La quantification en spectrométrie de masse MALDI-ToF

Le chapitre 2 nous a permis d’approcher les différentes techniques de quantification en SID-MS, parmi lesquelles la majorité est basée sur l’utilisation de quadripôles et le suivi de transitions avec séparation chromatographique en amont à une ou deux dimensions selon la complexité de l’échantillon à analyser. Les méthodes de quantifications en SID-MS utilisent toutes, que ce soit par marquage métabolique ou chimique, des isotopes du carbone et de l’azote voire de l’oxygène pour la quantification en raison, parfois, de déplacements en temps d’élution induis par un marquage au deutérium.

Cela n’est pas du tout une source de problème en MALDI étant donné qu’il n’y a pas d’étape de séparation chromatographique en amont et qu’un échantillon complexe est analysé dans son ensemble. Cela permet d’effectuer du marquage isotopique par deutérium, plus simple et bon marché que le marquage aux isotopes du carbone, de l’azote et de l’oxygène grâce à des couplages de fragments marqués au deutérium sur les chaînes latérales des résidus d’une protéine analysée. C’est l’approche utilisée par Schmidt et al en 2005 et la technique ICPL (pour « Isotope-Coded Protein Labelling »), abordée au paragraphe suivant. Un autre avantage est la possibilité de se servir des propriétés d’échanges proton/deutérium (H/D) de la SID-MS pour mesurer des cinétiques d’échange en fonction de paramètres expérimentaux (échantillon, nature et forme de la biomolécule analysée etc…) et de les relier à des constantes thermodynamiques. C’est le cas des approches SUPREX et PLIMSTEX qui seront abordées dans un second temps.

Caféine

1

2

3

183 III.A. La dilution isotopique en MALDI-ToF-MS

Il existe des travaux qui visent à accéder à la quantification par dilution isotopique en MALDI-MS. Habituellement, le MALDI n’est pas particulièrement adapté à la quantification à cause de la forte dépendance, de la part du signal obtenu, envers les conditions de co-cristallisation analyte/matrice. Un certain nombre d’études en protéomique et qui ont eu recours à l’analyse par MALDI-ToF-MS se servent de relations semi-quantitatives. Cela mis à part, les hauteurs de pics sur un spectre MALDI ne sont pas nécessairement le reflet exact de la concentration de l’analyte dans l’échantillon et ce pour plusieurs raisons. Tout d’abord le rendement d’ionisation ; celui-ci serait de 0,01 à 0,1 % d’après les études menées par R. KNOCHENMUSS, d’où une faible représentativité de la quantité de molécules présentes dans un dépôt. Deuxièmement, il peut exister des compétitions à l’ionisation entre plusieurs composés au sein de l’échantillon et, en fonction de la cristallisation des différents composés, cet effet peut être plus ou moins important et donc créer une certaine dispersion dans les résultats observés. Cet aspect de cristallisation est directement relié à l’homogénéité du dépôt et donc à une représentativité de la zone analysée pour l’ensemble du dépôt qui est primordiale. Enfin, si les hauteurs de pics sont sujettes à d’importantes variations, il est plus judicieux de s’intéresser aux aires sous les pics et d’avoir recours à la technique de la dilution isotopique pour obtenir des mesures plus justes et précises.469 Une différence par rapport à l’ionisation ESI est la présence dans la région des « basses » masses (en deçà de 1 000 Th) d’un nombre important d’ions provenant de la matrice et d’adduits ou fragments de clusters à base de matrice. La coexistence de ces ions de haute intensité, particulièrement dans des conditions d’analyse avec une faible quantité d’analyte, peut interférer avec la détection de composés cibles lorsque la masse de ceux-ci se rapproche des interférences sus-citées. La distinction entre le bruit de fond et les ions d’intérêt est donc primordiale.

La plus directe des méthodes applicables en MALDI-ToF-MS reste l’option qui consiste simplement en le couplage d’un marqueur isotopique sur la molécule à analyser qui sera utilisée en tant qu’étalon interne. C’est celle utilisée par Schmidt et al. en 2005 pour la publication d’une méthode de protéomique quantitative baptisée ICPL (voir Figure 111 p.184).470 Elle est basée sur le marquage de groupements amines libre. Le marquage en question est effectué après dénaturation de la protéine et réduction des ponts disulfure dans le but d’atteindre le plus de sites aminés libres possible. La méthode a été appliquée à l’analyse du protéome d’E. coli. L’inconvénient majeur de cette approche est l’obligation de passer par une étape de vérification de la complétion du marquage chimique qui nécessite l’emploi de nicotinyle d’N-hydroxysuccinimide. Ce dernier permet de modifier

469 S. S. Bansal, J. M. Halket, J. Fusova, A. Bomford, R. J. Simpson, N. Vasavda, S. L. Thein, R. C. Hider, Rapid

Commun. Mass Spectrom. 2009, 23, 1531–1542

184

le pI (pour « Point isoélectrique ») des protéines partiellement marquées pour les séparer de celles qui le sont totalement. Cette méthode permet d’obtenir des résultats justes, précis et reproductibles tout en fournissant d’importantes données sur la séquence de la protéine, PTM et isoformes comprises. Cependant le nombre de tirs LASER utilisés (2 500 par peptide analysés) force un temps d’analyse important pour l’ensemble du protéome.

Figure 111 : Schéma général pour la méthode de marquage de protéine ICPL. L’alkylation se fait par l’iodoacétamide et le marquage par le butyrate d’N-hydroxysuccinimide directement après lyse de la cellule. Vient ensuite le marquage grâce à un groupement sous forme légère ou lourde qui affiche un ester d’N-hydroxysuccinimide. Après rassemblement des deux échantillons, la réduction de la complexité protéique de l’échantillon passe par des méthodes de type FFE (pour « Free Flow Electrophoresis »), LC ou encore Electrophorèse 1D ou 2D. Une étape supplémentaire de séparation est effectuée au niveau peptidique par chromatographie 2D. Les peptides marqués apparaissent par paires séparées par une différence de masse constante en mode MS pour permettre la quantification. Le spectre MS/MS sert, quant à lui, à identifier les peptides

Une seconde étude se servant d’un marquage chimique ciblant une protéine a été présentée par Sogawa et al. en 2011 dans laquelle l’équipe mesure des fragments α de chaîne C de fibrinogène (FIC 5.9).⁴⁷¹ La même équipe avait déjà publié l’observation de changements dans l’abondance de FIC 5.9 pendant une période de sobriété donnée. Ces variations étaient détectables par des méthodes conventionnelles sans avoir recours à la SID-MS. En revanche, dans le cas d’une hépatite C chronique, les différences entre les niveaux d’expression de FIC 5.9 d’une part des patients, d’autre part du

471 K. Sogawa, Y. Kodera, K. Noda, Y. Ishizuka, M. Yamada, H. Umemura, K. Maruyama, T. Tomonaga, O. Yokosuka, F. Nomura, Clin. Chim. Acta 2011, 412, 1094–1099

185

groupe contrôle étaient si faibles que les mesures effectuées n’étaient pas significatives par méthode conventionnelle. D’où le recours particulièrement adapté de la SID-MS à ces groupes de personnes. Le suivi de transitions par SRM/MRM a été largement utilisé et validé pour la quantification comme alternative aux expérimentations immunologiques en faisant appel à la SID-MS pour la découverte de biomarqueurs. C’est dans ce contexte que la technique MALDI est introduite pour être validée de la même manière grâce au recours à la SID-MS. Bien entendu, il est possible de refléter l’abondance de la protéine FIC 5.9 sans recours à l’addition d’un étalon, comme cela a été publié.472 C’est oublier le fait que l’ajout de cet étalon (i.e : un fragment peptidique de 5,9 KDa de FIC 5.9 marqué par un isotope) combiné au système ClinProt utilisé en diagnostic clinique, permet d’améliorer la fiabilité de la mesure, en l’occurrence des intensités des signaux MS, de ce fragment ciblé en tant que biomarqueur. De plus, cela facilitera par la même occasion la comparaison inter laboratoire, condition sine qua non à une validation clinique d’une méthode pour une application à grande échelle.

Figure 112 : Structure du Candesartan (CAD) sous forme légère (Y = H) ou lourde (Y=D, CAD-d4)). C’est un antagoniste des récepteurs de l’angiotensine II impliqué dans le traitement l’hypertension artérielle et de l’insuffisance cardiaque avec disfonction cystolique ventriculaire gauche

Enfin, une troisième étude publiée en 2013 par Nakanishi et al. utilise la SID-MS combinée à la technique MALDI pour quantifier le Candesartan (voir Figure 112 p.185) dans du plasma de souris et même dans des coupes de tissus par imagerie MALDI en mode SRM grâce à la fragmentation d’ions métastables par PSD (pour « Post Source Decay, voir Figure 113 p.186).473 Un étalon deutéré a été utilisé dans cette étude en tant qu’étalon interne.

472 K. Sogawa, S. Itoga, T. Tomonaga, F. Nomura, Alcohol. Clin. Exp. Res. 2007, 31, S22–S26

186

Figure 113 : Spectre MALDI PSD des molécules CAD et CAD-d₄ obtenue par Nakanishi et al. en 2013

Cette étude a montré un très bon étalonnage avec une pente de 0,91 et une ordonnée à l’origine proche de l’origine à 0,02 tout en affichant des coefficients de variation de 3,4 à 17,3 %. L’intérêt de cette étude réside également dans la capacité de la technique MALDI combinée à la SID-MS pour caractériser la répartition spatiale de la protéine aussi bien dans les vaisseaux sanguins que dans le plasma.

Actuellement, l’utilisation du MALDI-ToF-MS pour la quantification de biomolécules est restée très limitée en se cantonnant à de la mesure d’abondances relatives dans des échantillons biologiques de protéines à travers l’analyse par MS et MS² des peptides protéolytiques et à la mesure de petites molécules par PSD. Cela ouvre la voie à de prometteuses investigations pour développer des méthodologies innovantes de quantification de peptides en complémentarité des techniques existantes principalement appropriées aux études protéomiques de type « shotgun ».