le Mutation de récepteur RCPG quelconque Mesure par LASER
Chapitre 2 : La quantification par dilution isotopique de peptides peptides
III. A. La pêche aux protéines, ou Photoaffinity labelling
Le marquage par photoaffinité ou PAL pour « Photo Affinity Labelling » correspond à la création d’une liaison covalente entre un ligand et une protéine par irradiation UV. A l’origine, cette
212 E. K. Papachristou, T. I. Roumeliotis, A. Chrysagi, C. Trigoni, E. Charvalos, P. A. Townsend, K. Pavlakis, S. D. Garbis, J. Proteome Res. 2013, 12, 2078–2089
213 A.-C. Gingras, M. Gstaiger, B. Raught, R. Aebersold, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 645–654
214 J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage, Nature 1975, 258, 598–599
215 E. Sulkowski, Trends in Biotechnology 1985, 3, 1–7
216 T. E. Thingholm, O. N. Jensen, Methods Mol. Biol. Clifton NJ 2009, 527, 47–56, xi
217 H. R. Fuller, N. T. Man, L. T. Lam, V. A. Shamanin, E. J. Androphy, G. E. Morris, J. Proteome Res. 2010, 9, 4228–4233
218 W. K. Cho, X.-Y. Chen, Y. Rim, H. Chu, S. Kim, S.-W. Kim, Z.-Y. Park, J.-Y. Kim, J. Plant Physiol. 2010,
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technique est née en 1962 et a connu depuis bien des améliorations.219,220 Celle-ci a été développée petit à petit grâce à des marquages qui ont été effectués avec une bonne fiabilité et une bonne reproductibilité avec des phénylazides,221 diazirines222 et des photophores de type benzophénone (voir Figure 43 p.86).223
Figure 43 : Structure chimiques d’éléments utilisés pour le marquage photoaffin de protéines. En haut différentes diazirines, en bas une structure de phénylazide qui vont se lier par photoréaction à un site de protéine piégée par affinité envers le site réactif du marqueur PAL
Un nouveau marqueur a récemment été présenté, le TIP pour « Target Identification Probe » (voir Figure 44 ci-dessous),224 et utilisé avec succès pour identifier l’interface entre la cyclosporine A (CsA), une drogue, et sa cible protéique la cyclophiline A (CypA) en présence de trois autres protéines non liantes. La stratégie consistait en un couplage du TIP marqué par 11 deutériums et sa version hydrogénée en mélange 1:1 sur le ligand CsA. Par la suite, la molécule résultante a été incubée avec le mélange de protéines sus-cité et la photoréaction enclenchée. La conséquence a alors été la réaction de liaison croisée avec la protéine CypA interagissant de façon spécifique avec CsA. Puis, une chromatographie d’affinité a été effectuée sur des billes de streptavidine pour purifier l’entité protéine-ligand créée avant de passer à l’étape de digestion enzymatique usuelle par action de la trypsine.
219 A. Singh, E. R. Thornton, F. H. Westheimer, J. Biol. Chem. 1962, 237, PC3006-PC3008
220 T. Tomohiro, M. Hashimoto, Y. Hatanaka, Chem. Rec. 2005, 5, 385–395
221 R. Wombacher, A. Jäschke, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 8594–8595
222 L. Dubinsky, B. P. Krom, M. M. Meijler, Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 554–570
223 J. Brunner, Annu. Rev. Biochem. 1993, 62, 483–514
224 S. M. Lamos, C. J. Krusemark, C. J. McGee, M. Scalf, L. M. Smith, P. J. Belshaw, Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4329–4333
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Figure 44 : Structure du réactif photoaffin marqué isotopiquement : TIP pour Target Identification Probe
Vient ensuite le temps de l’analyse des peptides formés qui peut se faire par ionisation ESI ou MALDI suivie d’expériences de MS/MS dans le but d’obtenir des informations de séquence à propos des peptides protéolytiques d’une part, et pour identifier les peptides modifiés par la photoliaison du TIP d’autre part. De telles identifications sont facilitées grâce au motif isotopique caractéristique des peptides modifiés et à l’incrément de masse créé par le TIP qui présente 11 sites deutérés. Cela permet également d’identifier les séquences peptidiques de la région de liaison de la protéine cible. En effet, l’étape de liaison croisée, du fait de la faible distance entre le site réactif et le photomarqueur, ne se fera que sur les groupements à proximité du site de liaison de la protéine, tandis que les peptides non modifiés permettent, après la digestion, d’identifier la protéine qui a été pêchée dans le milieu biologique grâce au marqueur qui agit alors comme un appât.
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Figure 45 : Stratégie pour l’analyse d’interactions protéine-ligand via un marquage photoaffin par un mélange 1:1 de marqueur D0 et D11 pour l’étude de l’interaction CypA-CsA (cyclosporine A et cyclophiline A)
Le lent développement de cette technique, de 1962 à 2006, montre les problèmes rencontrés tout particulièrement du point de vue de la complexité des échantillons. En effet, à un stade précoce de développement, cette problématique n’est pas du tout à l’ordre du jour étant donné que la priorité est de parvenir à créer un système et des conditions d’analyse dans un cas idéal, autrement dit à partir d’une molécule seule. C’est ensuite que vient l’étape de complexification de la technique analytique qui va de pair avec l’utilisation d’échantillons biologiques complexes. Le développement de la technique PAL s’est alors heurté au besoin de séparer les différents composants de ces échantillons biologiques pour mener à terme le développement de cette approche. Or c’est également dans les années 1960, en 1964 plus précisément, que la première mention d’une affinité entre la biotine et l’avidine a été citée.225 Et c’est bien après que la possibilité de développer une méthode de purification d’échantillons biologiques complexes est apparue par nécessité, en 1968 et 1976 avec la démonstration de la technique de chromatographie d’affinité.226,227 En revanche, ce n’est que bien plus tard que cette technique de séparation a été transférée aux études par spectrométrie de masse de biomolécules comme en témoignent les nombreux développement de méthodes analytiques qui seront abordées tout au long de ce chapitre.
III.B. Les techniques de marquage conçues pour une purification par affinité : les méthodes X-CAT
III.B.1. La première approche de marquage isotopique combinée à une purification par affinité : ICAT
La première de ces diverses techniques est dénommée ICAT (pour « Isotope Coded Affinity Tag »). C’est une méthode de marquage isotopique utilisée en protéomique quantitative qui se sert de réactifs chimiques. Ces sondes chimiques sont composées de trois éléments :
· Un groupe réactif pour le marquage d’acides aminés sur leur chaîne latérale (e.g : groupe iodoacétamide pour le marquage des cystéines).
· Un groupe espaceur marqué par un ou plusieurs isotopes stables.
· Un marqueur pour l’isolation par affinité (e.g : la biotine) des peptides ou protéines marquées.
225 R. D. Wei, L. D. Wright, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1964, 117, 341–344
226 CUATRECA.P, M. WILCHEK, BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 1968, 33, 235
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Figure 46 : Structure et réactivité d’un réactif ICAT
Les premiers marqueurs ont été développés et introduits avec du deutérium par Gygi et al. en 1999 (voir Figure 46 p.89).228 Puis, plus tard le 13C a remplacé le deutérium. Dans l’optique de comparer deux protéines, un échantillon est marqué avec une version isotopiquement légère de la sonde et l’autre avec une variante lourde. Par la suite, et pour minimiser toute erreur, les échantillons sont mélangés, digérés par une protéase comme la trypsine et isolés par chromatographie d’affinité (sur bille d’avidine par exemple). Les peptides sont ensuite analysés par LC-MS et la comparaison des intensités de leurs signaux permet de remonter aux niveaux relatifs de protéines entre les deux échantillons, typiquement un échantillon issu d’un sujet sain (contrôle) et d’un malade (différentiel à mesurer).
Ces marqueurs sont les premiers du genre à être commercialisés pour la quantification relative de niveaux d’expression de protéines. Ceux-ci ont un fragment biotine et iodoacétamide couplés de manière covalente pour, d’une part l’étape de purification des protéines et d’autre part pour le marquage des résidus type cystéine. Quant au marquage isotopique, celui-ci est porté par le bras espaceur (dans sa version isotopiquement lourde) notamment composé d’éthylèneglycol (PEG, voir Figure 46 p.89) faisant également office de lien entre le groupement réactif vis-à-vis des cystéines et le fragment biotine ; ce dernier étant crucial pour l’étape de purification grâce à l’affinité entre la biotine et les billes de streptavidine qui compose le système de purification pour isoler la protéine marquée et ainsi diminuer la complexité de l’échantillon tout autant que la quantité de molécules introduites par la suite dans le spectromètre de masse (voir Figure 47 p.90). Le système de marquage ICAT permet ainsi de marquer deux échantillons à comparer qui seront ensuite mélangés entre eux, protéolysés et analysés par mesure relative des intensités des ions.229 La différence de
228 S. P. Gygi, B. Rist, S. A. Gerber, F. Turecek, M. H. Gelb, R. Aebersold, Nat. Biotechnol. 1999, 17, 994–999
229 B. A. Petriz, C. P. Gomes, L. A. O. Rocha, T. M. B. Rezende, O. L. Franco, J. Cell. Physiol. 2012, 227, 885– 898
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masse choisie (+ 9 Th) permet d’éviter les interférences dues à deux résidus cystéines marqués par ICAT (ΔM = 16,100 Th) et l’oxydation des méthionines (ΔM = 15,995 Th).
Figure 47 : Protocole opératoire type pour la méthodologie ICAT
L’inconvénient des premières générations de marqueurs ICAT réside dans la substitution d’atomes d’hydrogène par du deutérium. En effet, cela mène souvent à des différences de temps de rétention en RP-HPLC (pour « Reversed-phase High Pressure Liquid Chromatography ») entre la forme hydrogénée et deutérée du peptide marqué qui peut même aller jusqu’à une séparation au niveau de la ligne de base. Ce constat a été dressé par l’équipe de Zhang et al. en 2001 et 2002 ;230,231
problème rapidement contourné par l’introduction de 13C en remplacement du deutérium dans la version isotopiquement lourde du marqueur ICAT pour éliminer les problèmes de modification de temps de rétention en chromatographie liquide dûs aux interactions entre le deutérium et la phase stationnaire de la colonne.232 Un autre problème recontré avec cette méthodologie provient du fragment biotine qui a tendance à interférer en spectrométrie de masse avec les recherches au sein de bases de données à cause de l’incrément de masse dû à cette molécule et au bras espaceur. Ce
230 R. Zhang, C. S. Sioma, S. Wang, F. E. Regnier, Anal. Chem. 2001, 73, 5142–5149
231 R. Zhang, C. S. Sioma, R. A. Thompson, L. Xiong, F. E. Regnier, Anal. Chem. 2002, 74, 3662–3669
232 E. C. Yi, X.-J. Li, K. Cooke, H. Lee, B. Raught, A. Page, V. Aneliunas, P. Hieter, D. R. Goodlett, R. Aebersold, Proteomics 2005, 5, 380–387
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groupement, compte-tenu de son hydrophobicité, engendre une élution des peptides marquées dans une fenêtre relativement étroite.
Figure 48 : Structure du marqueur cICAT avec lien acidolabile233,234
La solution est simple dans ce cas : retirer le groupement biotine après purification des protéines et avant l’analyse en spectrométrie de masse. C’est précisément ce qui a été proposé par les groupes de Wu et al. et Steen et al. en 2001 et 2002 respectivement grâce à qui l’introduction d’un groupement biotine éliminable par traitement acide a créé les marqueurs cICAT (pour « clivable Isotope Coded Affinity Tag », voir Figure 48 p.91)235,236, évitant ainsi les problématiques d’interférence de la biotine. De nombreuses publications font état d’améliorations apportées par ce type de marquage.237,238,239,240,241 Le groupe d’Aebersold, notamment, a proposé une autre approche dénommée SPICAT pour « Solid Phase Isotope-Coded Affinity Tag » que l’on pourrait même écrire SP2ICAT (pour « Solid Phase Photocleavable Isotope-Coded Affinity Tag ») . Celle-ci est basée sur l’utilisation d’un marqueur éliminable par photolyse (voir Figure 49 p.92) qui résout le problème de la biotine en remplaçant celle-ci par un ancrage sur support solide.242 Cette caractéristique permet, in
fine et après couplage du marqueur sur une cystéine, de libérer les protéines accrochées au support
233 Y. Oda, T. Owa, T. Sato, B. Boucher, S. Daniels, H. Yamanaka, Y. Shinohara, A. Yokoi, J. Kuromitsu, T. Nagasu, Anal. Chem. 2003, 75, 2159–2165
234 A. H. Fauq, R. Kache, M. A. Khan, I. E. Vega, Bioconjug. Chem. 2006, 17, 248–254
235 J. Li, Mol. Cell. Proteomics 2003, 2, 1198–1204
236 J. Wu, Q. Lin, T. K. Lim, T. Liu, C.-L. Hew, J. Virol. 2007, 81, 11681–11689
237 K. C. Hansen, Mol. Cell. Proteomics 2003, DOI 10.1074/mcp.M300021-MCP200
238 E. C. Yi, X.-J. Li, K. Cooke, H. Lee, B. Raught, A. Page, V. Aneliunas, P. Hieter, D. R. Goodlett, R. Aebersold, Proteomics 2005, 5, 380–387
239 W. W. Wu, G. Wang, S. J. Baek, R.-F. Shen, J. Proteome Res. 2006, 5, 651–658
240 J. Qu, W. J. Jusko, R. M. Straubinger, Anal. Chem. 2006, 78, 4543–4552
241 J. Qu, R. M. Straubinger, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2857–2864
92
solide par irradiation. Ce marqueur sur support solide a fait l’objet d’une nouvelle synthèse proposée par Szychowski et al. en 2010.243
Figure 49 : Structure chimique du marqueur SP2ICAT (pour « solide phase photocleavable Isotope-Coded Affinity Tag ») et conditions de photolyse. Ce marqueur a été fixé sur un support solide pour ensuite être couplé aux cystéines. Le marqueur comprend une leucine sous forme isotopiquement légère ou lourde pour la quantification par SID
Cependant, et malgré les nouvelles générations de marqueurs ICAT qui présentent moins de fragmentations parasites du marqueur et donc une meilleure qualité de spectres MS/MS et une meilleure fiabilité, le coût des marqueurs pourrait être un frein à la démocratisation de l’approche ICAT. Il faut ajouter à cela le fait que la chromatographie d’affinité avec accroche par la biotine ne donne pas de relarguage quantitatif des peptides en faible abondance.244 Ceci n’étant pas l’inconvénient le plus handicapant, comme l’est l’impossibilité de marquer et donc de quantifier les protéines qui ne contiennent pas de cystéine.
III.B.2. L’introduction d’hétéroéléments : les approches ECAT et MeCAT
La technique ECAT (pour « Elemental-Coded Affinity Tag ») diffère de l’ICAT en ce sens qu’elle utilise un marquage élémentaire grâce à un lanthanide et non plus à des isotopes comme le 13C ou le
2H qui va cibler les groupements thiol. Elle a été introduite par Zhang et al. lors de l’étude de la TSH (pour « Thyroid-Stimulating Hormone ») avec un marquage à l’europium et une détection par ICP-MS.245 L’avantage de cette technique est la possibilité d’utiliser différents lanthanides dont la détection est spécifique par ICP-MS et donc d’envisager du multiplexage avec des kits de marquage pour plusieurs protéines.246
La technique MeCAT (pour « Metal-Coded Affinity Taf »),247,248 quant à elle, diffère légèrement par sa structure chimique (voir Figure 50 p.93) qui lui donne l’avantage de faciliter la
243 J. Szychowski, A. Mahdavi, J. J. L. Hodas, J. D. Bagert, J. T. Ngo, P. Landgraf, D. C. Dieterich, E. M. Schuman, D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 18351–18360
244 A. Fares, C. Nespoulous, M. Rossignol, J.-B. Peltier, Methods Mol. Biol. Clifton NJ 2014, 1072, 609–620
245 C. Zhang, F. Wu, Y. Zhang, X. Wang, X. Zhang, J. Anal. At. Spectrom. 2001, 16, 1393–1396
246 Z. A. Quinn, V. I. Baranov, S. D. Tanner, J. L. Wrana, J. Anal. At. Spectrom. 2002, 17, 892–896
247 R. Ahrends, S. Pieper, A. Kuhn, H. Weisshoff, M. Hamester, T. Lindemann, C. Scheler, K. Lehmann, K. Taubner, M. W. Linscheid, Mol. Cell. Proteomics 2007, 6, 1907–1916
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purification par chromatographie d’affinité par introduction d’un résidu biotine en vue d’un isolement exploitant l’affinité biotine-streptavidine. Cela permet également de purifier et d’enrichir sélectivement différentes protéines dans des mélanges complexes.249,250,251,252
Figure 50 : Structure des marqueurs MeCAT (à gauche) pouvant accueillir un bras espaceur et un fragment biotine dans le groupe « R » et ECAT (à droite). Ceux-ci se couplent aux peptides protéolytiques sur leur chaîne latérale par leur
groupement maléimide ou α-halogéné. Les substitutions possibles sur le marqueur MeCAT lui permettent des modifications supplémentaires pour faciliter la purification par affinité
III.B.3. Une approche originale sans marquage isotopique : la technique MCAT Cette approche a été introduite par Cagney et Emili en 2002 en tant que stratégie complémentaire des méthodes de quantification par dilution isotopique existantes étant donné que celle-ci ne se sert pas d’isotopes mais d’un codage en masse.253
Figure 51 : Réaction de guanidination d’un résidu lysine. La guanidination permet de convertir de façon sélective les résidus lysine les convertissant en homoarginine
La technique MCAT (pour « Mass-Coded Abundance Tagging ») fournit une méthode utilisable simultanément en séquençage de novo et en séquençage de protéines présentes en faibles quantités dans des mélanges biologiques complexes et pour différents états cellulaires. L’idée étant d’avoir à disposition une stratégie de profilage de protéines pour faciliter la caractérisation d’états physiologiques et pathologiques de cellules ou d’organismes. Le principe est, de manière similaire aux autres stratégies de marquage, de procéder à une dérivation de résidus d’acides aminés au sein
249 G. Schwarz, S. Beck, M. G. Weller, M. W. Linscheid, Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 1203–1209
250 A. H. El-Khatib, D. Esteban-Fernández, M. W. Linscheid, Anal. Chem. 2014, 86, 1943–1948
251 D. Esteban-Fernández, C. Scheler, M. W. Linscheid, Anal. Bioanal. Chem. 2011, 401, 657–666
252 U. Bergmann, R. Ahrends, B. Neumann, C. Scheler, M. W. Linscheid, Anal. Chem. 2012, 84, 5268–5275
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de peptides protéolytiques. Seulement, dans le cas de la technique MCAT, il s’agit d’une guanidination sélective et totale des chaînes latérales des Lysines au sein de peptides trypsiques (voir Figure 51 p.93). Cela entraîne dans les spectres MS une différence de masse de 21 sur l’ion dichargé entre les échantillons marqués et non marqués (voir Figure 52 p.94).
Figure 52 : Différences de masses observées entre le peptide marqué et non marqué : 42 Th sur l’ion monochargé et 21 Th sur l’ion dichargé
MCAT est utilisée pour identifier des protéines ainsi que des variations polymorphiques à partir de mélanges complexes et permet de quantifier la variation dans leur niveau d’expression à partir de différents types de cellules.
Figure 53 : Protocole de comparaison d’échantillons. Celui-ci démarre par la digestion trypsique des deux échantillons suivit de la dérivation de l’un des deux par l’O-méthylurée. Les fractions sont combinées et dessalées avant d’être éluées et analysées par LC-MS
La quantification MCAT est basée sur deux principes. Premièrement, des paires de peptides modifiés et non modifiés sont discriminés sur la base de leur différence de masse. En mode MS (voir Figure 53 ci-dessus), les rapports d’intensité du signal de ces paires d’ions fournissent une mesure directe de l’abondance relative de la protéine correspondante présente dans l’échantillon initial.
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Deuxièmement, l’identité des peptides peut être obtenue par MS/MS au cours de la même expérimentation (voir Figure 54 p.95).
Figure 54 : Les protéines sont dans un premier temps digérées par la trypsine pour générer des peptides avec une lysine ou une arginine en N-terminal. Les peptides protéolytiques présentant une lysine sont par la suite, pour un aliquot, guanidinés avant élution chromatographique. Les deux fractions sont ensuite rassemblées avant d’être éluées et analysées en MS/MS par CID. Cela permet de caractériser la séquence peptidique en repérant les paires d’ions avec un incrément de masse parmi la série d’ions y dans les deux fractions chromatographiques séparées
La méthode a été validée en effectuant le suivi de l’abondance de protéines à partir d’une protéine exogène de levure sans différence significative entre l’échantillon contrôle et l’échantillon test (voir Figure 55 p.95). De plus il est tout à fait possible de coupler cette méthode à des étapes d’enrichissement comme la chromatographie d’affinité tout en la combinant avec des techniques de séparations multidimensionnelles pour améliorer davantage le recouvrement d’un protéome donné.254,255
Figure 55 : Démonstration de la reproductibilité de la technique MCAT. Des extraits de levure digérés par action de la trypsine ont été caractérisés selon le protocole établi en triplica (chaque bâtonnet représentant une mesure)
Cette stratégie de quantification et de caractérisation s’est construite à partir de techniques bien établies et de principes ajustables pour des projets à grande échelle. C’est typiquement le cas pour des projets qui visent à classifier les fonctions de gènes connus et même inconnus en caractérisant les métabolismes et les différentes voies d’expression des protéines. Cela permet
254 A. J. Link, J. Eng, D. M. Schieltz, E. Carmack, G. J. Mize, D. R. Morris, B. M. Garvik, J. R. Yates, Nat.
Biotechnol. 1999, 17, 676–682
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d’identifier des protéines en tant que cibles de médicaments dans le cadre de la recherche pharmaceutique.
III.B.4. Un second souffle pour les marqueurs ICAT : l’approche oxICAT
Cette technique a été publiée par Leichert et al en 2008.256 Elle est une évolution de l’approche ICAT en ce sens qu’en se basant sur la capacité d’un marqueur ICAT à cibler des cystéines, il est possible de mesurer l’état d’oxydation de ces résidus. En effet, l’oxydation réversible des cystéines en pont disulfure ou encore acide sulfènique et nitroso (R-S-NO) est dans de très nombreux cas considéré comme une marque de PTM régulant l’action des différentes protéines dans les processus intracellulaires. Malgré tout, le rôle de ces transformations est encore soumis à débat. Il est donc nécessaire de systématiquement déterminer l’état des cystéines oxydées. C’est le but que poursuit le domaine de la « protéomique redox » (également appelée analyse redox) : établir les conséquences physiologiques des oxydations des cystéines. C’est un domaine particulièrement sujet aux défis techniques dûs au manque d’outils pour détecter les résidus oxydés et qui plus est, de les différencier de leurs formes réduites comme les cystéines par exemple.257,258,259
Figure 56 : Evaluation de l’état d’oxydation de protéines contenant des thiols avec un marqueur ICAT (méthodologie OxICAT)
C’est à ce moment qu’interviennent les marqueurs ICAT et l’analyse par spectrométrie de masse combinée avec des réactions de marquage par la forme isotopiquement légère et lourde des
256 L. I. Leichert, F. Gehrke, H. V. Gudiseva, T. Blackwell, M. Ilbert, A. K. Walker, J. R. Strahler, P. C. Andrews, U. Jakob, Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105, 8197–8202
257 G. Chiappetta, S. Ndiaye, A. Igbaria, C. Kumar, J. Vinh, M. B. Toledano, Methods Enzymol. 2010, 473, 199– 216
258 N. Brandes, D. Reichmann, H. Tienson, L. I. Leichert, U. Jakob, J. Biol. Chem. 2011, 286, 41893–41903
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ICAT. La première étape consiste en la dénaturation des protéines pour avoir accès aux cystéines réduites. De cette manière elles peuvent être marquées par la forme légère des ICAT, ce qui permet par la suite de réduire les ponts disulfures. Les cystéines ainsi libérées sont marquées par la forme lourde des ICAT permettant d’obtenir deux familles de protéines chimiquement identiques et qui ne diffèrent que de 9 Th (voir Figure 56 p.96). Ceci évite toute interférence entre l’oxydation des méthionine et les cystéines (voir Paragraphe III.B.1). Il est aussi possible de réduire la complexité des analyses en procédant à une digestion trypsique des protéines suivie d’une purification par chromatographie d’affinité avant de passer à l’étape d’analyse par MS et MS/MS pour l’identification des peptides. Cette méthode n’est en revanche pas capable d’identifier les plus hauts états