C. La technique HTRF, une récente amélioration du FRET

Cette approche HTRF (pour « Homogenous Time-Resolved FRET »),¹¹¹ parfois connue par le sigle TF-FRET pour « Time-Resolved-FRET », est dérivée du FRET en combinant cette technologie avec un délai temporel avant la mesure de fluorescence. On y retrouve donc le transfert d’énergie entre deux fluorochromes en contact rapproché. La principale avancée, par rapport au FRET qui souffrait de problèmes de fort bruit de fond lors de la mesure de la fluorescence, est l’introduction d’un délai (50-150 µs) avant la mesure de la fluorescence des molécules marquées. Celui-ci est appliqué entre l’excitation initiale et la prise de mesure, ce qui permet d’éliminer tout bruit de fond (toute fluorescence non spécifique) causé par des émissions à courte durée de vie caractéristiques de ce bruit de fond étant donné que les fluorochromes sont conçus pour émettre sur une longue durée (voir Figure 29 ci-dessous).

Figure 29 : L’émission d’énergie à partir d’une source d’excitation (lampe, LASER) est suivie d’un délai prévu pour prendre en compte la décroissance des émissions de fluorescence à courte durée de vie. La ligne rouge correspond au signal FRET à 665 nm, la ligne verte au signal du donneur libre de fluorescence à 620 nm, la ligne grise à la fluorescence de la matrice (i.e : les composés présents dans le tampon) et la ligne bleue au signal de l’accepteur libre de fluorescence

L’élément central des fluorochromes à HTRF est le lanthanide qui peut être soit de l’Europium (Eu3+) soit du Terbium (Tb2+), sachant que le Terbium donne un signal 10 à 20 fois plus

111 F. Degorce, Current Chemical Genomics 2009, 3, 22–32

Avantages de la fluorescence Inconvénients de la fluorescence

Meilleure sécurité Toxicité

Utilisation facilité Interférence avec certains processus biologiques

Multiplexage de la fluorescence (utilisation de plusieurs fluorochromes simultanément avec plusieurs canaux d’acquisition)

Utilisation de deux radionucléides simultanés maximum (³H et ³³P grâce à leurs intensités différentes)

Transfert d’énergie (FRET) Larges molécules à lier aux protéines et aux ligands

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intense que son acolyte. Bien entendu, ils ne sont pas fluorochrome à eux seuls mais nécessitent une antenne pour collecter l’énergie incidente. Rôle joué par la cage moléculaire qui les entoure (voir Figure 30 ci-dessous) et qui permet le transfert d’énergie au receveur.

Figure 30 : Structure du cryptate d’europium utilisé en HTRF. On parle de cryptate car le lanthanide est enfermé dans une cage à l’image d’une crypte

Les signaux HTRF sont mesurés à deux longueurs d’onde correspondant au donneur (620 nm) et au receveur (665 nm). C’est le grand avantage de la technique : cela permet d’une part de réduire les variations entre micro-tubes, d’autre part d’étalonner les mesures par rapport à l’émission du donneur. En effet, pour une mesure dupliquée donnée, l’intensité des deux signaux peut varier à cause d’interférences. Cependant le rapport entre les intensités des deux longueurs d’onde doit être constant, tout du moins proche, ce qui permet de réduire cette variabilité inter micro-tubes. Second point, l’émission du donneur sert d’étalon interne étant donné que ce dernier n’est pas affecté par l’expérimentation menée, tandis que l’émission du receveur sert d’indicateur de l’évolution de la réaction biologique suivie (voir Figure 31 ci-dessous).

Figure 31 : Principe de l’expérience de suivi de l’AMPc qui consiste en la mesure du signal FRET du complexe AMPc-d2. De l’AMPC liée à un anticorps portant un fluorochrome donneur se complexe avec l’accepteur d2 pour émettre le signal FRET par excitation du premier à 337 nm. Au fur et à mesure que de l’AMPc libre est produite par la cascade réactionnelle d’un RCPG, celle-ci complexe l’accepteur d2 conduisant à la diminution puis à l’arrêt du signal FRET

Les applications de cette technique sont nombreuses. Récemment, l’approche HTFR a été utilisée dans une expérimentation fonctionnelle mettant en jeu la ghréline et un RCPG au sein de

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l’IBMM (le récepteur à hormone de croissance sécrétagogue de type 1a, ou GHS-R1a).112 La quantification de messagers secondaire de l’activation d’un RCPG (expérimentation fonctionnelle) fait également partie des applications possibles de l’HTRF tout autant que des études de dimérisation de récepteur (expérimentation mécanistique).¹¹³ D’autres, comme les interactions protéine virale/protéine humaine ou ADN/protéine peuvent être suivies par cette approche et, de façon générale, toute interaction mettant en jeu deux protéines. Enfin cette technique peut aussi être utilisée pour effectuer du contrôle qualité de bioprocédé cherchant à produire des molécules biothérapeutiques,114 c’est-à-dire par culture cellulaire, et même pour de la détection de biomarqueurs.¹¹⁵

III.D. La technique SPR, une approche de type « Label-free »

La résonance plasmonique de surface (SPR pour « Surface Plasmonic Resonance ») est une technique de détection de l’interaction de deux molécules qui se base, quant à elle, sur un changement de l’indice de réfraction d’une surface « sonde ». Ce phénomène est caractérisé par une oscillation résonnante d’électrons stimulée par une lumière incidente. Cette oscillation se produit à l’interface entre deux couches de matériaux de permittivités116 opposées (e.g : une couche métallique et l’air). La résonnance est quant à elle atteinte pour une fréquence particulière des photons incidents, et donc une longueur d’onde, qui doit correspondre à la fréquence naturelle d’oscillation des électrons.

Lorsque le faisceau lumineux incident touche la surface d’analyse, il s’en suit la propagation dans la surface métallique d’une onde électromagnétique non-radiative : le polariton plasmonique de surface. Ce dernier est extrêmement sensible à tout changement de la surface comme l’adsorption de molécule étant donné que l’onde se propage à la limite entre la surface métallique et le milieu extérieur (air, verre d’un prisme).

Lorsque le polariton plasmonique rencontre et interagit avec une particule locale ou une irrégularité, comme une biomolécule adsorbée, une partie de l’énergie peut être à nouveau émise sous forme de lumière. C’est cette émission qui peut être détectée dans une direction qui dépendra de l’angle d’incidence de la source lumineuse et de l’angle de résonnance plasmonique de surface.

112 J.-P. Leyris, T. Roux, E. Trinquet, P. Verdié, J.-A. Fehrentz, N. Oueslati, S. Douzon, E. Bourrier, L. Lamarque, D. Gagne, et al., Analytical Biochemistry 2011, 408, 253–262

113 F. Ciruela, V. Casadó, R. J. Rodrigues, R. Luján, J. Burgueño, M. Canals, J. Borycz, N. Rebola, S. R. Goldberg, J. Mallol, et al., J. Neurosci. 2006, 26, 2080–2087

114 E. Idusogie, J. Castro, C. Casipit, A. Sato, Y. Terasawa, M. Mulkerrin, BioProcess Int 2008, 6, 20–33

115 H. Lewis, D. Beher, N. Cookson, A. Oakley, M. Piggott, C. M. Morris, E. Jaros, R. Perry, P. Ince, R. A. Kenny, et al., Neuropathology and Applied Neurobiology 2006, 32, 103–118

116 La permittivité est une propriété physique essentielle qui mesure la résistance d’un milieu soumis à un champ électrique, en l’occurrence un faisceau lumineux.

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La première expérience basée sur la SPR a été publiée par Liedberg, Nylander et Lundström en 1983.117 Au cours de leur expérimentation, des immunoglobulines de type IgG ont été adsorbées sur un film d’argent de 600 Å d’épaisseur à partir d’une solution aqueuse pour tenter de les détecter sur ce film métallique. C’est une approche qui peut être utilisée aussi bien pour la détection de gaz que la biodétection. L’avantage de cette technique par rapport à d’autres expérimentations comme le test ELISA est bien son absence de marquage en cela qu’aucune molécule sonde n’est nécessaire pour détecter un analyte.118

Figure 32 : Schéma d’une plaque à SPR. La surface métallique est recouverte par une couche de dextrane (un

exopolysaccharide naturel) capable de se lier aux NH2 terminaux des protéines. Une lumière est émise et diffractée par le prisme frappant sous de multiples angles la surface métallique. Tous les rayons diffractés sont réfléchis par la surface métallique sauf pour l’angle pour lequel le métal absorbera la radiation transformée en onde plasmonique. Cela entraîne une absence de réflexion et une faible intensité sur le détecteur. Comme l’onde se déplace à la surface du métal, n’importe quel changement dans la surface fera varier cet angle

Grâce à la SPR il est possible de déterminer des constantes de dissociation étant donné que c’est le rapport de la vitesse de dissociation sur la vitesse d’association d’un ligand pour un récepteur, deux grandeurs qui peuvent être obtenues par cette méthode. Pour cela une protéine qui servira d’appât est fixée sur la surface métallique, en l’occurrence imprégnée de dextrane, du cristal de SPR. Par la suite, une solution contenant l’analyte (le ligand) est injectée sur la couche contenant la protéine réceptrice. La liaison du ligand à son récepteur induit une variation au niveau de la surface qui va avoir pour conséquence l’augmentation du signal SPR. Cela permet d’obtenir la vitesse d’association du ligand. Une fois que l’équilibre est atteint, traduit par un plateau dans l’intensité du signal SPR, une solution exempte de ligand est injectée dans le but de déplacer le déplacer et d’engager la dissociation pour, in fine, obtenir la vitesse de dissociation de ce ligand. Ces données

117 B. Liedberg, C. Nylander, I. Lunström, Sensors and Actuators 1983, 4, 299–304

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permettent ensuite d’accéder directement à la constante de dissociation du ligand. L’évolution du signal SPR peut s’expliquer par le couplage de la lumière incidente avec le polariton plasmonique de la surface métallique qui peut être influencé par une modification de la couche/interface jusqu’à une distance de quelques nanomètres, ce qui correspond à la couche de protéine appât additionné de la taille du ligand. C’est la raison pour laquelle la liaison entraînera une modification ressentie par le polariton plasmonique qui aura pour conséquence une modification de l’angle de réflexion de la lumière incidente.

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Tableau 8 : Tableau résumé des principales techniques de criblage de RCPG

Expérience Cible Technique Avantages Inconvénients

Mesu

re de

lia

iso

n

réce

pt

e

ur

/li

g

an

d

Mesure de radioactivité RCPG quelconque

Filtration Criblage haut débit, peu d'interférences, mesure de l’agoniste et de l’antagoniste en une expérience

Disponibilité du radioligand, déchets radioactifs produits, besoin d'une seconde expérience fonctionnelle Mesure de ligand marqué RCPG quelconque Système Tag-lite™

Pas de radioactivité, criblage haut débit, peu d'interférences, mesure de l’agoniste et de l’antagoniste en une expérience

Disponibilité du ligand marqué, besoin d'une seconde expérience fonctionnelle Mesure d'intensité lumineuse réfléchie RCPG quelconque

SPR Pas de marqueur à intégrer (label-free), étude de cinétique d’association et de dissociation, étude d’équilibres de liaison, étude d’interactions protéines-protéines

Surface métallique très fine à produire et à recouvrir par un polymère adapté et très fin (épaisseur totale de l’ordre du nanomètre) permettant l’ancrage de

biomolécules Dimérisation de récepteurs (mesure de luminescence) RCPG quelconque

BRET/FRET Les hétérodimères sont de plus en plus considérés comme des cibles pharmacologiques d'intérêt è Intérêt croissant de l’expérience

Système très artificiel, pas d'accès pour l'instant aux états natifs des dimères de RCPG

Suivi

de

l'activ

at

ion

d

es

pr

o

téi

nes

G

Suivi d'AMPc RCPG à Gα_i/o, Gα_s HTRF™, radioactivité, fluorescence

Criblage haut débit, haute sensibilité Besoin de connaître le mécanisme de liaison et les voies de signalisation, inadapté aux RCPG orphelins,

récepteurs mutants (HTRF) Suivi de Ca2+ RCPG à Gα_q

avec Gα_15/16

Fluorescence , FRET, BRET

Criblage haut débit, expérience fonctionnelle sur cellules vivantes, mesure de l’agoniste, de l’antagoniste et d’un allostère en une expérience

Interférences fluorescentes dues aux composés, inadapté pour les agonistes inverses et les agonistes à liaison lente

Suivi d'IP₁ RCPG à Gαq

avec Gα15/16

HTRF™, radioactivité

Criblage haut débit, expérience fonctionnelle sur cellules vivantes, adaptée aux ligands à liaison lente

Validation à l'étape industrielle limitée

Exp

é

rie

nce

fonction

nel

Dans le document La dilution isotopique en spectrométrie de masse MALDI-ToF pour la mesure d’interactions entre récepteurs couplés aux protéines G et ligands peptidiques (Page 54-59)