Reprogrammation des cellules murines

Les cellules iPS 338 ont été reprogrammées au sein du laboratoire grâce au virus de Sendai. Le protocole comprend différentes étapes : isolement et amplification des cellules murines adultes, transduction au moyen du virus de Sendai et caractérisation des cellules reprogrammées (Figure 46).

Figure 46 : Schématisation du mode opératoire d’obtention de cellules souches pluripotentes induites murines.

IPS : induced pluripotent stem – cells. MEF : murine embryonic fibroblasts.

Isolement des fibroblastes murins

Ce protocole a été réalisé sur des souris conventionnelles (C57Bl/6), transgéniques (Tg338) et KO pour le gène Prnp (Zurich1).

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

145 Une fois l’animal euthanasié (souris âgée de 4 à 6 semaines) par injection intra-péritonéale de pentobarbital, une biopsie de peau d’environ 2 cm2 _{a été réalisée. Pour cela, la zone d’intérêt est} tondue et désinfectée à l’éthanol 70%. Le tissu prélevé a ensuite été placé dans une solution de Bétadine à 0,5%.

L’ensemble des étapes décrites ci-dessous a été réalisé sous hotte afin de garantir un environnement stérile. Une fois le tissu rincé deux fois en PBS, un traitement enzymatique à la collagénase IV (StemCell Technologies, 07909 à 1 mg/mL) a été réalisé pendant 30 min à 37°C. L’explant a ensuite été rincé deux fois en PBS et coupé en plusieurs morceaux (environ 0,5 cm2_{). Les morceaux ainsi} réalisés ont été placés dans une boite de culture en s’assurant que le derme soit dirigé vers le fond de la boite afin de faciliter l’adhésion et la croissance des fibroblastes. Les explants ont été laissés à l’air libre, sous hotte, pendant 10 minutes minimum afin de permettre l’évaporation du surplus de liquide. Une goutte de SVF (correspondant à environ 200 µL) supplémenté en antibiotiques (5% de pénicilline/streptomycine, Sigma, G1146) a été ajoutée directement sur les morceaux d’explant. Ils seront incubés pendant 24 h à 37°C sous une atmosphère contenant 5% de CO2.

Lorsque les explants ont adhéré sur le fond de la boite de culture (environ deux jours après la mise en culture), du milieu a été ajouté en volume suffisant afin de recouvrir l’ensemble de l’explant (2 mL pour une boite de 35 mm). Le milieu de culture composé de DMEM (Gibco), 10% de SVF (ThermoFisher) et 5% de P/S (Sigma, G1146) a été changé tous les trois jours.

Environ 15 jours après la mise en culture, un tapis de fibroblastes est observé autour de l’explant. Ce dernier doit alors être retiré car il devient un frein à la croissance des fibroblastes. Pour cela, la plaque a été rincée deux fois en PBS et l’explant retiré à l’aide de cônes stériles. Les cellules ont ensuite été dissociée à la trypsine (Eurobio, CEZTDA00) afin de récupérer les fibroblastes. L’action de la trypsine a été arrêtée avec un volume équivalent de milieu de culture contenant du sérum. Une étape de centrifugation a ensuite été réalisée pendant 5 minutes à 1200 rpm. Une fois le surnageant retiré, le culot cellulaire a été repris dans du milieu de culture. Une partie des cellules a été amplifiée en vue de réaliser une reprogrammation. Une autre partie a été congelée dans 90% de SVF et 10% DMSO puis conservée à -80°C pendant 24 heures avant d’être placée dans l’azote liquide.

Isolement des cellules de la moelle osseuse de différentes espèces murines

En parallèle, les cellules de la moelle osseuse ont été récupérées en vue de réaliser des reprogrammations grâce au virus de Sendai. Concrètement, trois espèces murines ont été utilisées, des souris : conventionnelles (C57Bl/6), transgéniques (Tg338) et délétées pour le gène Prnp (ZH1). De façon plus précise, une fois l’animal euthanasié, les deux fémurs ont été récupérés et coupées aux extrémités. L’objectif va être d’appliquer une pression à une des deux extrémités à l’aide d’une seringue contenant du milieu de culture stérile. Les cellules de la moelle osseuse sont alors récupérées à l’autre extrémité dans un tube stérile. Une fois centrifugées à 270 g pendant 5 minutes, les cellules ont directement été placées dans une boite de culture. Le milieu de culture, composé de DMEM, 10% SVF et 5% P/S, a été changé tous les trois jours. Les antibiotiques ont été maintenus pendant une semaine puis retiré du milieu de culture. Au bout d’environ 10 jours, les cellules ont été décollées de leur support grâce à l’incubation pendant cinq minutes à 37°C de la trypsine. L’action de cette dernière a été arrêtée par l’ajout de milieu de culture contenant du sérum. Une partie des cellules a préalablement été diluée avant d’être remise en culture.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

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Reprogrammation des fibroblastes murins

Seuls les fibroblastes issus des souris Tg338 ont finalement été reprogrammés grâce au virus de Sendai (CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Thermofisher) exprimant les quatre facteurs de Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 et c-Myc. Les cellules ont été ensemencées la veille dans des puits de plaques 24 puits à raison de 40 000 cellules/ puits de manière à obtenir une confluence de 60% le jour de la transduction.

Le lendemain, la transduction a été réalisée pendant 24 heures à 37°C en doublant les ratios de vecteurs proposés par le fabricant (Tableau 23). Les antibiotiques (P/S) ont été retirés du milieu de culture pour limiter toute interférence avec le virus.

Tableau 23 : Ratio des différents vecteurs préconisé par le fabricant lors de la transduction par le virus de Sendai (Thermofisher, Kit CytoTune Sendai).

Référence (CytoTune Sendai) KOS : Klf4 – Oct3/4 – Sox2 c-Myc Klf4

Multiplicity of infection (MOI) 5 5 3

En parallèle, un autre puits contenant le même nombre de fibroblastes murins a été exposé au virus GFP (Green fluorescent protein, CytoTune Thermofisher, A16519) à titre de contrôle du bon déroulement de l’infection. Ce vecteur codant pour la protéine fluorescente (GFP) permet de vérifier en amont que les fibroblastes pourraient être sensibles à la transduction par le virus de Sendai. Deux jours après, le milieu de culture a été complètement changé. Au bout de six jours, les cellules sont décollées (digestion enzymatique à la trypsine) et passées sur des MEFs inactivés (GlobalStem, GSC-6201G). C’est à ce stade que le facteur de croissance, LIF, a été ajouté (ESGRO-LIF, Millipore, ESG1106). Concrètement, le milieu des cellules murines (iPS 338 et ES C57) est constitué de DMEM, 10% SVF, 1% P/S et 10 ng/ mL de LIF. Au cours de la culture, des colonies de cellules iPS vont se former et seront sélectionnées manuellement chaque semaine.

Caractérisation de la pluripotence des cellules iPS 338

Plusieurs expériences ont été réalisées afin de mettre en évidence le caractère pluripotent des cellules iPS 338 reprogrammées au sein du laboratoire. La première d’entre elles a été d’observer l’aspect des colonies en culture. Les colonies non différenciées et présentant des bords lisses ont été sélectionnées manuellement à chaque passage afin de les maintenir en culture. Le deuxième critère a été de générer des corps embryoïdes (EBs) grâce à la technique présentée ci-dessous24_.

Des tératomes ont également été réalisés en injectant, in vivo, 200 µl de lysat cellulaire dilués de moitié dans du Matrigel® (Corning®, 354248). Pour cette expérience, des souris immunodéficientes, NSG, âgées de moins de 10 semaines ont été utilisées. Brièvement, une fois le surnageant éliminé, le culot cellulaire a été repris dans 100 µl de PBS et dans le même volume de Matrigel® préalablement décongelé pendant 12 heures à 4°C. À l’aide d’une seringue à insuline, la solution cellulaire (lysat cellulaire dilué en Matrigel®) a été injectée délicatement en sous-cutanée au niveau du flanc de l’animal préalablement anesthésié, tondu et désinfecté sur la zone d’intérêt. Jusqu’à son réveil complet, l’animal est surveillé et placé sous lampe chauffante. Environ un mois et demi après, la tumeur est visible.