A. Aspect historique de l’ionisation MALDI

L’acronyme MALDI pour « Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation » a été inventé par Franz Hillenkamp, Doris Bachmann et Michael Karas en 1985.396 Dans leur publication originelle, les chercheurs ont montré que des acides aminés tels que l’alanine pouvaient être ionisés beaucoup plus facilement en présence de tryptophane à une longueur d’onde de 266 nm. En effet, l’irradiance du laser (puissance par unité de surface en W.m^-2) nécessaire était alors égale à un dixième de celle requise pour l’ionisation de l’alanine seule. Le tryptophane absorbait l’énergie laser et assistait l’ionisation de l’alanine, incapable d’absorber efficacement l’énergie laser à cette longueur d’onde. Dans le cas du tryptophane, à une irradiance de 10⁷ W.cm^-² et une impulsion laser de 10 ns, l’énergie absorbée est de 21,5 eV environ, équivalant à 4 à 5 photons d’une longueur d’onde de 266 nm. Cette valeur se calcule à partir de l’équation de la loi de Beer-Lambert adaptée à l’absorption d’énergie par des chromophores de la partie supérieure d’une couche moléculaire (voir Equation 2 ci-dessous).

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Equation 2 : Equation de la loi de Beer-Lambert adaptée à l’absorption totale d’énergie par un chromophore de la couche supérieure d’un dépôt moléculaire où ε_n est le coefficient d’extinction molaire, E l’irradiance du laser considérée, τ la durée de l’impulsion laser et NA le nombre d’Avogadro

Deux ans plus tard grâce à cette technique d’ionisation assistée par matrice, des peptides allant jusqu’à une masse de 2 843 Da comme la mélittine ont été ionisées en mélange avec du tryptophane.397 L’avancée majeure a été apportée par l’équipe du Dr. Koichi Tanaka de chez Shimadzu© pour le développement de leur méthode « ultra-fine metal plus liquid matrix », connue plus tard sous l’acronyme SALDI (pour « Surface Assisted Laser Desorption Ionisation »).398 Les chercheurs ont combiné une matrice composée de particules de Cobalt de 30 nm avec du glycérol et une ionisation par un laser à azote à une longueur d’onde de 337 nm. Cela leur a permis d’ioniser de

396

M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp, Analytical Chemistry 1985, 57, 2935–2939

397 M. Karas, D. Bachmann, U. Bahr, F. Hillenkamp, International Journal of Mass Spectrometry and Ion

Processes 1987, 78, 53–68 398

K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida, T. Matsuo, Rapid Communications in Mass

138

larges biomolécules comme la protéine carboxypeptidase-A d’une masse de 34,5 KDa, une enzyme d’origine pancréatique et intestinale (duodénum) qui permet d’hydrolyser les polypeptides acide aminé par acide aminé. Ces travaux lui ont valu la co-attribution du prix Nobel de chimie en 2002 avec John B. Fenn pour « leur développement des méthodes de désorption par ionisation douce pour

des analyses de macromolécules biologiques par spectrométrie de masse ». Il faut toutefois replacer

ces découvertes dans leur contexte historique. En effet, avant d’être capable d’accélérer des photons pour ioniser des molécules, les premières techniques d’ionisation ont été développées autour de l’accélération d’ions primaires (gaz nobles, oxygène ionisé, molécules ionisées) pour former des ions secondaires (les analytes) qui sont par la suite analysés, c’est le principe du SIMS (pour « Secondary Ion Mass Spectrometry »). Par la suite la technique FAB (pour « Fast Atom Bombardment ») a consisté en la production d’un faisceau d’atomes neutres accélérés bombardant un échantillon solide ou liquide (d’où l’appellation LSIMS pour « Liquid SIMS »). Enfin les dernières particules à avoir été utilisées pour l’ionisation de molécules ont été les photons issus de laser au travers de l’immense diversité des techniques développées dont la liste exhaustive ne pourrait être développée dans ce manuscrit (voir Figure 77 ci-dessous).

Figure 77 : Chronologie non exhaustive de l’évolution historique des techniques d’ionisation

Le Pr. Karas et le Pr. Hillenkamp ont, après les découvertes du Dr. Tanaka, été capables d’ioniser de plus larges biomolécules comme la protéine d’albumine bovine de 67 KDa grâce à une matrice constituée d’acide nicotinique et un laser à 266 nm.399 D’autres évolutions ont été décrites avec l’utilisation d’un laser à 355 nm et des dérivés de l’acide cinnamique (acide férulique et acide caféique) et avec l’acide sinapinique (voir Figure 78 ci-dessous).400 La démocratisation de la technique MALDI a été rendue possible grâce à la disponibilité commerciale de petits lasers à azote opérant à

399 M. Karas, F. Hillenkamp, Analytical Chemistry 1988, 60, 2299–2301

400

R. C. Beavis, B. T. Chait, K. G. Standing, Rapid Communications in Mass Spectrometry 1989, 3, 436–439

SIMS FAB LDI MALDI 1958 (Honig, R.E) 1967 (Liebl,H.J) 1981 (Barber M) 1985 (Karas M)

139

337 nm et à l’apparition d’instruments commerciaux au début des années 1990.401 Puis ces lasers ont été remplacés par des lasers de type Nd:YAG (pour « Neodynium-dopped Yttrium Aluminium Garnet ») fonctionnant à 355 nm avec, à l’heure actuelle, des matrices organiques utilisées la plupart du temps. Un certain nombre d’études et de travaux, dont certains au sein de l’IBMM, se sont en revanche servis de matrices inorganiques pour se passer des interférences dues aux ions de matrice aux basses masses dans le cas d’analyse de petites molécules.402

Figure 78 : Premières matrices utilisées lors du développement de la technique MALDI avec leur apparition chronologique

Depuis la technique MALDI a trouvé de nombreuses applications dans des domaines allant de la médecine à la chimie organique en passant par la biochimie. En chimie des polymères par exemple, le MALDI peut être utilisé pour déterminer la dispersité des chaînes polymériques.403 De plus, pour des molécules de tailles importantes comme les rotaxanes, les dendrimères ou encore les polymères hyperbranchés, le MALDI reste une technique d’analyse incontournable grâce à sa capacité à fournir une ionisation douce pour des composés excédant les 1 000 à 10 000 Da. La microbiologie, elle, a subi une révolution avec l’arrivée de la technique MALDI pour l’identification de micro-organismes comme des bactéries et même des champignons.⁴⁰⁴ En effet, par un simple dépôt d’une colonie de bactérie recouverte par une couche de matrice, il est possible d’obtenir des spectres qui, une fois comparés avec des profils stockés dans des bases de données, permettent d’identifier le micro-organisme. Une des raisons de l’engouement pour le MALDI vient du fait qu’il

401 M. Karas, U. Bahr, TrAC Trends in Analytical Chemistry 1990, 9, 321–325

402 Mathieu Dupré, « Développements méthodologiques en spectrométrie de masse LDI pour l'analyse de peptides », Thèse de doctorat en Ingénierie moléculaire, sous la direction de Christine Enjalbal, Montpellier, Université Montpellier 2, 2012.

403 S. F. Macha, P. A. Limbach, Current Opinion in Solid State and Materials Science 2002, 6, 213–220

404

P. Seng, M. Drancourt, F. Gouriet, B. La Scola, P. Fournier, J. M. Rolain, D. Raoult, Clinical Infectious

140

permet des diagnostics plus rapides, précis et bons marchés par rapport à des analyses immunologiques ou biochimiques grâce à des analyses robustes, fiables et facilement répétables en routine.

I.B. La source MALDI et l’expression fondamentale des énergies en jeu I.B.1. La source MALDI et l’AP-MALDI

La source MALDI, généralement sous vide à une pression de 10-5 bar ou moins (10-6 bar en source sur le MALDI Ultraflex III, Brucker©), est composée d’un système permettant l’accueil de la plaque de dépôt et d’un laser incident focalisé sur un point cible de la plaque mobile par un système ingénieux de lentilles et de miroirs particulier à chaque constructeur (voir Figure 79 ci-dessous).

Figure 79 : Schéma d’une source MALDI avec le laser incident focalisé par des lentilles et envoyé sur la cible par un miroir. Le support des dépôts est à un potentiel V et la sortie de la source est reliée à la terre

Le laser émis est par la suite absorbé par la matrice présente dans l’échantillon déposé dont le rôle est de transférer l’énergie laser à l’échantillon. L’absorption de l’énergie incidente est soumise à la loi de Beer-Lambert et fait décroître la fluence du laser « H » (voir Equation 3 ci-dessous) exprimée en J.m-2 à une profondeur « z » dans l’échantillon, « H₀ » étant sa valeur à la surface de l’échantillon. Cette loi fait intervenir le coefficient d’absorption molaire « αn » et la concentration « Cn » des molécules absorbantes de l’échantillon. La dépendance de ce coefficient d’absorption en fonction de la longueur d’onde du laser est une propriété des matrices MALDI avec une valeur maximale comprise entre 5.103 et 5.104 L.mol-1.cm-1 à la longueur d’onde du pic d’absorption de la matrice considérée.405

405

F. Hillenkamp, J. Peter-Katalinić, Eds. , MALDI MS: A Practical Guide to Instrumentation, Methods and

Applications, Wiley - VCH, Weinheim, 2009

Laser

D (zone de transfert sans champ) Source

S

141

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Equation 3 : Expression de la fluence laser « H » en fonction de la profondeur « z » et de l’énergie absorbée par unité de volume « E_a »

En MALDI, c’est la densité d’énergie absorbée (énergie absorbée Ea par unité de volume) qui est la clé du processus d’ionisation et qui est égale à l’opposé de la dérivé de la fluence laser (voir Partie E – Annexes, paragraphe II.A.1 p.478). Ainsi, une matrice avec un coefficient d’absorption suffisant pourra absorber l’énergie laser même avec une fluence relativement faible. A titre d’exemple, un laser à N2 (337 nm) émet des photons de 3,7 eV chacun. Une fluence laser de 100 J.m-2

correspond à 6,25.10²⁰ eV.m^-2 et donc à 1,7.10¹⁶ photons par centimètre carré, ce qui est une quantité d’énergie par unité de surface très élevée capable d’arracher la matière de la surface de sa zone de dépôt. La plupart des appareils sont équipés avec des lasers UV à azote ou Nd:YAG à fréquence triplée (355 nm) ou quadruplée (266 nm). En revanche les lasers infrarouges (IR), bien que plus rares, ont d’intéressantes applications en biologie grâce à l’avantage de leur mode d’ionisation plus doux dû à des photons de plus faible énergie (voir Figure 80 ci-dessous).

Figure 80 : Présentation des différents lasers existant. Les plus couramment utilisés en MALDI sont les lasers UV de type Nd:YAG et à azote⁴⁰⁶

Il existe une variation du MALDI sous vide, le MALDI à pression atmosphérique ou AP-MALDI.407,408 Cette principale différence de pression dans laquelle les ions sont créés ont, par le

406

F. Hillenkamp, J. Peter-Katalinić, Eds. , MALDI MS: A Practical Guide to Instrumentation, Methods and

Applications, Wiley - VCH, Weinheim, 2009

407 V. V. Laiko, L. B. Alma, Atmospheric Pressure Matrix Assisted Laser Desorption, 1999, US 5965884 A

408

V. V. Laiko, M. A. Baldwin, A. L. Burlingame, Analytical Chemistry 2000, 72, 652–657

Photon energy (hν) Longueur d’onde (λ) 10 µm 3 µm 1 µm 800 nm 400 nm 300 nm 200 nm 193 nm 0,01 eV 0,4 eV 1,5 eV 3 eV 4 eV 6,1 eV 6,3 eV 1,2 eV

Ultraviolet Visible Infrarouge

Lasers à dimères excités ArF 193 nm KrF 248 nm 4×f 266 nm XeCl 308 nm N₂ 337 nm 3×f 353 nm 1×f 1,06 µm Er:YAG 2,94 µm CO₂ 9,1-10,6 µm Nd:YAG Lasers moléculaires Lasers composites

142

passé, limité l’utilisation de l’AP-MALDI à cause d’une sensibilité plus faible. Malgré cela, le transfert efficace des ions de la source à l’analyseur permet une détection de quantités très faibles jusqu’à la femtomole.409 Cette technique est avantageusement utilisée en recherche médicinale sur des sujets variés comme l’analyse de bactéries, d’ADN, d’ARN, de lipides, d’oligosaccharides, de phosphopeptides, de petites molécules ou encore de polymères. L’avantage par rapport au MALDI sur ce type de sujet est avant tout la facilité avec laquelle la source AP-MALDI peut être couplée sur des instruments équipés avec des sources à pression atmosphérique comme l’ESI ou la source nanoESI.⁴¹⁰

I.B.2. Le processus de désorption/ablation de la matière

Le processus de désorption est au cœur de l’analyse MALDI puisqu’il permet le passage des molécules de matrice et d’analyte adsorbées sur une surface, la plaque MALDI, en phase gazeuse.411

Cependant le terme « ablation » convient mieux pour décrire le phénomène étant donné qu’il s’agit plutôt, à chaque exposition d’une impulsion laser, d’arracher un certain volume de molécules (i.e : plusieurs couches de molécules) du dépôt. Ce processus est concomitant avec l’ionisation des composés présents dans le dépôt et se déroule sur une échelle très faible de l’ordre du micromètre et de la nanoseconde (voir Figure 81 et Figure 82 ci-dessous).412

Figure 81 : Clichés à haute vitesse de nuages de particules générés en IR-MALDI, d’une part avec un laser OPO (pour « Optical Parametric Oscillator ») et une impulsion de 6 ns (à gauche), d’autre part avec un laser Er:YAG (pour « Erbium-doped Yttrium Aluminium Garnet » Er:Y3Al5O12) et une impulsion de 100 ns. Les deux lasers opèrent à 2,94 µm avec du glycérol en tant que matrice, une résolution temporelle de 8 ns et une résolution spatiale de 4 µm. Les trois premiers clichés montrent un gradient de composés qui modifient l’indice de réfraction du nuage de particules. Le quatrième cliché représente l’émission des particules dans le nuage par diffraction de la lumière à 90 °

409

K. Strupat, S. Scheibner, T. Arrey, M. Bromirski, “Biological Applications of AP MALDI with Thermo Scientific Exactive Orbitrap MS,” can be found under http://www.apmaldi.com/images/stories/005-111101-an30224-maldi-generalapp_6s_v4a_kp.pdf, 2011

410

V. V. Laiko, S. C. Moyer, R. J. Cotter, Analytical Chemistry 2000, 72, 5239–5243

411 K. Dreisewerd, Chemical Reviews 2003, 103, 395–426

412

F. Hillenkamp, J. Peter-Katalinić, Eds. , MALDI MS: A Practical Guide to Instrumentation, Methods and

Applications, Wiley - VCH, Weinheim, 2009

100 µm 1/ OPO 3 ns 1/ Er:YAG 40 ns 100 µm 25 ns 93 ns 160 ns 115 ns ^{1/ Er:YAG} 1/ OPO

143

Ces deux clichés montrent qu’au bout d’une centaine de nanosecondes, les composés sont ablatés quel que soit le type de laser utilisé.

Figure 82 : Clichés à haute vitesse de nuages de particules générés en UV-MALDI avec un laser Nd:YAG (pour

« Neodynium-doped Yttrium Aluminium Garnet » Nd:Y₃Al₅O₁₂) à 266 nm et à fréquence quadruplée avec une impulsion laser de 8 ns, une résolution temporelle de 8 ns et du nitrobenzylalcool comme matrice. Le cliché de gauche correspond à un délai de 45 ns après le tir laser tandis que le cliché de droite correspond à l’image du nuage de particule 311 ns après l’exposition au laser par diffraction de la lumière à 90°⁴¹³

Pour saisir les tenants et aboutissant de la phase d’ionisation, l’environnement doit être pris en considération car il évolue très rapidement, ainsi que sa densité qui varie et sa fenêtre temporelle d’action. En effet, bien que la durée d’une impulsion laser soit de l’ordre de la dizaine de nanoseconde (6 à 8 ns), l’expansion du nuage de particules généré se déroule sur une durée de plusieurs microsecondes (voir Figure 83 ci-dessous). Deux régimes fondamentaux d’ionisation sont possibles en fonction de la fluence du laser mise en jeu : l’ablation ou la désorption. Le régime dit d’ablation de la matière correspond à une forte fluence laser illustré dans la Figure 83 (voir ci-dessous) et la Figure 84 p.145. La limite est très ténue et il est plus intéressant de se placer dans des conditions qui permettent de s’assurer de l’un ou l’autre des régimes plutôt que de rester dans une zone incertaine dont les résultats pourraient dépendre très fortement d’autres facteurs (préparations des échantillons, dépôt, homogénéité …).

413

A. Rohlfing, Untersuchungen Zum Deso Rptionsprozess in Der UV-Matrix-Unterstützten La Serdesorption/-Ionisation Mit Einer Flüssigmatrix, Dissertation, 2006

144

Figure 83 : Représentation de la densité de charges durant l’ionisation MALDI où la courbe bleue représente une impulsion laser, la courbe verte représente la population de molécules en état excité et la courbe rouge représente la densité relative du nuage de particules en expansion en fonction du temps. La ligne pointillée représente son évolution lors d’une phase « d’explosion » (l’ablation de matière) tandis que la ligne continue représente une phase d’évaporation douce (la désorption)

A chaque impulsion laser, une certaine quantité d’énergie est transférée au solide. Il ne faut toutefois pas omettre les différents processus de dissipation d’énergie qui interviennent dans la nature de l’extraction de matière (régime de désorption ou d’ablation) :

· La dissipation par conduction thermique, qui consiste en un transfert thermique de la radiation incidente à travers les différentes couches de matière traversées.

· La vague de pression thermoélastique qui est générée par le laser incident et qui se déplace à la vitesse du son. Dans un solide, celle-ci est comprise entre 1 000 et 5 000 m.s-1 et avec une profondeur de pénétration de l’ordre de la centaine de nanomètre (pour un laser UV) cela donne une constante de temps inférieure à la centaine de picosecondes, bien plus court que l’impulsion laser qui est de l’ordre de quelques nanosecondes, qui donne lieu à une « explosion » de matière par rebond (ou vague d’expansion) : l’ablation de particules de la zone de dépôt (voir Figure 84 ci-dessous et Figure 85 p.146). Même observation dans le cas d’un laser IR avec une pénétration de l’ordre du micromètre et une impulsion laser de l’ordre de la nanoseconde. Cela créerait une onde accoustique de l’ordre de la femtoseconde au maximum, qui va

s Temps, s Den si té r el ati ve Ionisation primaire Ionisation secondaire

145

être capable par des rebonds dans la phase solide de participer activement au processus d’ablation.414

Figure 84 : Illustration des phases de désorption et d’explosion en MALDI avec la représentation de la hauteur par rapport au temps calculée par dynamique moléculaire pour deux énergies d’impulsion laser et une coloration en fonction de la pression. A gauche, une faible énergie mène à une expansion et une évaporation douce à partir de la surface du dépôt ; tandis qu’une forte énergie d’impulsion laser entraîne une phase explosive et l’éjection de « clusters » dans les couches supérieures. De plus la vague de pression après rebond sur la plaque de dépôt, est suffisamment puissante pour casser le dépôt froid jusqu’à une profondeur importante, ce qui entraîne l’éclatement en fines couches

C’est cet ensemble de particules éjectées (matrice et analyte en phase gaz, blocs de matière condensés …) qui compose le nuage particulaire en expansion (« plume » en Anglais) dans lequel se déroulent les processus fondamentaux qui mènent à la vaporisation des blocs de matière et l’ionisation finale des molécules de matrice et d’analyte observés. La très courte période suivant l’impulsion laser est caractérisée par une forte densité et une forte énergie (transmise par le laser) qui permet aux processus à haute énergie de se dérouler, c’est l’ionisation primaire. S’en suit la réaction de ces ions primaires avec des molécules neutres du nuage particulaire, c’est l’ionisation secondaire. Ces deux processus sont discutés plus en détails au paragraphe II p.158. Une fois les composés présents dans les dépôts ablatés, ceux-ci sont transférés dans l’analyseur.

414

F. Hillenkamp, J. Peter-Katalinić, Eds. , MALDI MS: A Practical Guide to Instrumentation, Methods and

Applications, Wiley - VCH, Weinheim, 2009

Pos iti on z, n m Temps, ps Temps, ps P (MPa) Rebond de l’onde de pression

146

Figure 85 : Représentation de la phase d’explosion en MALDI par des clichés latéraux de simulation en dynamique moléculaire en fonction du temps (Cliché 1, 2 puis 3). Le laser incident provient de la droite. Durant le réchauffement du dépôt et son expansion sous l’effet de la vague de compression engendrée par le laser, les molécules commencent par se désorber doucement (cliché 1). Puis la nucléation profonde sous haute pression dans les couches inférieures du dépôt débute (cliché 2). Enfin, le cliché 3 montre l’effet de la vague d’expansion (après rebond) et la formation de bulles de vapeur denses sous la surface qui marque le début de la phase d’ablation⁴¹⁵

I.C. Les matrices au cœur de l’analyse MALDI : propriétés et préparation

En MALDI la préparation de la surface est un autre point clé de la réussite de l’analyse car elle a une forte influence sur la sensibilité de la détection notamment en fonction de l’homogénéité du dépôt. Nous allons à présent discuter des classes de matrice, de leurs propriétés et des techniques de dépôt développées.