E. La versatilité des marqueurs isobares et les développements autour de la technique iTRAQ

III.E.1. L’approche mTRAQ®, ou comment tirer avantage des capacités de la MRM Cette approche a été développée par Applied Biosciences (aujourd’hui ABSciex) en 2010 et repose sur la MRM en ciblant les peptides tryptiques d’une protéine d’intérêt dans le but d’obtenir une détection optimale.282 Les marqueurs utilisés sont non isobares et offrent la possibilité de quantifier spécifiquement chaque version d’un peptide (i.e : marqué avec différentes formes isotopiques du marqueur).

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Figure 66 : Structure chimiques des marqeurs mTRAQ^® et fragments obtenus en mode MS/MS

Cela permet de vérifier les rapports obtenus par MRM en inversant les marqueurs entre deux échantillons par exemple. Ces marqueurs mTRAQ^® (pour « MRM-based Tag for Relative and Absolute Quantification ») non isobares ciblent directement les amines primaires terminales des peptides grâce à un groupe réactif aux peptides (GRP), l’N-hydroxysuccinimide. Ils sont une extension de la technologie des marqueurs iTRAQ mis à part le marquage isotopique (voir Figure 66 p.106) et conservent un temps de rétention identiques, une fois couplé à un peptide, ainsi qu’un comportement identique face à l’ionisation. Le recours au suivi MRM permet d’identifier et de caractériser les séquences ainsi que l’obtention de multiples points de comparaison parmi les ions de séquence (voir Figure 67 p.107). Cela augmente la spécificité de la quantification tout en permettant de remonter aux concentrations en protéines initiales et fait de cette approche une méthode puissante de comparaison de multiples échantillons.

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Figure 67 : Protocole général mTRAQ®. Les échantillons biologiques sont préparés et digérés en parallèle. Puis un aliquot de chaque échantillon est prélevé pour être mélangés avec les autres. Le marqueur mTRAQ® Δ8 est ensuite couplé aux peptides contenus dans ce mélange tandis que les différents échantillons sont marqués avec les molécules mTRAQ® Δ0 et Δ4. Enfin, un échantillon de Δ0, de Δ4 et du mélange Δ8 sont rassemblés avec un rapport 1:1:1 avant d’être analysés par MRM. Par la suite les transitions peuvent être comparées à l’étalon interne en Δ8 et entre eux grâce à ce dernier, commun à toutes les analyses

III.E.2. L’approche aTRAQ® , ou comment quantifier un acide aminé

L’approche aTRAQ® développée en 2011 (pour « amino acid Tagging for Relative and Absolute Quantification »),283 quant à elle, bien qu’identique à mTRAQ® en ce qui concerne la structure des marqueurs (Δ0 et Δ8), affirme sa différence dans le procédé utilisé et l’application du marquage isotopique. En effet, celui-ci possédant l’N-hydroxysuccinimide, il ciblera les amines primaires non pas de peptides mais d’acides aminés dans le cas de cette méthodologie. Grâce à cela il est possible de marquer un échantillon d’un peptide quelconque avec un des deux marqueurs aTRAQ® et un échantillon de ce même peptide en tant que référence avec le second. Le mécanisme de dérivation des acides aminés (voir Figure 68 p.107) consiste simplement à intégrer le marqueur aTRAQ® grâce à l’N-hydroxysuccinimide qui cible les amines primaires ou secondaires des acides aminés dans une solution tamponnée à pH basique.

Figure 68 : Dans le cadre d’une expérience aTRAQ®, l’échantillon peptidique doit d’abord être purifié de toute protéine en ajoutant une solution d’acide sulfosalicylique qui permet de faire précipiter ces dernières avant de les marquer avec les deux molécules aTRAQ®. Un mélange des deux échantillons doit être effectué avant analyse par LC-MS/MS pour pouvoir comparer les intensités des fragments sur un triple quadripôle ou un Qtrap en mode MRM

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Après mélange de l’échantillon et de l’analyte, ceux-ci sont injectés sur un système LC-MS/MS (triple quadripôle ou Qtrap en mode MRM) avec séparation chromatographique sur colonne C18 thermostatée à 50 °C. Un point important à noter est la capacité à multiplexer de telles analyses jusqu’à 45 acides aminés ou structures similaires (voir Figure 69 p.108) grâce à l’utilisation d’un algorithme pour faire de la « Scheduled MRM » afin de maximiser le « dwell time » pour chaque transition tout en en suivant un grand nombre, ceci ayant pour conséquence une qualité optimale des données. Le « dwell time » se définit comme étant le temps pendant lequel un système donné va rester dans un état donné, en l’occurrence cela correspond au temps au cours duquel l’analyseur conservera ses paramètres pour le suivi de plusieurs transitions données avant de les changer pour passer à un autre ensemble de paramètres.

En utilisant cette méthode, deux acides aminés marqués par les deux formes isotopiques des marqueurs aTRAQ® possèderont le même temps de rétention sans pouvoir être donc différenciés. Et c’est bien l’analyse par MRM des transitions qui permet de caractériser les paires légères/lourdes d’acides aminés (voir Figure 70 p.109).

Figure 69 : Chromatogramme illustrant la capacité d’analyse avec des réactifs aTRAQ sur 44 acides aminés, petites molécules et protéines en LC-MS/MS mode MRM sur une élution de 18 minutes

L’approche aTRAQ® permet, comme les autres techniques de type X-TRAQ, de former des fragments qui apparaissent dans les régions de basses masses et qui ne présentent que très peu d’interférences et donc de risque d’obtenir des mesures biaisées. La précision et la justesse des mesures sont optimales grâce à l’utilisation d’étalons internes tandis que la comparaison des temps de rétention et des poids moléculaires de chaque acide aminé permet d’obtenir une confirmation supplémentaire.

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Figure 70 : Protocole générique pour l’analyse d’acides aminés (AAA) se servant des marqueurs aTRAQ®

En résumé, cette méthode est extrêmement puissante pour effectuer des analyses de type AAA pour « Analyse d’Acide Aminé » grâce au suivi spécifique des transitions acide aminé marqué/fragment de la sonde.