F. La mise en jeu de peptides protéotypiques : la technique AQUA

L’approche AQUA (pour « Absolute Quantification ») consiste en l’introduction d’un peptide protéotypique marqué avec des peptides étalons après l’étape de digestion enzymatique de la protéine et avant analyse LC-MS/MS. La technique AQUA a été développée par Gygi et al. en 2003 (voir Figure 71 p.110),284 acronyme désormais répandu pour décrire la technique de quantification absolue à base de peptides marqués auprès de la communauté de protéomique. L’équipe a utilisée dans son étude un phospholipide marqué par un isotope en tant qu’étalon dans le but de quantifier la protéine endogène phosphorylée. Cette avancée a permis par la suite d’accéder à de nombreux biomarqueurs de protéines en lien étroit avec l’activité des kinases.285 Le grand intérêt de cette technique réside également dans le couplage avec la séparation par gel SDS-PAGE qui propose ainsi un moyen très séduisant, bien établi et largement applicable à tout type d’échantillon protéique afin d’en diminuer la complexité, faisant de cette technique une méthode de choix pour la validation de biomarqueurs de protéines.²⁸⁶

Malgré ces points à prendre en compte, de récentes études ont tout de même pu démontrer la robustesse de la SID-MS avec utilisation d’étalons peptidiques pour la quantification de

284 S. A. Gerber, J. Rush, O. Stemman, M. W. Kirschner, S. P. Gygi, Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 100, 6940– 6945

285 K. E. Krueger, S. Srivastava, Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 1799–1810

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protéines.287,288 Typiquement, Arsene et al. ont eu recours à des protocoles modifiés et optimisés de digestion enzymatique qui se sont révélés très efficaces pour améliorer non seulement le taux de digestion mais également réduire le temps de cette étape. Cela a permis d’atteindre in fine une incertitude de 4%. L’étude d’Addona et al. vient également pointer du doigt les sources de variation communément rencontrées comme la possibilité de retrouver des interférences dans le suivi des transitions en LC-MS/MS, problématique qui peut être aisément contournée en ayant recours à des suivis de plusieurs transitions pour, d’une part augmenter la spécificité de la détection, et d’autre part diminuer l’impact d’une interférence pour une transition parmi l’ensemble suivi. Malgré tout, l’étude démontre la robustesse de la technique AQUA qui peut se transposer d’un laboratoire à un autre avec un déploiement méthodologique rapide pour arriver à des mesures robustes et reproductibles. Ceci étant un point crucial pour le développement à grande échelle et la démocratisation de toute nouvelle technique de SID-MS.

Figure 71 : Les peptides AQUA pour « Absolute Quantification » sont des copies de peptides protéotypiques de la protéine cible qui sont synthétisés et marqués par un isotope. Ils sont ajoutés à l’échantillon avant l’analyse LC-MS

Cette méthode est très attractive pour la recherche puisqu’elle requiert l’utilisation de peptides qui sont disponibles à la vente et simples à utiliser. Les différents revendeurs proposent

287 C. G. Arsene, R. Ohlendorf, W. Burkitt, C. Pritchard, A. Henrion, D. M. Bunk, B. Güttler, Anal. Chem. 2008,

80, 4154–4160

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même une grande variété de séquences et la possibilité de synthétiser des séquences particulières. Le revers de la médaille étant le fait que les peptides AQUA soient limités en termes de taille de peptide qui doit être inférieure à 15 acides aminés tout en évitant certains acides aminés connus pour se dégrader ou s’oxyder comme le tryptophane.289,290 D’autres acides aminés sont également proscrits lorsqu’ils sont combinés entre eux et risquent de créer des réactions secondaires pour des analyses ultérieures comme la glutamine en N-terminal qui peut se transformer en pyroglutamate ou encore les association Asp-Leu, Asn-Pro et Asp-Pro.291,292 Même en mettant cet aspect de côté et des coûts de production qui diminuent, la stratégie AQUA peut vite devenir chère surtout lorsque l’on parle de plusieurs peptides à synthétiser, purifier et quantifier précisément et un par un. La solution est alors de se limiter à un seul peptide AQUA. Or même si celui-ci est protéotypique, il y a toujours un risque que celui-ci corresponde à plusieurs formes de la protéine.

Le peptide étalon étant introduit tardivement dans le protocole de manipulation de l’échantillon, la méthode AQUA est peu compatible avec les techniques de pré fractionnement comme la SDS-PAGE qui peut affecter de façon non négligeable la justesse de la méthode AQUA.²⁹³ De plus, étant donné que les peptides AQUA sont des analogues de molécules issues de digestions enzymatiques complètes, il est nécessaire de vérifier si celle-ci est effectivement totale lorsqu’effectuée sur une protéine cible.

Il est à noter deux améliorations de la technique publiées en 2004 et 2006 par Anderson et al. et Mayya et al. respectivement.²⁹⁴ La première, baptisée SISCAPA pour « Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibody », consiste en l’ajout d’une étape de sélection par immunoaffinité du peptide protéotypique et de son analogue marqué aux isotopes après la digestion enzymatique et avant l’analyse LC-MS. Cela permet une manipulation commune du peptide naturel et de son analogue en ne laissant alors qu’une seule étape sujette à un contrôle approfondi : la digestion enzymatique. L’autre amélioration apportée à cette technique est la possibilité de l’étude des mécanismes de phosphorylation de protéines grâce à l’incorporation de ces mêmes phosphorylations sur les peptides étalon.295 C’est l’équipe de Mayya et al. qui, en 2006, a réussi à effectuer le suivi de la phosphorylation des protéines CDK (pour « Cycle Dependent Kinases ») sur plusieurs résidus. Pour y parvenir, l’équipe a utilisé des peptides synthétisés qui comprennent les sites de régulation de la protéine CDK, à savoir les résidus T¹⁴ et Y¹⁵ de la séquence trypsique IGEG T¹⁴

289 T. Simat, K. Meyer, H. Steinhart, Journal of Chromatography A 1994, 661, 93–99

290 M. van de Weert, F. M. Lagerwerf, J. Haverkamp, W. Heerma, J. Mass Spectrom. 1998, 33, 884–891

291 Piszkiewicz D., Landon M., Smith E.L. Biochem Biophys Res Commun, 1970, 40, 1173–1178

292 Geiger T., Clarke S. J Biol Chem, 1987, 262, 785–794

293 J. Havliš, A. Shevchenko, Anal. Chem. 2004, 76, 3029–3036

294 N. L. Anderson, N. G. Anderson, L. R. Haines, D. B. Hardie, R. W. Olafson, T. W. Pearson, J. Proteome Res. 2004, 3, 235–244

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Y15GVVYK, obtenue par digestion trypsique de la protéine. Le but étant de suivre la phosphorylation de la protéine, l’équipe a choisi d’utiliser 4 combinaisons de phosphorylation (T14

P-Y15 p, T14

P-Y15, T14 -Y15

p, et T14-Y15) pour pouvoir mettre en évidence la dynamique de phosphorylation de cette séquence des CDKs. Cette technique souffre cependant de certains problèmes soulevés dès 1996 par la publication initiale de Barr et al.,296 le premier étant la pureté et la stabilité des molécules de référence ainsi que la variabilité de l’hydrolyse de la protéine. De plus, afin de pouvoir quantifier convenablement un étalon peptidique par SID-MS, celui-ci doit pouvoir être solubilisé et ne subir aucune modification chimique pendant sa conservation ou lors de l’étape de préparation de l’échantillon ; sans oublier la nécessité absolue de minimiser la perte de molécules par adsorption lors du stockage.^297,298

En somme, la technique AQUA est bien adaptée à tout ce qui va concerner, d’une part la quantification de protéine ciblée pourvu que l’étape de digestion enzymatique soit particulièrement au centre de toutes les attentions, d’autre part l’analyse de phosphorylations de protéines.

III.G. La technique IDBEST, ou comment combiner ESI, MALDI et ICP-MS

Les marqueurs IDBEST (pour « Isotope-Differenciated Binding Energy Shift Tag ») ont été introduits par Hall et Schneider en 2003 et 2004.299,300 Ceux-ci sont composés entre autre d’éléments qui présentent un fort défaut de masse comparé aux éléments habituellement utilisés (C, H, N, O). Un défaut de masse représente une différence négative entre la masse d’un composé et la somme des masses de ses éléments, qui reflète dans le cas d’un atome l’énergie de liaison nucléaire ; la référence du point de vue de la spectrométrie de masse étant le 12C qui affiche un défaut de masse de 0. On parle de défaut de masse car, par l’intermédiaire de l’équation de la relativité restreinte d’Einstein (ܧ ൌ ݉ ൈ ܿ;), à tout défaut ou excès de masse correspond un défaut ou un excès d’énergie de liaison nucléaire.

La plupart des stratégies d’études de profils protéiques en protéomique échouent face à l’identification de molécules de faible abondance à cause de leur gamme dynamique souvent limitée, comparée à la gamme dynamique affichée des approches ciblées de quantification de protéines dans des fluides biologiques, jusqu’à 11-12 ordres de grandeur dans le sérum par exemple. En outre, le nombre de peptides générés pose souvent problème en termes de résolution instrumentale et

296296 J. R. Barr, V. L. Maggio, D. G. Patterson, G. R. Cooper, L. O. Henderson, W. E. Turner, S. J. Smith, W. H. Hannon, L. L. Needham, E. J. Sampson, Clin. Chem. 1996, 42, 1676–1682

297 A. Kraut, M. Marcellin, A. Adrait, L. Kuhn, M. Louwagie, S. Kieffer-Jaquinod, D. Lebert, C. D. Masselon, A. Dupuis, C. Bruley, M. Jaquinod, J. Garin, M. Gallagher-Gambarelli, J. Proteome Res. 2009, 8, 3778–3785

298 C. G. Arsene, R. Ohlendorf, W. Burkitt, C. Pritchard, A. Henrion, D. M. Bunk, B. Güttler, Anal. Chem. 2008,

80, 4154–4160

299 M. P. Hall, S. Ashrafi, I. Obegi, R. Petesch, J. N. Peterson, L. V. Schneider, J. Mass Spectrom. 2003, 38, 809–816

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nécessite la plupart du temps des étapes de purification comme la chromatographie en phase inverse ou encore la chromatographie d’affinité. Il existe aussi les méthodes d’enrichissement pour contourner le problème de la limitation de la gamme dynamique. En revanche celles-ci peuvent être difficiles à mettre en place lorsque l’échantillon présente des composés isobares.

Figure 72 : Structure typique d’un marqueur IDBEST

Dans le cadre de la stratégie IDBEST, l’introduction d’atomes à haut défaut de masse va engendrer un déplacement des pics dans un spectre de masse du peptide contenant cet élément par rapport aux peptides ne contenant pas ce dernier et n’étant donc pas marqués. Ce déplacement est d’approximativement 0,1 u.m.a par atome présentant un défaut de masse. De tels écarts sont facilement caractérisables par des instruments avec une résolution supérieure à 10 000.301 Grâce au développement de tels appareils, l’optimisation poussée des méthodes chromatographiques de séparation en amont de l’analyse par spectrométrie de masse n’est plus une priorité.

Une caractéristique supplémentaire des marqueurs IDBEST est la présence d’une charge positive dont l’objectif n’est autre que fournir une haute efficacité d’ionisation. Ceux-ci sont également composés d’un site réactif vis-à-vis des amines terminales d’acides aminés, d’un fragment incorporant le marquage isotopique et d’un atome de brome pour introduire le défaut de masse (voir Figure 72 p.113). Un grand intérêt de cette stratégie IDBEST est l’utilisation du brome ou d’autres éléments à haut défaut de masse qui sont aussi métalliques ou semi-métalliques et qui offrent une excellente réponse en ICP-MS. Cela permet de combiner de façon complémentaire ces deux approches. Plusieurs groupes de recherche ont démontré la mesure sensible d’espèces organiques bromées par ICP-MS couplée à une séparation chromatographique.302,303,304 Dans cette optique l’ICP-MS pourrait être utilisée de façon complémentaire pour déterminer de manière absolue la quantité d’une protéine donnée via la mesure du contenu bromé de peptides.

301 B. Domon, Science 2006, 312, 212–217

302 A. P. Vonderheide, M. Montes-Bayón, J. A. Caruso, J Anal Spectrom 2002, 17, 1480–1485

303 D. Pröfrock, P. Leonhard, S. Wilbur, A. Prange, J Anal Spectrom 2004, 19, 623–631

304 B. Meermann, M. Bockx, A. Laenen, C. Van Looveren, F. Cuyckens, F. Vanhaecke, Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 439–448

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IV. Les techniques à base de marquage métabolique pour la quantification de