Les modèles pour décrire l’ionisation MALDI

Dans ce paragraphe, nous allons discuter les différents modèles existant qui permettent de décrire le processus d’ionisation qui prend place en MALDI-MS. En ce qui concerne les différentes phases du processus d’ionisation, celles-ci donnent lieu à des débats très animés. Ces deux approches opposent les travaux du Pr Karas aux travaux du Dr Knochenmuss qui portent respectivement sur le modèle des clusters et le modèle de la fusion énergétique.

II.A. Le modèle des clusters aussi appelé « lucky survivor model »

Ce modèle part du principe que des biomolécules, comme des protéines ou des peptides, déposées avec une solution de matrice le soient sous forme chargée en conservant la charge obtenue en solution. Cette hypothèse se base sur l’observation d’indicateurs pH-métriques qui conservent leur coloration et leur état de charge après cocristallisation avec des matrices acides, neutres et même basiques comme en témoigne l’étude de Karas et al en 2001.445 Dans ce modèle, presque toutes les biomolécules présentes dans le dépôt, dans le cas d’une matrice acide, afficheront un excès de charge positive avec des contre-ions tels que des trifluoroacétates ou des anions de matrice. De plus l’excès de charge doit être maintenu, et dans cette optique, le modèle postule une incorporation de l’analyte dans les cristaux. Cette hypothèse est en accord avec les processus de cristallisation rapide. En effet, d’après la théorie de la chaîne du solide humide, une croissance rapide de cristaux a pour conséquence l’incorporation de molécules de solvant qui sont alors

445

R. Krüger, A. Pfenninger, I. Fournier, M. Glückmann, M. Karas, Analytical Chemistry 2001, 73, 5812–5821

V

V Source S Laser Oscilloscope Générateur de retard « Pusher » (V_p) D (z o n e d e tran sfer t san s ch amp ) V_r≈ V_p Q₀ (Radiofréquence) Focalisation des ions Q₁ Filtre de masse Q₂ (Radiofréquence) Cellule de collision Optiques de transfert

159

potentiellement porteuse, dans le cas du MALDI, de molécules d’analytes sous forme solvatées et intégrées dans les cristaux. C’est une observation qui est connue par les mécanismes de croissance de cristaux et qui a également été modélisée.446 Cette hypothèse est valide dans le cadre de ce modèle en partant du principe que le séchage des dépôts est suffisamment rapide pour engendrer une cristallisation elle aussi suffisamment rapide qui intègre sous forme solvatée les molécules d’analyte.

Figure 93 : Schéma des processus majeurs proposés dans le modèle des clusters ou « lucky survivor » en ionisation MALDI. A représente l’analyte, m la matrice et R^- un contre-ion générique

Dans un second temps le modèle postule une brisure de la phase cristalline en plus petits blocs de matière lors de la phase de désorption/ablation (voir Figure 93 ci-dessus). Globalement, certains de ces blocs afficheront une charge positive ou négative par déficit ou excès de contre-ion. Lors de la phase de désorption/ablation et d’expansion du nuage particulaire, les blocs de matière sont supposés perdre des molécules de matrice neutres et de solvant. Si l’analyte est déjà chargé, en l’occurrence par rétention de charge en solution, l’évaporation du cluster engendrera un ion libre en phase gazeuse (voie C, Figure 93 ci-dessus). Dans d’autres clusters la charge peut avoir besoin de migrer de sa localisation initiale, sur un ion de matrice par exemple, pour aller se fixer sur une zone plus favorable comme une molécule d’analyte (ionisation secondaire, voie A Figure 93, ci-dessus). En

446

160

revanche, dans le cas d’ions multichargés, des voies de désolvatation douces et dures (respectivement voies B₁ et B₂, Figure 93 ci-dessus) mènent à différents ions libérés en phase gazeuse. Enfin, la neutralisation par des électrons ou des contre-ions est toujours possible sans être complète, menant alors à des ions monochargés dans le cas d’une désolvatation douce laissant le temps à cette réaction de se produire (voir Figure 94 ci-dessous).

Figure 94 : Représentation mécanistique dans le modèle des clusters de la neutralisation des charges de peptides excepté pour l’excès de charge qui subsiste où A représente l’analyte, R_A^- un anion et R_AH son acide conjugué, R_B et R_BH⁺ une base et son acide conjugué

Ces mécanismes de neutralisation permettent de comprendre, d’un point de vue mécanistique, pourquoi en MALDI on n’observe quasi exclusivement des ions monochargés et très peu d’ions dichargés ou plus en raison du faible excès de charges (positives ou négatives).

Une force du modèle des clusters est la justification de l’observation d’ions négatifs dans des conditions acides (1, Figure 95 ci-dessous) et inversement, de l’observation d’ions positifs dans des conditions basiques (2, Figure 95 ci-dessous). 447

Figure 95 : Représentation mécanistique dans le modèle des clusters de la possibilité de former des ions négatifs à partir de conditions acides (1) et des ions positifs à partir de conditions basiques (2), où A représente l’analyte, R_A^- un anion et RAH son acide conjugué, RB et RBH⁺ une base et son acide conjugué

Ce type d’évènement n’a jamais été observé avec des solutés standards comme le TFA ou les sels d’ammonium mais uniquement lorsque des acides forts ont été utilisés comme l’acide perchlorique (HClO₄) ou le bis(trifluorométhylsulfonyl)imide (HTFSI) dont les basicités en phase gazeuse sont faibles (voir Tableau 15 ci-dessous). Ces observations s’expliquent par la supériorité de la basicité en phase gazeuse des bases anioniques sur celle des bases neutres (voir Tableau 15 ci-dessous) et qui, une fois au contact des analytes protonés dans le cas d’un milieu acide, opèrent le transfert de proton et la formation de l’analyte sous forme anionique.

447

161

Type de molécule BG (kJ.mol^-1)

Base anionique CH₃COO^- 1 429

CF3COO^- 1 325

TFSI^- 1 221

ClO4

- 1 180

Base neutre Arginine (chaîne latérale) 1 007

Lysine (chaîne latérale) 952

Histidine (chaîne latérale) 952

Glycine (N-terminus) 852

NH3 847

Tableau 15 : Basicité en phase gazeuse (BG) de quelques bases anioniques et neutres tirées du site http://webbook.nist.gov/

II.B. Le modèle CPCD et la fusion énergétique ou « pooling effect»

Ce modèle a été développé par le Dr. R. Knochenmuss, initialement connu sous le nom de « Two-step ionisation model » ou « Two-step framework », a été modifié pour mieux correspondre aux phénomènes qu’il décrit, à savoir le modèle CPCD pour « Coupled Physical and Chemical Dynamics ». Ce nom a vocation à refléter la capacité du modèle à décrire de manière explicite tout le processus d’ionisation partant d’une phase condensée aux ions pseudo isolés en incluant les processus chimiques et physiques en interaction qui déterminent le résultat final.

Nous allons, au cours de ce paragraphe, discuter des deux étapes que ce modèle s’efforce de décrire, à savoir l’ionisation primaire et les mécanismes d’ionisation secondaire.

II.B.1. L’étape d’ionisation primaire

L’hypothèse avancée en UV-MALDI est l’absorption séquentielle de deux photons par la molécule de matrice, molécule capable d’absorber efficacement l’énergie UV. Ce phénomène est bien connu en physique et notamment en fluorescence où les fluorochromes sont capables d’absorber jusqu’à deux photons. Le problème, pour la matrice MALDI, provient du fait que les potentiels d’ionisation de presque toutes les matrices communément utilisées sont supérieurs à l’énergie absorbée via les deux photons (voir Tableau 16 p.162) produits par des lasers répandus comme les laser à N₂ (337 nm, 2 photons avec E_hν = 7,4 eV) et le Nd:YAG à fréquence triplée (355 nm, 2 photons avec E_hν = 7 eV). La même observation a été faite sur des clusters en phase condensée.⁴⁴⁸ A partir de ces observations, l’énergie nécessaire à l’ionisation des molécules de matrice a été estimée à une valeur portée par 3 photons.

448

162

Tableau 16 : Potentiel d’ionisation PI des matrices (eV) ⁴⁵⁰

449 V. Karbach, R. Knochenmuss, Rapid Communications in Mass Spectrometry 1998, 12, 968–974

450

A. Hoteling, W. Nichols, D. Giesen, J. Lenhard, R. Knochenmuss, European Journal of Mass Spectrometry 2006, 12, 345

Matrice Structure PI mesuré (eV) PI calculé (eV)

Acide rétinoïque 7,09

Anthracène 7,43 7,41

Acide sinapinique 7,72

Acide 3-indoleacrylique (IAA) 7,75

Acide 5-méthoxysinapinique 8,24 8,09

Dithranol (1,8-dihydroxyanthrone) 8,17

Acide 2,5-dihydroxybenoïque (DHB)⁴⁴⁹ 8,19

DCTB

(trans-2-[3-(4-tert-Butylphényl)-2-méthyl-2-propènylidène]malononitrile) 8,22

HABA (acide 2-(4'-hydroxybenzèneazo)benzoïque) 8,32

Acide 2,3-dihydroxybenzoïque 8,25 8,37 THAP (trihydroxyacétophénone) 8,44 Acide 5-méthylsinapinique 8,24 8,47 Acide 4-hydroxy-α-cyanocinnamique 8,50 Acide 3-hydroxybenzoïque 9,2 8,78 Acide 4-hydroxybenzoïque 9,2 8,83 Acide benzoïque 9,3 9,43 Acide nicotinique 9,3

163

La question qui se pose alors se résume à savoir comment l’ionisation des matrices est possible puisque l’on observe bien des ions. La réponse vient d’un processus de concentration d’énergie qui a été appelé fusion énergétique mais plus connu en anglais sous le terme de « pooling event ». Ce processus intervient lorsque deux molécules voisines sont suffisamment proches pour que leurs orbitales moléculaires puissent interagir entre elles (voir Figure 96 ci-dessous). Cela implique un contact des orbitales moléculaires du système aromatique π des molécules qui se trouvent dans un état solide, ordonné. Deux molécules voisines peuvent alors fusionner leur énergie sur l’une des deux en conservant la même énergie totale (1, voir Figure 96 ci-dessous). Si l’on considère uniquement des molécules excitées immobiles, le processus resterait insuffisant pour obtenir une ionisation efficace. Heureusement, l’énergie d’excitation possède la capacité de se déplacer dans la matrice solide, grâce à des sauts énergétiques de proche en proche ou « hopping ». Peu importe sur quelle molécule va être transférée cette énergie du moment qu’elle l’est sur une molécule voisine (voir 2 Figure 96 ci-dessous).

Figure 96 : Processus unimoléculaires et bimoléculaires de fusion énergétique existant dans le modèle « Coupled Physical and Chemical Dynamics » (CPCD). Les réactions de combinaison énergétique entre les états excités (électrons aux niveaux excités S1 et Sn et à l’état au repos S0) des matrices sont l’étape clé de la concentration énergétique et de l’ionisation⁴⁵¹

451

P. D. Setz, R. Knochenmuss, The Journal of Physical Chemistry A 2005, 109, 4030–4037

A

B

Ion S_n S₁ S₀ S_n S₁ S₀ Ion Processus unimoléculaire Sauts énergétiques (Processus bimoléculaire) S₁+ S₁à S0+ S_n S₁+ S_nà S0+ ion

1 2

3

164

En combinant ces capacités de fusion des énergies d’excitation et de saut énergétique, il est alors possible à partir de deux molécules excités à des états S₁ d’obtenir des molécules excitées à des états S_n qui pourront à nouveau absorber de l’énergie grâce aux sauts énergétiques et passer de l’état Sn à l’état ionisé (voir 3 Figure 96 ci-dessus).

La fusion énergétique a été démontrée grâce à des expériences d’extinction de fluorescence en FRET et HTRF sur des échantillons de matrice DHB auxquels a été incorporé du 4-(dicyanométhylène)-2-méthyl-6-(4-diméthylaminostyryl)-4H-pyrane (DCM), un fluorochrome. Pour les besoins de l’étude, il a fallu s’assurer que le DHB soit insoluble et le DCM soluble dans le solvant de lavage des cristaux formés pour éliminer le DCM adsorbé en surface des cristaux. Cette expérimentation revient à mesurer par FRET/HTRF la fluorescence due aux fluorochromes à différentes fluences laser dont l’objectif est d’exciter les molécules de matrice, initier le processus de transfert énergétique jusque sur les fluorochromes qui, une fois dans un état excité, perdront leur capacité à fluorescer. En effet la fluorescence (voir chapitre 1, paragraphe III.B) est basée sur l’absorption d’un photon dont l’énergie correspond à une différence entre un état au repos S0 et un état excité S1 puis à l’émission d’une radiation correspondant au passage de l’état S1 à l’état S0. A cause du saut énergétique des états S₁ des molécules de matrices, on assiste à une fusion énergétique S₁-S₁ entre la matrice et le fluorochrome qui entraîne soit une excitation supplémentaire de la matrice et une désexcitation du fluorochrome soit une excitation supplémentaire du fluorochrome et une désexcitation de la matrice. Les deux options ayant la même conséquence, à savoir l’arrêt de la fluorescence progressive à mesure que la fluence laser utilisée augmente, permettant ainsi à davantage de molécules de matrices d’être excitées et donc de stopper la fluorescence (voir Figure 97 ci-dessous). Les mesures ainsi effectuées ont permis de montrer que le temps moyen de transfert énergétique dans la matrice DHB était d’environ 50 ps avec un rayon d’action d’environ 15 molécules de matrice ultra pure. Ce qui montre à quel point ce phénomène de fusion énergétique est une clé de l’ionisation de la matrice, en particulier dans des dépôts concentrés en matrice et pourquoi une pureté extrême des matrices doit être exigée.

165

Figure 97 : Fluorescence de la matrice en fonction de la fluence du laser. Les résultats symbolisés par les cercles correspondent à l’étude présentée tandis que les losanges correspondent à une autre étude de la littérature à des fins comparatives. Les courbes sont issues d’une modélisation moléculaire par équations différentielles décrites dans la publication de Setz et Knochenmuss de 2005

Une fois la matrice ionisée, elle peut apparaître sur les spectres de masse sous différentes formes comme des radicaux (M^+•, M-•), des produits de protonation ou de déprotonation ([M+H]+ ou [M-H]-) ou encore des adduits cationiques comme [M+Na]+, sachant que les ions primaires sont supposés être les radicaux, les autres en étant dérivés (voir Figure 105 p.177). Le fait de décrire l’ionisation de la matrice ne signifie pas que des molécules d’analyte ne puissent pas être ionisées à cet instant, mais simplement que la matrice étant présente en large excès, il est beaucoup plus probable que ce soit elle qui soit le sujet de cette ionisation primaire ; en particulier si l’analyte ne comporte pas de groupements chromophores capables d’absorber les radiations UV.

II.B.2. La deuxième étape d’ionisation : la production des ions d’analyte à partir des ions de matrice primaires

Cette étape d’ionisation secondaire se déroule dans le nuage particulaire en expansion dont la densité va évoluer suffisamment lentement pour donner lieu à de multiples collisions entre molécules qui vont produire les ions secondaires qui seront détectés (voir Figure 98 ci-dessous). Cette étape est beaucoup plus longue que l’ionisation primaire et peut potentiellement démarrer dès la formation du premier ion de matrice, signifiant la possibilité que les phénomènes d’ionisation primaires et secondaires puissent se chevaucher dans le temps.

Flu or e scen ce d ans la ma trice n ormalis é

e ^{Lüdemann et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry 2002, 16, 1287}

Setz et Knochenmuss, The Journal of Physical Chemistry A 2005, 109, 4030

Fluence laser (J.m-²) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,01 0,1 1,0 10 100 1 000

166

Figure 98 : Réactions de formation d’ions lors de l’étape d’ionisation secondaire par transfert de proton (1), transfert d’électron (2) ou transfert de cation (3), où A est la molécule d’analyte et M la matrice

Les nombreuses collisions alors en jeu tendent vers un équilibre thermique local lié à l’agitation moléculaire, avec pour conséquence le fait que les ions présents à la fin de l’expansion du nuage particulaire soient les plus favorables thermodynamiquement. Le point significatif pour une bonne compréhension des spectres MALDI est la thermodynamique des réactions matrice-analyte et analyte-analyte sous formes ioniques et moléculaires. En effet, le nuage particulaire en expansion est le siège de nombreuses collisions bimoléculaires et, à cause de la diminution de la densité de ce nuage, celles-ci vont diminuer. La matrice étant en large excès par rapport à l’analyte, les dernières collisions se passent alors, de manière très probable, entre une molécule d’analyte et une molécule de matrice, ce qui signifie que la cinétique et la thermodynamique de réactions bimoléculaires matrice-analyte sont la clé de cette étape d’ionisation secondaire.

Pour un nombre important de molécules comme les peptides et les protéines, les réactions de protonation sont dominantes (voir 1, Figure 98 ci-dessus). Intuitivement les peptides présentant des résidus basiques seront mieux détectés grâce à une affinité protonique largement supérieure à celle des matrices (voir Tableau 17 ci-dessous) qui peut aller jusqu’à 175 kJ.mol-1 en faveur de la déprotonation des molécules de matrice, rendant ces peptides beaucoup plus facilement détectables.

167

Composé Structure Affinité protonique (kJ.mol^-1)

Matrice

HCCA Voir Tableau 16

p.162 ^{841 ; 933±9 ; 841,5} 2,5-DHB Voir Tableau 16 p.162 855±8 ; 853,5±16,7 ; 854±14 ; 850,4 ; 855,8 Acide férulique 879 Acide sinapinique Voir Tableau 16

p.162 ^{887 ; 894,5±13,5 ; 875,9} Acide 3-hydroxypicolinique (3-HPA) ^{896 ; 898,5} HABA (acide 2-(4'-Hydroxybenzèneazo)benzoïque) Voir Tableau 16 p.162 ^{943 ; 950}

Dithranol Voir Tableau 16

p.162 ^{874,5±8,4 ; 885,53}

THAP Voir Tableau 16

p.162 ^{882 ; 893} Analyte Glycine _{885±13 ; 859,9 ; 863} Histidine 955±9 ; 969,2 ; 937 Arginine > 1 016 Gramicidine S - > 1 018,0 Bradykinine - > 1 025,1 Leucine-enképhaline - 967,8±2,1 Cytochrome C

- ^{(ion pentaprotoné) 735, (ion} tétraprotoné) 722, (ion triprotoné) 673

Tableau 17 : Affinités protoniques (AP) de matrices et d’analytes⁴⁵²

Pour d’autres molécules qui affichent une affinité protonique plus faible comme des polymères synthétiques, le mécanisme d’ionisation par transfert cationique est beaucoup plus favorable que les deux autres (voir 3, Figure 98 p.166). Cependant l’exothermicité des réactions de transfert cationique est beaucoup plus faible pour plusieurs types de biomolécules (peptides, nucléobases et sucres) avec 1 kJ.mol^-1 dans le cas du sodium et des réactions endothermiques avec le potassium (voir les deux dernières colonnes, Tableau 18 ci-dessous). Ce qui est en accord avec les observations faites selon lesquelles les massifs isotopiques d’analytes cationisés sont d’intensité relative plus faible que leurs analogues protonés, rapport pouvant varier en fonction de la concentration en cation.

452

168

Composé Structure ^{Affinité pour H}

+ (kJ.mol^-1) Affinité pour Na⁺ (kJ.mol^-1) Affinité pour K⁺ (kJ.mol^-1)

Matrice 2,5-DHB Voir Tableau 16

p.162 Acide sinapinique Voir Tableau 16

p.162 860 159 104

Dithranol Voir Tableau 16

p.162 860 158 99

THAP Voir Tableau 16

p.162 878 154 97

Dithranol Voir Tableau 16

p.162 874 150 94

Analyte

Dipeptides - - > 160 -

Nucléobases - - 165 - 190 -

Sucres - - > 160 -

Tableau 18 : Affinités cationiques de matrices et de biomolécules⁴⁵³

II.C. L’expression quantitative du modèle CPCD II.C.1. Modélisation de l’ionisation primaire

Dans un article de 2002, le Dr. Knochenmuss a publié une approche quantitative de son modèle CPCD en ayant recours à des équations différentielles pour modéliser le phénomène de désorption/ablation/ionisation en considérant l’échantillon MALDI comme un milieu continu dans lequel la température est bien définie et la description microscopique des évènements moléculaires inutile.454 Grâce à cela, il a été possible d’obtenir l’évolution de la quantité relative de molécules de matrice dans l’état excité S₁, S_n, totalement ionisées ainsi que la quantité relative d’ions d’analyte (voir Figure 99 p.169).

Parmi les conclusions les plus importantes de cette étude, notons la dépendance du résultat d’une analyse MALDI par rapport à la fluence du laser, à la longueur d’onde de ce dernier, l’effet de la taille du dépôt et le seuil apparent de fluence nécessaires à l’obtention d’un spectre de qualité.

Concernant ce dernier point, il a souvent été observé qu’à de faibles fluences laser, aucun signal MALDI n’était observé qui, en revanche, pouvait laisser l’impression d’apparaître subitement dès le franchissement d’un seuil pour augmenter rapidement avec la fluence. Etant donné qu’un grand nombre d’excitations sont nécessaires pour obtenir une ionisation, cette dernière peut difficilement dépendre de la fluence de manière linéaire ; ce qui peut expliquer ce seuil apparent. De plus, lorsqu’une faible fluence est utilisée, l’onde thermoélastique et la vague d’expansion deviennent trop faibles pour provoquer une ablation de matière qui passe d’un état condensé à gazeux de manière plus douce par désorption, de la matière en surface de surcroît. Et ce n’est que

453 R. Knochenmuss, can be found under http://www.rknochenmuss.ch/MALDI/MALDIpage_3b.html

454

169

lorsque la fluence atteint une valeur suffisamment forte qu’une assistance pneumatique provoque l’ablation de matière pour arracher des molécules d’analytes présentes en profondeur.

Figure 99 : Illustration de l’évolution d’un échantillon MALDI prédite par une simulation obtenue grâce au modèle CPCD quantitatif. La fusion énergétique des états S₁ en quantité relative abondante permet d’atteindre les états excités supérieurs S_n, puis la fusion énergétique des états S₁ et S_n permet d’obtenir les ions de matrice (ionisation primaire), qui par la suite réagiront avec l’analyte neutre pour former les ions d’analyte (ionisation secondaire)

Le deuxième point soulevé par cette étude est la dépendance du MALDI à la longueur d’onde qui donne de meilleurs résultats si la matrice absorbe correctement l’impulsion lumineuse. Cela revient à dire que le signal des ions de matrices augmentera plus rapidement pour une fluence donnée. En effet, si le nombre de molécules de matrice excitées dans un volume donné augmente, autrement dit une meilleure absorption de l’impulsion laser grâce à un coefficient d’absorption molaire plus important, la vitesse de fusion énergétique et d’ionisation augmentera d’autant plus que la densité de molécules capables de prendre part à ces mécanismes s’accroîtra. Cela engendrera également une élévation plus rapide de la température par désexcitations non radiatives consécutives d’un plus grand nombre de molécules dans un état excité S1, montrant la bonne influence d’une meilleure absorption de l’impulsion laser sur l’ionisation et la désorption/ablation qui se renforcent mutuellement (voir Figure 100 p.170).

Impulsion laser (355 nm) Etat excité S₁

Etats excités S_n(Zoom ×10) Ions de matrice

Ions d’analyte

Rendement d’ionisation de matrice : 0,1 % Rendement d’ionisation d’analyte : 0,3 %

% %

Popul

ati

on

rel

ati

ve

0 5 10 15 20 25 30.10-3

Temps (ns)

0 5 10 15 20

170

Figure 100 : Représentation de l’efficacité d’ionisation par rapport à la longueur d’onde et à l’impulsion laser en fonction de la fluence pour une matrice DHB. Les courbes supérieures pour chaque paramètre (i.e : chaque couleur) représentent le rendement correspondant à la couche supérieure de l’échantillon, tandis que la courbe inférieure correspond aux rendements intégrés de toutes les particules émises

Troisième point mis en avant par ces travaux de modélisation, l’effet de la taille du dépôt sur l’ionisation MALDI. Bien qu’intuitivement, la formation d’un plus petit dépôt laisse deviner une plus faible quantité d’ions (voir Figure 101 p.170), l’avantage de systématiquement travailler avec de très

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