2-a/Liaison de gp120-CD4 avec CCR5 2-b/Pénétration membranaire de gp41
III. B.2. Aspect photochimique de la fluorescence
La fluorescence apparaît lorsqu’un électron orbitalaire d’une molécule, d’un atome ou d’une structure nanométrique va subir une relaxation à partir d’un état singulet excité pour retourner à son état initial tout en émettant un photon (voir Figure 26 ci-dessous).
100 S. William Edwin, ANNUAL REPORT OF THE BOARD OF REGENTS OF THE SMITHSONIAN
INSTITUTION 1916, 271–298
101 M. Muyskens, Ed Vitz, Journal of Chemical Education 2006, 83, 765
102 A. U. Acuña, F. Amat-Guerri, P. Morcillo, M. Liras, B. Rodríguez, Org. Lett. 2009, 11, 3020–3023
103 B. Valeur, M. N. Berberan-Santos, Journal of Chemical Education 2011, 88, 731–738
104 E. D. Clarke, The Annals of Philosophy 1819, 14, 34–36
105 R. J. Haüy, Traité de minéralogie 1822, 1, 505–527
106 J. F. W. Herschel, Philosophical Transactions of the Royal Society of London 1845, 135, 143–145
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Figure 26 : Excitation et relaxation d’un électron lors du processus de fluorescence par opposition au phénomène de phosphorescence
ܧݔܿ݅ݐܽݐ݅݊ ܵ ݄ߥ௫՜ ܵଵ
ܨ݈ݑݎ݁ݏܿ݁݊ܿ݁ ܵଵ՜ ܵଵ ݄ߥ ο
݄ܲݏ݄ݎ݁ݏܿ݁݊ܿ݁ ܵଵ՜ ܶଵ՜ ܵଵ ݄ߥԢ ο, où « ݄ߥ » est le terme générique désignant l’énergie d’un photon, h étant la constante de Planck, ∆ la chaleur émise et ν, la fréquence lumineuse.
S0 constitue l’état initial, ou état au repos, du fluorochrome et S1 son premier état singulet excité immédiatement supérieur en énergie à S0. Plusieurs voies de relaxations sont alors possibles pour une substance dans l’état S1 :
· Relaxation non radiative : cas pour lequel l’énergie d’excitation est dissipée sous forme de chaleur (vibrations).
· Phosphorescence : cas pour lequel les substances excitées se relaxent en passant par un état triplet qui par la suite vont subir une relaxation pour donner la phosphorescence.
· Fluorescence : cas pour lequel les substances excitées se relaxent vers l’état S0 en émettant une radiation.
La fluorescence trouve de nombreuses applications en sciences de la terre (minéralogie, gemmologie) et en sciences du vivant, notamment en biochimie, pharmacologie et médecine (voir Figure 27 p.51).
Ener
gi
e
S
0S
11
2
3
0
Transitions non radiatives Fluorescence Absorption Etat au reposhν
Transition non radiative vers un état triplet
T
151
Figure 27 : Visualisation de cellules endothéliales par fluorescence à trois canaux marquant spécifiquement des constituants cellulaires (bleu : noyaux ; rouge : actine ; vert : micro tubules)108
III.B.3. Application de la fluorescence et du FRET à l’étude de RCPG
En sciences du vivant la fluorescence est en général utilisée comme une manière non destructrice de suivre et d’analyser des composés biologiques grâce à ces émissions de lumière à des fréquences spécifiques pour lesquelles aucun bruit de fond provenant de la radiation incidente n’est observé. En effet, très peu de composés cellulaires sont naturellement fluorescents ; on parle alors de fluorescence intrinsèque, ou autofluorescence. On s’intéressera uniquement au marquage fluorescent par des groupements externes aux substances marquées possédant cette propriété de fluorescence, appelés fluorochromes. Ceux-ci peuvent être des petites molécules ou même des protéines. Ces molécules peuvent être fixées sur des protéines, comme les RCPG, grâce à des groupes fonctionnels tels que :
· Les groupements amino via des succinimides, isothiocyanates ou encore hydrazines. · Les groupements carboxyles par l’intermédiaire des carbodiimides.
· Les groupements thiol à travers des maléimides ou encore des bromures d’acétyle. Les fluorochromes organiques ont cette capacité de fluorescer grâce à leurs électrons délocalisés qui permettent de stabiliser l’énergie absorbée, c’est la raison pour laquelle beaucoup de fluorochromes sont des systèmes conjugués. Plusieurs familles existent avec des gammes d’excitation allant de l’infrarouge à l’ultraviolet. Les lanthanides chélatés, à titre d’illustration, sont des métaux fluorescents uniques qui émettent grâce à des transitions énergétiques mettant en jeu leur orbitales 4f mais présentant de faibles coefficients d’absorption et une émission lente. Ceci nécessite une excitation via des groupements chélatant organiques comme le dipicolinate de terbium (III).109 Il existe également une troisième classe de molécules fluorochromes composée de complexes de métaux de transition. Ceux-ci ont la capacité de fluorescer grâce à un processus de
108 Cellules endothéliales vues au microscope, 2010, repéré à
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/09/FluorescentCells.jpg
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transfert de charge entre le métal et le ligand. La plupart du temps ces fluorochromes sont constitués de ruthénium, de rhénium ou d’osmium.110
Un type particulier de fluorescence très utilisée est le FRET pour « Förster Resonance Energy Transfert » ou « Fluorescence Resonance Energy Transfert » (voir Figure 28 ci-dessous) qui est un phénomène au sein duquel l’énergie d’un électron excité d’un fluorochrome (donneur à longue fluorescence à 620 nm), est transférée à un accepteur voisin (fluorescence courte). Ce peut-être un corps noir qui va totalement absorber l’énergie sans réémission ou un autre fluorochrome qui possèdera un spectre d’excitation qui chevauchera le spectre d’émission avec pour conséquence une intensité de fluorescence moindre à une longueur d’onde de 665 nm. Ce type de fluorescence peut être très utile pour :
· Détecter un contact entre deux protéines (dans le cadre d’une interaction protéine-récepteur par exemple) ou acides nucléiques marqués, ou une molécule doublement marquée puis hydrolysée.
· Détecter des changements de conformation.
· Mesurer des concentrations au cours d’expériences de liaison compétitive sur des RCPG à titre d’exemple.
Figure 28 : Mécanisme de transmission d’énergie par FRET pour « Förster Resonance Energy Transfert ». L’énergie incidente à 337 nm est absorbée par le fluorophor donneur (la fluorescéine) puis est transmise au fluorochrome receveur (la tétraméthylrhodamine) pour être réémise à 620 nm
Cependant, avant que la fluorescence n’apparaisse et ne se démocratise au cours des 30 dernières années, l’utilisation de la radioactivité en tant que marqueur était largement acceptée. La technique a peu à peu gagné du terrain notamment grâce aux avantages qu’elle présente (voir Tableau 7 ci-dessous) et ce malgré ses inconvénients.
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Tableau 7 : Avantages et inconvénients de la fluorescence appliquée aux sciences du vivant