Approches actuelles employées pour le criblage des RCPG

III.A. La radioactivité pour la mesure de la liaison d’un ligand à son récepteur L’utilisation de radioligands pour la mesure d’interactions protéine-ligand est encore largement répandue pour caractériser un récepteur.96,97 Le choix du radioligand doit se faire avec attention étant donné que c’est son signal qui est mesuré et que le radiomarquage peut influencer la

96 L. A. A. de Jong, D. R. A. Uges, J. P. Franke, R. Bischoff, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life

Sci. 2005, 829, 1–25

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liaison d’un ligand à son récepteur (e.g : HO-LVA vs [125I]HO-LVA envers le récepteur V1A).98,99 Les avantages principaux que possède cette approche par radiomarquage sont la sensibilité accrue de la mesure ainsi que les modifications minimales opérées lors de l’ajout d’un atome radioactif minimisant les effets de l’ajout d’iode sur l’interaction ligand-récepteur. Deux radioisotopes sont majoritairement utilisés : 3H et 125I.

Le tritium fait partie, avec l’iode 125 et le carbone 14 (voir Tableau 6 p.48), des principaux radionucléides utilisés pour la mesure d’interaction protéine-ligand par radioactivité. Celui-ci émet un rayonnement de type β- en se désintégrant en 3He. Le marquage s’effectue soit par échange hydrogène/tritium, soit par réaction chimique classique comme l’hydrogénation catalytique à base de tritium, la dés-halogénation avec du ³H2 catalysée par un métal, la réduction via des hydrures, une réaction de méthylation ou encore l’acétylation d’amines grâce à de l’anhydride acétique préalablement tritié. Le principal inconvénient du tritium incorporé dans ces radioligands provient de sa longue demi-vie qui, bien que permettant un stockage sur une longue période, présente une faible activité radioactive (30 – 100 Ci/mmol) et une émission faible d’énergie. Cela peut, d’une part endommager le ligand à moins de stocker le composé au froid avec un produit pour contrer les effets du rayonnement β- comme l’éthanol, d’autre part poser problème au niveau de l’efficacité de la détection. Le principal inconvénient de l’iode 125, au contraire, est bien sa demi-vie relativement courte de 59,4 jours qui force son utilisation rapidement après sa production.

L’iode 125 est l’isotope radioactif de l’iode couramment utilisé en pharmacologie pour ces études de liaison. C’est un radionucléide artificiel produit par les réacteurs nucléaires considéré comme un émetteur X (rayonnement à 27 KeV) et un émetteur γ (rayonnement à 35 KeV). Ses émissions peuvent être stoppées par des écrans d’acier ou de plomb. Son introduction dans les biomolécules est aisée en particulier sur les chaînes latérales des acides aminés comme la tyrosine (où il est introduit en position ortho) et l’histidine. Sa forte activité (2 000 Ci/mmol) permet d’améliorer la sensibilité de l’expérimentation et même la diminution des quantités de récepteurs et de ligands utilisés. Ce qui est très intéressant compte-tenu du fait que les ligands radiomarqués sont très souvent affins pour leur récepteur (K_d de l’ordre du nanomolaire voir subnanomolaire) et que les concentrations utilisées lors de l’expérimentation peuvent très vite saturer le récepteur. Ceci est une chose à éviter car il faut pouvoir mesurer une augmentation progressive de la quantité de ligand qui se lie au récepteur pour déterminer la constante de dissociation de façon fiable. Un autre enjeu important pour les radioligands est la possibilité de recourir à un agoniste, antagoniste ou agoniste

98 B. Chini, B. Mouillac, Y. Ala, M. N. Balestre, S. Trumpp-Kallmeyer, J. Hoflack, J. Elands, M. Hibert, M. Manning, S. Jard, EMBO J. 1995, 14, 2176–2182

99 M. Thibonnier, J. A. Preston, N. Dulin, P. L. Wilkins, L. N. Berti-Mattera, R. Mattera, Endocrinology 1997,

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inverse sachant qu’il est toujours préférable de choisir une molécule du même type que le compétiteur mis en jeu dans l’expérimentation.

Isotope Demi-vie Type de rayonnement

Energie émise

Moyens de détection

125I 59,4 jours X, γ 35,5 KeV Sonde à rayons X, sonde γ

35S 87,5 jours β- 48,8 KeV Sonde β (scintillation liquide)

33

P 25,34

jours

β- 250 KeV Sonde β (scintillation liquide)

32P 14,26 jours

β- 1 710 KeV Sonde β (scintillation liquide)

14C 5 730 ans β- 156 KeV Sonde β (scintillation liquide)

3H 12,32 ans β- 5,7 KeV Sonde β (scintillation liquide)

Tableau 6 : Radioisotopes utilisés en phamacologie présentant les demi-vies, le type de rayonnement émis, l’énergie émise et les moyens de détection

D’autres radioisotopes sont également disponibles pour le radiomarquage mais plus rarement utilisés. Le premier d’entre eux, le carbone 14, est un autre élément radioactif dont l’utilisation en radioactivité est limitée par la difficulté de son incorporation dans des biomolécules et sa faible activité qui empêche les mesures sur un court laps de temps, celui d’une expérience de liaison typiquement. Le phosphore 32 quant à lui est surtout utilisé en laboratoire pour marquer des brins d’ADN ou d’ARN ou encore dans les expériences Southern et Western blot, deux techniques de séparation par électrophorèse. Le second isotope radioactif du phosphore (³³P) est utilisé pour les mêmes applications à ceci près qu’étant moins énergétique, il fournit une meilleur résolution mais reste plus cher. Enfin, le soufre radioactif (35S) est relativement peu utilisé mais peut servir à marquer des protéines contenant des cystéines et des méthionines comme cela a été le cas, par exemple, lorsqu’Alfred Hershey et Martha Chase ont, en 1952, confirmé que l’ADN était le support de l’hérédité.

III.B. La fluorescence : historique, photochimie et application à l’étude des RCPG La fluorescence, une forme de luminescence, est caractérisée par l’émission de lumière par un composé qui va absorber de la lumière ou toute autre radiation électromagnétique. La plupart du temps, la lumière émise possède une longueur d’onde plus grande, et donc une énergie plus faible que la radiation absorbée. Ce phénomène est appelé « déplacement de Stokes ». Le point le plus intéressant est l’absorption de radiations dans l’ultraviolet avec une émission de radiation se retrouvant dans le domaine visible (400 – 800 nm) pour l’œil humain. De ce fait, les composés fluorescents se retrouvent visibles uniquement lorsqu’ils sont exposés à de la lumière ultraviolette. A l’inverse de la phosphorescence, pour laquelle les composés continuent de briller après que la source de radiation soit éteinte pour un temps, les substances fluorescentes cessent d’émettre dès l’extinction de la source de radiations. Cependant, lorsque la radiation électromagnétique est

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intense, un électron peut alors absorber deux photons. Ce phénomène d’absorption à deux photons induit alors l’émission d’une radiation de longueur d’onde plus faible et de plus grande énergie que la radiation absorbée.