la durée très longue de la chémothérapie (6 mois) ainsi que sa complexité, le problème de résistance aux antibiotiques engendrant l’utilisation d’antibiotiques de seconde ligne, les effets secondaires,… Tous ces facteurs hypothèquent grandement l’adhérence du patient au traitement. Les problèmes spécifiques aux pays en voie de développement, tels que l’accès aux soins de santé, le coût du traitement, la fourniture continue en médicament et la co-infection par le VIH, ne peuvent non plus être sous-estimés.

Conclusion et perspectives

L’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques antituberculeux a été rapportée dès leurs premières utilisations. On pensait ce problème contrôlable via l’utilisation de thérapies combinées. Des souches résistantes et même multirésistantes se sont cependant développées dans le monde entier. Des programmes adaptés de contrôle et de lutte ont été mis sur pied pour répondre à cette situation mais le problème persiste.

L’émergence de souches multirésistantes a ranimé l’intérêt pour les études visant la compréhension des mécanismes impliqués dans la résistance aux différents antibiotiques utilisés à l’heure actuelle. Des énormes progrès ont été réalisés dans ce domaine ces dernières années, il faut dire que la détermination de la séquence complète du génome de M.

tuberculosis a fourni une aide très précieuse pour ces études. Beaucoup d’éléments sont

cependant encore manquants, notamment pour acquérir une compréhension moléculaire pour l’ensemble des souches résistantes à un même antibiotique, ce qui n’est actuellement pas le cas. Dans ce travail, nous avons mesuré l’implication des gènes de la voie de synthèse du folate et de la thymidine dans la résistance de M. tuberculosis à l’acide p-aminosalycilique. Leur implication n’étant que partielle, des études complémentaires seront donc nécessaires pour découvrir les autres mécanismes impliqués dans la résistance à cet antibiotique. Seule une compréhension globale des mécanismes de résistance permettra le développement de tests moléculaires informatifs et un dépistage rapide des patients portant une souche tuberculeuse résistante.

Les études des caractéristiques de résistance de souches récoltées dans des populations cibles, comme celle que nous avons réalisée pour la région de Mourmansk, sont une source d’informations importantes pour la mise au point de ces tests moléculaires ciblant les mutations les plus fréquemment rencontrées.

La multirésistance de M. tuberculosis aux antibiotiques justifie également la poursuite de recherches de nouveaux antibiotiques actifs ou l’amélioration des molécules utilisées actuellement. Ce sont les buts que nous avons visés, respectivement, dans nos études sur le 5-fluorouracil et l’éthionamide. Il y a, en effet, un besoin urgent de molécules efficaces, notamment pour assurer le traitement des patients infectés par une bactérie tuberculeuse multirésistante aux antibiotiques utilisés communément à l’heure actuelle. La mise au point

d’un traitement de plus courte durée et engendrant moins d’effets secondaires pourrait permettre de réduire l’émergence de nouvelles souches résistantes, suite à un meilleur suivi du traitement par le patient.

Seule une action concertée entre tous les intervenants permettra les avancées les plus fructueuses dans la lutte contre la tuberculose. Le programme DOTS, l’introduction de nouveaux médicaments efficaces et/ou l’amélioration des antibiotiques actuels, le dépistage précoce des patients tuberculeux, et la détection rapide des cas de résistance aux antibiotiques doivent être appliqués de concert afin d’aboutir à cette finalité.

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