B. Le décompte spectral

La seconde approche a été développée plus récemment.362 Elle se base sur l’observation empirique selon laquelle plus une protéine donnée sera présente en quantité importante dans un échantillon et plus grand sera le nombre de spectres de fragmentation collectés pour les peptides de la protéine en question. Par conséquent, la quantification relative peut être effectuée en comparant le nombre de spectres obtenus de cette manière entre séries d’expérimentations. A l’inverse de la quantification par mesure d’aires, le décompte de spectres bénéficie d’une acquisition importante de données pendant la durée d’une élution chromatographique à la fois pour l’identification et la quantification de la protéine d’intérêt. En revanche, l’exclusion dynamique d’ions ayant déjà été sélectionnés, procédure usuelle en quantification « label-free », se fait au détriment d’une quantification juste et précise.363 Cette méthode est très intuitive et séduisante en termes pratiques. Cependant l’approche par décompte de spectres est toujours très controversée à cause de l’absence de mesure directe d’aucune propriété physique d’un peptide donné. Elle atteste même que la linéarité de la réponse est identique pour toutes les protéines. En réalité, la réponse spectrale est différente pour chaque peptide du fait, tout d’abord, du comportement chromatographique de celui-ci (temps de rétention, largeur de pic) qui varie pour chaque composé ; deuxièmement cette réponse va évoluer en fonction de l’efficacité d’ionisation qui peut varier. En conséquence de quoi, et dans l’optique de fournir une quantification raisonnable d’une protéine, il est nécessaire de fournir un grand nombre de spectres, même pour une seule protéine. En effet, Old et al. ont montré en 2005 que, même s’il était possible de détecter une variation quantitative d’un facteur trois d’une protéine donnée avec seulement quatre spectres, ce nombre augmentait exponentiellement si l’on souhaitait quantifier des variations plus faibles (e.g : 15 spectres pour une variation d’un facteur deux). A cet instant d’autres complications entrent en jeu comme les effets de saturation qui peuvent être observés pour un grand nombre d’acquisition de spectres tout en sachant que le niveau de saturation sera différent pour chaque protéine étudiée.

358 R. H. Bateman, R. Carruthers, J. B. Hoyes, C. Jones, J. I. Langridge, A. Millar, J. P. C. Vissers, J. Am. Soc.

Mass Spectrom. 2002, 13, 792–803

359 T. Nakamura, N. Dohmae, K. Takio, PROTEOMICS 2004, 4, 2558–2566

360 R. Niggeweg, T. Köcher, M. Gentzel, A. Buscaino, M. Taipale, A. Akhtar, M. Wilm, PROTEOMICS 2006, 6, 41–53

361 J. C. Silva, Mol. Cell. Proteomics 2005, 5, 589–607

362 H. Liu, R. G. Sadygov, J. R. Yates, Anal. Chem. 2004, 76, 4193–4201

126

Néanmoins, la corrélation entre une quantité donnée de protéine et le nombre de spectres de fragmentation est un point qui pousse toujours plus loin la mesure absolue de niveaux d’expression de protéines par cette méthode. A titre d’exemple Rappsilber et al. ont, en 2002,364 mis au point l’outil PAI (pour « Protein Abundance Index ») en divisant le nombre de peptides observés après digestion trypsique d’une protéine par le nombre de tous les peptides tryptiques possibles dans la gamme de masse définie. Cet outil a même été amélioré (emPAI pour « exponentially modified Protein Abundance Index ») avec une meilleure corrélation sur une protéine connue, la HSA (pour « Human Serum Albumin »).365

D’autres méthodes similaires ont été mises au point, notamment l’approche P3 (pour « Proteotypic Peptide Profiling ») par Craig et al. en 2005.³⁶⁶ Celle-ci décrit un algorithme qui compare les bases de données de séquences peptidiques protéotypiques aux identifications effectuées par spectrométrie de masse en tandem. Les bases de données sont scannées par collections entières pour tenter de découvrir quelles protéines sont représentées parmi les séquences enregistrées, puis les spectres de masse sont analysés en détails avec assistance des peptides protéotypiques correspondant. D’autres résultats obtenus par Lu et al. en 2007 avec la méthode APEX (pour « Absolute Protein Expression Profiling ») suggèrent que les niveaux d’expression de protéines peuvent être déterminés avec des valeurs d’ordres de grandeur corrects et corrélés à des analyses par Western blot, gels 2D et cytométrie de flux.367

Les approches label-free sont certainement les méthodes qui souffrent le plus d’une justesse modeste parmi les nombreuses techniques de quantification par spectrométrie de masse lorsque l’on considère le processus expérimental global et les nombreuses variations systématiques ou non systématiques observées.368,369 Ceci ayant pour conséquence de chercher à minimiser le nombre d’étapes expérimentales et de contrôler au mieux la reproductibilité à chaque étape. Néanmoins, la quantification « label-free » vaut la peine d’être développée pour plusieurs raisons :

· De façon pratique, le temps utilisé à introduire un marquage dans une protéine est écarté et des économies par rapport au coût des marqueurs sont à noter.

· Du point de vue de la stratégie analytique, il n’y a pas de limite au nombre d’expériences qui peuvent être comparées (sauf éventuellement la capacité de calcul et de stockage de l’ordinateur utilisé). De plus, à l’inverse des techniques de marquage isotopique, la

364 J. Rappsilber, Genome Res. 2002, 12, 1231–1245

365 Y. Ishihama, Mol. Cell. Proteomics 2005, 4, 1265–1272

366 R. Craig, J. P. Cortens, R. C. Beavis, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 1844–1850

367 P. Lu, C. Vogel, R. Wang, X. Yao, E. M. Marcotte, Nat. Biotechnol. 2007, 25, 117–124

368 N. Colaert, J. Vandekerckhove, K. Gevaert, L. Martens, PROTEOMICS 2011, 11, 1110–1113

369 D. A. Megger, L. L. Pott, M. Ahrens, J. Padden, T. Bracht, K. Kuhlmann, M. Eisenacher, H. E. Meyer, B. Sitek, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 2014, 1844, 967–976

127

complexité des spectres de masse n’augmente pas en termes de nombre de peptides détectés en une expérience.

· Enfin, il y a des preuves selon lesquelles les méthodes « label-free » montrent une plus large gamme dynamique de quantification (2 à 3 ordres de grandeur) comparé à la plupart des techniques de marquage isotopique (2 ordres de grandeur maximum), les rendant très attirantes en particulier pour l’analyse d’importants changements dans le niveau d’expression de certaines protéines.

En conclusion, les approches « label-free » ne sont pas encore avantageuses par rapport aux méthodologies à base de marquage du fait des limitations technologiques en terme de retraitement des données, de bases de données existantes, de puissance de calcul des systèmes informatiques, mais aussi de la sensibilité des instruments et des mesures effectuées qui nécessitent encore un marquage pour rendre singulier un sujet d’étude, comme une protéine ou un peptide dans un mélange. C’est un désavantage qui pourrait bientôt disparaître dans la décennie à venir à mesure que les performances des instruments d’analyse augmentent sans cesse.

128

Tableau 11 : Résumé des techniques de quantification par marquage chimique, métabolique et de type label-free

Marquage Technique / Année de publication Méthode de suivi / originalité Qualités Inconvénients

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PAL370 1962 ESI-MS ; MALDI-MS ; ESI-MALDI-MS/MALDI-MS et MRM (QToF/QqQ) / Utilisation de lumière pour libérer le peptide marqué

Sélection d’une protéine dans un mélange grâce à une intéraction protéine-ligand immobilisé.

Caractérisation du site d’affinité grâce à la liaison d’avec le marqueur photoaffin.

Caractérisation de la protéine grâce aux peptides protéolytiques hors site de liaison.

Longueurs d’ondes élevées et inertes pour le solvant. Synthèse aisée d’arylazides.

Choix d’un ligand spécifique à une protéine ciblée. Temps important d’irradiation créant un risque de marquage non spécifique.

Courte longueur d’onde utilisée dans le cas des arylazides qui peuvent donner des nitrènes comme produits

secondaires. ICAT371 1999 LC-MS / Marqueur avec des isotopes pour la quantification et une biotine pour la purification

Isolation des protéines marquées par chromatographie d’affinité.

Améliorations du marqueur pour éviter les problématiques liées à la biotine (cITAC et pITAC).

Utilisation du deutérium entraînant des différences d’élution.

PTM non quantifiables car retenues par la purification par chromatographie d’affinité.

Biotine hydrophobe entraînant une élution des peptides dans une mince fenêtre.

Interférence possible de la biotine avec la recherche de séquence dans les bases de données.

Coût des marqueurs ICAT en isotopes stables

potentiellement prohibitif pour la démocratisation de la technique.

Impossibilité de quantifier des protéines sans cystéine. Relarguage des peptides biotinylés non quantitatif. ICP-MS372

2000

Ionisation par plasma / MS élémentaire

Détection ultrasensible pour une majorité de métaux et d’hétéroatomes (Sélénium, iode, phosphore, tellure)

Incorporation des éléments métalliques et semi métalliques dans les séquences peptidiques.

370 A. Singh, E. R. Thornton, F. H. Westheimer, J. Biol. Chem. 1962, 237, PC3006-PC3008

371 S. P. Gygi, B. Rist, S. A. Gerber, F. Turecek, M. H. Gelb, R. Aebersold, Nat. Biotechnol. 1999, 17, 994–999

129

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ECAT³⁷³ 2001 ICP-MS (ionisation plasma)/ MS élémentaire à base de lanthanide

Multiplexage important possible en utilisant différents lanthanides.

Haute sensibilité et haute spécificité fournie par le lanthanide.

Stabilité du cation de lanthanide dans le cycle supramoléculaire. MCAT³⁷⁴ 2002 MS et LC-MS/MS par CID (QToF/QqQ) / Dérivation de lysine en homoarginine

Marquage sélectif des résidus lysines.

Identification simple et rapide en MS des peptides par contrôles des différences de masse (21 et/ou 42).

Larges applications possibles comme le suivi de l’évolution du niveau d’expression des protéines.

Analyse de polymorphismes de protéines.

Biais dans le marquage dans le cas de miscleavage par l’enzyme de digestion et donc dans la quantification. Etude d’ion mono et dichargé pouvant complexifier le traitement des données.

SPICAT / SP2ICAT³⁷⁵ 2002 µLC-MS (trappe à ion) µLC-MS/MS (SRM)

Sélection d’une protéine dans un mélange grâce à une intéraction protéine-ligand immobilisé sur support solide. Caractérisation du site d’affinité grâce à la liaison d’avec le marqueur photoaffin.

Choix d’un ligand spécifique à une protéine ciblée.

Limité aux protéines contenant des cystéines ou des ponts disulfures pouvant être réduits.

AQUA³⁷⁶ 2003 ESI-MS/MS et MRM (QToF/QqQ) / Peptides protéotypiques marqués

Combinaison avec SDS-PAGE et simplification des analyses. Attractivité avec un grand nombre de séquences

disponibles

Variabilité de la digestion enzymatique : à contrôler sytématiquement.

Stabilité/pureté des étalons.

Modification chimique de l’étalon possible. Taille limitée des peptides (< 15 acides aminés) IDBEST377 2003 LC-MS/MS (ISF378) /Utilisation concomitante de l’ICP et de l’ESI/MALDI-MS

Utilisation de marqueurs (légers et lourds) composés d’hétéroéléments à fort défaut de masse pouvant être détectés de manière spécifique et sensible en ICP-MS. Complémentarité de la quantification relative avec la quantification absolue par ICP-MS.

Inutilisable sur des appareils de résolution inférieure à 10 000 pour discriminer le défaut de masse.

373 C. Zhang, F. Wu, Y. Zhang, X. Wang, X. Zhang, J. Anal. At. Spectrom. 2001, 16, 1393–1396

374 G. Cagney, A. Emili, Nat Biotech 2002, 20, 163–170

375 H. Zhou, J. A. Ranish, J. D. Watts, R. Aebersold, Nat. Biotechnol. 2002, 20, 512–515

376 S. A. Gerber, J. Rush, O. Stemman, M. W. Kirschner, S. P. Gygi, Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 100, 6940–6945

377 M. P. Hall, S. Ashrafi, I. Obegi, R. Petesch, J. N. Peterson, L. V. Schneider, J. Mass Spectrom. 2003, 38, 809–816

130

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TMT³⁷⁹ 2003 MS/MS par CID (QToF/QqQ/ToF-ToF/cellule HCD) / Quantification du fragment portant le marquage

Structures similaires des différents marqueurs qui permettent de conserver des conditions de marquage et d’élution identiques.

Sous-estimation d’importantes variations des protéomes (interférences du bruit de fond et contamination

isotopique).

Temps d’analyse augmenté par nécessité d’acquérir des spectres MS/MS. iTRAQ380 2004 ESI-MS/MS et MRM par CID (QToF/QqQ) MALDI-ToF/ToF par CID / Sonde et groupe équilibrant dans un fragment de masse constante

Protocoles de marquage établis.

Composés iTRAQ de base disponibles à la vente. Adapté à l’étude de PTMs, comme la mesure et le suivi temporelle de phosphorylations.

Pas de limite aux systèmes incorporant les isotopes pendant la culture.

Multiplexage (à 4 ou 8 composés isobares). Coefficients de variation de 15 à 17 %.

Sous-estimation d’importantes variations des protéomes (interférences du bruit de fond et contamination

isotopique).

Temps d’analyse augmenté par nécessité d’acquérir des spectres MS/MS.

Difficulté à être utilisé sur des trappes à ion (faibles masses des fragments). ICPL³⁸¹ 2005 MALDI-ToF/ToF / Marquage des résidus cystéines de protéines

Applicable à n’importe quel échantillon de protéine possédant des amines libres, ou n’importe quel extrait tissulaire ou de fluide biologique en contenant. Permet un important recouvrement de séquence. Permet l’analyse de PTM et d’isoformes.

Multiplexage jusqu’à 3 échantillons.

Dénaturation de protéines pour accéder à tous les sites aminés libres.

Vérification de la complétion du marquage de la protéine avec une étape supplémentaire.

379 A. Thompson, J. Schäfer, K. Kuhn, S. Kienle, J. Schwarz, G. Schmidt, T. Neumann, C. Hamon, Anal. Chem. 2003, 75, 1895–1904

380 P. L. Ross, Molecular & Cellular Proteomics 2004, 3, 1154–1169

131

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MECT³⁸² 2006 LC-MS, LC-MS/MS (ESI-QToF) et MALDI-ToF-MS / Marquage d’amines primaires

Applicable à tout peptide avec une amine primaire libre (N-ter ou lysine).

Faible coût grâce à l’anhydride bicyclique d’acide diéthylènetriamine-N,N,N’,N’’,N’’-pentaacétique.

Quantification relative (comparaison des aires des signaux). Possibilité de combiner l’analyse MALDI-ToF-MS avec l’ICP-MS et la LC-l’ICP-MS/l’ICP-MS.

Identification par spectre de fragmentation.

Coût des terres rares pour la version 4plex.

MeCAT383 2007 ICP-MS (ionisation plasma) / MS élémentaire offrant des dérivations supplémentaires

Dérivations supplémentaires possibles grâce au groupement modifiable (R).

Multiplexage important possible en utilisant différents lanthanides.

Haute sensibilité et spécificité fournie par le lanthanide.

Stabilité du cation de lanthanide dans le cycle supramoléculaire. OxICAT³⁸⁴ 2008 LC-MS / Détermination d’états d’oxydation de cystéines

Utilisation possible pour une grande variété de cellules et d’organismes.

Outil puissant pour l’identification, la quantification et le suivi des oxydations de ponts disulfures in vivo.

Incapacité à identifier et quantifier les hauts degrés d’oxydation des cystéines (acide sulfénique et sulfonique).

IPTL385 2009 MALDI-ToF/ToF et nLC-LTQ Orbitrap (CID) Mélange isobare de peptides

Conçu pour éviter le recouvrement d’avec des fragments peptidiques (marquages en C-ter et N-ter inversés entre deux mélanges de peptides).

Facilité de marquage en C-ter et N-ter grâce au choix de digestion enzymatique (Lys-C).

Multiples points de comparaison dans les spectres MS/MS pour chaque fragment (traitement statistique possible). Adapté aux trappes à ion.

Multiplexage limité à trois échantillons.

382 H. Liu, Y. Zhang, J. Wang, D. Wang, C. Zhou, Y. Cai, X. Qian, Analytical Chemistry 2006, 78, 6614–6621

383 R. Ahrends, S. Pieper, A. Kuhn, H. Weisshoff, M. Hamester, T. Lindemann, C. Scheler, K. Lehmann, K. Taubner, M. W. Linscheid, Mol. Cell. Proteomics 2007, 6, 1907–

1916

384 L. I. Leichert, F. Gehrke, H. V. Gudiseva, T. Blackwell, M. Ilbert, A. K. Walker, J. R. Strahler, P. C. Andrews, U. Jakob, Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105, 8197–8202

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MECT³⁸⁶ 2006 ESI-MS/MS et MRM par CID (QToF/QqQ) MALDI-ToF/ToF par CID / Inspiré des marqueurs iTRAQ mais non isobares

Quantification spécifique de chaque version du peptide marqué.

Possibilité de marquer indifféremment l’analyte et la référence.

Possibilité de normaliser les mesures et d’effectuer des comparaisons croisées.

Approche économe.

Temps d’analyse accru par nécessité d’acquérir un spectre MS/MS. aTRAQ®387 2011 ESI-MS/MS et MRM par CID (QToF/QqQ) MALDI-ToF/ToF par CID / Application des marqueurs mTRAQ à l’analyse d’acides aminés (AAA)

Analyse des acides aminés (AAA) de manière juste et précise en utilisant deux formes (lourde et légère) de marqueur aTRAQ® similaire aux marqueurs mTRAQ® et iTRAQ.

Marqueurs non isobares éliminant la superposition des masses en mode MS.

Temps d’analyse accru par nécessité d’acquérir un spectre MS/MS.

386 H. Liu, Y. Zhang, J. Wang, D. Wang, C. Zhou, Y. Cai, X. Qian, Analytical Chemistry 2006, 78, 6614–6621

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Intégration d’aires388 2002 ESI-MS et MS/MS / Unique analyse pour identifier et quantifier

Pas d’étape de marquage.

Quantification et identification en mode MS/MS simultanément.

Très important volume de données à retraiter.

Précision et justesse sujettes à d’importantes variations.

Décompte spectral389 2004 ESI-MS et MS/MS / Utilisation de la MS¹ et de la MS²

Pas d’étape de marquage.

Analyses en mode MS pour l’identification du peptide. Analyse en mode MS/MS pour la quantification des peptides.

Grand nombre d’expérimentations à effectuer. Très important volume de données à retraiter. Grande complexité des spectres de fragmentation. Précision et justesse sujettes à d’importantes variations.

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QconCAT 390 2005 LC-MS/MS et MRM (QToF/QqQ) / Peptide chimérique utilisable pour quantifier plusieurs protéines

Une fois le gène codant pour un peptide QconCAT cloné, la production de ce peptide peut être faite sur demande et à volonté.

Acides aminés lourds utilisés : [¹³C6,¹⁵N2] L-lysine, [13C₆,15N]L-leucine et [13C₆,15N₄]L-arginine

Variabilité de la digestion enzymatique à contrôler sytématiquement

Stabilité/pureté des étalons

Modification chimique de l’étalon possible.

Pas de conformation préférentielle (folding) permettant une digestion enzymatique rapide mais entraînant une

différence de digestion par rapport à la protéine cible.

PSAQ³⁹¹ 2007 LC-MS/MS et MRM (QToF/QqQ) / Protéine cible entière marquée

Analyse possible n’importe quelle protéine.

Quantification de la quantité totale d’anticorps (par rapport au test ELISA).

Acides aminés lourds utilisés : [13C₆,15N₂] L-lysine, [13C₆,15N]L-leucine et [13C₆,15N₄]L-arginine.

Coût important d’une analyse : 900 $ contre 375 $ pour ELISA.

388 P. V. Bondarenko, D. Chelius, T. A. Shaler, Anal. Chem. 2002, 74, 4741–4749

389 H. Liu, R. G. Sadygov, J. R. Yates, Anal. Chem. 2004, 76, 4193–4201

390 R. J. Beynon, M. K. Doherty, J. M. Pratt, S. J. Gaskell, Nat. Methods 2005, 2, 587–589

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SILAC³⁹² 2002 LC-MS / Comparaison de niveaux d’expression de protéomes entiers

Pas de réaction chimique pour l’incorporation des isotopes. Incorporation des isotopes stables à un stade précoce de la préparation des protéines en utilisant le métabolisme des cellules limitant ainsi les variations de préparation d’échantillons.

Multiplexage jusqu’à 3 échantillons.

Acides aminés lourds utilisés : [13C₆,15N₂] L-lysine, [13C₆,15N]L-leucine et [13C₆,15N₄]L-arginine

Peu adapté à un grand nombre de protocoles requérant une production à grande échelle par manque de sources de sérum enrichi en ¹⁵N.

Dépend du marquage endogène des protéines par des isotopes lourds, impossible à mettre en place chez un patient. SILAP393 2009 LC-MS / Etude de protéomes de sources de fluides biologiques

Comparaison rapide de l’évolution entre deux protéomes entiers.

Acides aminés lourds utilisés : [¹³C6,¹⁵N2] L-lysine, [¹³C6,¹⁵N]L-leucine et [¹³C6,¹⁵N4]L-arginine

Validation de l’analyse par Western blot. Peu adapté aux analyses à grande échelle.

392 S.-E. Ong, Mol. Cell. Proteomics 2002, 1, 376–386

135 Conclusion

La spectrométrie de masse représente un outil qui permet le criblage extrêmement rapide des études de protéomique de type « shotgun », mais aussi d’interactions ligands/protéines. Et, grâce au développement instrumental qui permet sans cesse d’améliorer la sensibilité et la résolution des analyses, celle-ci peut se positionner comme voie incontournable dans le processus de développement de médicaments avec l’explosion du nombre de cibles thérapeutiques. 394 Dans cette optique, les méthodes MS représentent des alternatives tout à fait crédibles et fiables grâce à leur spécificité sans équivalent, leur très haute sensibilité, et leur capacité à multiplexer les expérimentations basées sur la SID-MS. Cela amène donc au choix de la technique à utiliser qui devra se faire en fonction de l’expérimentation et de son objectif et non pas à l’utilisation unilatérale d’une seule méthodologie. En effet chaque approche propose des avantages tout en affichant certains inconvénients et c’est bien la minimisation des inconvénients qui permettra de sélectionner la plus adaptée pour une expérimentation donnée tandis que les avantages mettront plus l’accent sur l’objectif recherché par le manipulateur (SILAC/SILAP versus AQUA, QconCAT, PSAQ , iTRAQ, ICAT etc…) en orientant le choix vers un marquage chimique, métabolique ou une étude type label-free. Cependant, lors des premières phases de découverte de biomarqueurs, l’accent est en premier lieu mis sur la précision des mesures et non pas la justesse des évaluations. Plus en aval, au moment de la validation des méthodes, le besoin de justesse et de précision tout autant que la signification statistique seront prédominants appelant à des techniques très performantes dans des situations d’analyse de protéines ciblées. De plus, à mesure que le développement avance au stade clinique, le besoin de disposer de méthodologies facilement, rapidement et efficacement transposables se fera ressentir au moment des comparaisons inter laboratoires.

Ainsi, dans l’optique de gagner en reconnaissance, ces méthodologies MS doivent être validées avec précaution et leur justesse/précision évaluées de façon rigoureuse.³⁹⁵ Bien entendu, la détection et la quantification doivent être robustes, spécifiques, sensibles, précises et reproductibles (incluant la reproductibilité inter laboratoires). En outre, leur capacité de multiplexage jusqu’à 10 analyses simultanées permet une grande adaptabilité. A cela il faut ajouter le fait que la découverte de nouveaux marqueurs permet de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans diverses pathologies, d’améliorer les pronostics, de développer des diagnostics toujours plus sensibles et tôt dans l’évolution d’une pathologie, d’identifier les cibles thérapeutiques et d’améliorer la compréhension des mécanismes d’action des médicaments.

394 P. Chène, ChemMedChem 2006, 1, 400–411

395 C. T. Viswanathan, S. Bansal, B. Booth, A. J. DeStefano, M. J. Rose, J. Sailstad, V. P. Shah, J. P. Skelly, P. G. Swann, R. Weiner, Pharm. Res. 2007, 24, 1962–1973

136

Les travaux de recherche de cette thèse s’inscrivent directement dans ce domaine de la quantification par dilution isotopique appliquée à l’étude d’interaction récepteur-ligand peptidique. Ces études ont été effectuées par spectrométrie de masse MALDI-ToF, plate-forme d’analyse très peu employée pour la quantification de biomolécules jusqu’à maintenant à laquelle sera dédié le

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