Caractérisation du modèle cellulaire après exposition prion

Plusieurs arguments peuvent être avancés en faveur de la capacité des organoïdes cérébraux à être sensibles aux souches humaines de prion. Tout d’abord, les cellules iPS d’origine humaines sont théoriquement sensibles aux souches utilisées. De plus, elles présentent un génotype MM au codon 129 tout comme les souches de prion humaines utilisées expérimentalement. L’autre élément crucial est l’expression de la PrPC _{retrouvée à tous les stades du protocole de génération des organoïdes} cérébraux : dans les cellules iPS, dans les EBs en plus faibles quantité, et dans les MBs associés à une augmentation de l’expression proportionnelle à leur différenciation. Enfin, les différentes études réalisées sur les neurosphères soulignent que les cellules peu différenciées et cultivées en 3D sont sensibles à l’infection (Giri et al., 2006 ; Milhavet et al., 2006b ; Herva et al., 2010 ; Iwamaru et al., 2013 ; Relaño-Ginés, Lehmann, et Crozet, 2014). De plus, ces structures neuro-ectodermiques présentent une population cellulaire variée (astrocytes, neurones et oligodendrocytes) mimant la complexité du cerveau et offrant ainsi des interactions cellules-cellules.

Plusieurs stratégies d’exposition à des souches de prions

Notre première stratégie d’infection a reposé sur une exposition chronique des organoïdes humains avec l’ajout de l’infectiosité directement dans le Matrigel (matrice servant de support aux MBs). Grâce aux bioessais, nous avons été en mesure de mettre en évidence une augmentation de l’infectiosité par rapport à la charge initiale d’exposition. En parallèle, les analyses en RT-QuIC ont confirmé que 60 jpe des phénomènes d’agrégation sont retrouvés de façon plus importante que dans les MBs exposés moins longtemps. Ces résultats sont très encourageants et suggèrent que les organoïdes neuro-ectodermiques sont pertinents comme modèle d’infection par des souches de prions. Toutefois, une faible augmentation de l’infectiosité a été retrouvée, ce qui laisse sous- entendre que des optimisations sont nécessaires.

Une seconde stratégie d’exposition dite « aiguë » a été réalisée. Cette fois-ci nous avons exposé les organoïdes à un stade de différenciation plus tardif où le Matrigel n’est plus présent. Ces conditions permettent à l’infectiosité de ne pas être « piégée » dans le Matrigel et de mimer au plus près les modes de contaminations naturels. Cette deuxième stratégie a également été optimisée en exposant les organoïdes en présence de billes de 300 nm (Ademtech). Nous avons émis l’hypothèse que dans la mesure où la PrP anormale est capable de s’adsorber sur les billes, cela pourrait augmenter artificiellement le titre infectieux. De plus, il est possible que les billes puissent induire un noyau de nucléation favorisant l’agrégation des formes infectieuses et ainsi l’infection.

En RT-QuIC, une persistance des phénomènes d’agrégation est observée dans les MBs récoltés 60 jours post-exposition. Ces phénomènes d’agrégation sont diminués par rapport aux MBs exposés à la charge initiale suggérant que cette stratégie d’exposition est moins efficace que l’exposition chronique dans le Matrigel. L’une des explications pourraient être que le temps de mise en contact entre l’infectiosité et les organoïdes est trop court (2 heures), nécessitant donc des adaptations du protocole.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

176 Enfin, une autre stratégie d’exposition a été initiée cette fois-ci directement sur les cellules iPS humaines et murines (iPS 338). Concrètement, ces cellules ont été exposées à différentes souches de prions (MCJ et TAC respectivement) avant de générer des organoïdes. Les premières données reposant sur l’aspect macroscopique soulignent que l’ajout de l’homogénat directement sur les cellules iPS est toxique pour celles-ci, de même que la croissance des EBs est ralentie. En raison de l’extrême sensibilité des cellules iPS aux conditions de culture, une adaptation du protocole est nécessaire pour développer cette nouvelle technique d’exposition.

Différentes perspectives possibles

Différentes perspectives ont rapidement été envisagées, mais face à la difficulté d’obtenir un nombre suffisant d’organoïdes, elles n’ont pu être réalisées.

Concernant la stratégie d’exposition aiguë, différents temps de mise en contact entre l’inoculum et les organoïdes auraient pu être testés. Dans notre étude, l’inoculum a été mis en contact pendant 2 heures avec les organoïdes. Par ailleurs, des tests devront être faits afin de confirmer ou d’invalider l’intérêt des billes dans cette stratégie d’exposition. Plus précisément à partir du même protocole, seules les billes pourraient être mises en contact avec le MB et inversement seul l’homogénat sans les billes. Cela implique que nous disposions d’une technique de détection rapide, autre que l’in vivo s’avérant trop longue et peu envisageable éthiquement car nécessitant un grand nombre d’animaux. Les méthodes d’amplification telle que la RT-QuIC apportent ainsi une solution pertinente. En parallèle, une augmentation de la quantité d’infectiosité pourrait être envisagée permettant une détection potentielle de PrPres _{en WB. On peut également citer des expositions répétées telles que} l’utilisation de milieux conditionnés c’est-à-dire le recyclage de la moitié du milieu de culture afin d’augmenter la charge infectieuse artificiellement. Toutefois, il est important de garder en mémoire que l’intégrité des sphéroïdes doit être conversée.

Il serait également possible de tirer avantage de la technologie des organoïdes cérébraux pour évaluer les effets cytotoxiques d’une exposition à des prions. Nos résultats préliminaires soulignent une augmentation des cellules apoptotiques (technique TUNEL) dans les MBs exposés par rapport aux MBs contrôles. Ces résultats devront être confirmés avec d’autres techniques et sur l’ensemble des MBs exposés (différents jpe, stratégie d’exposition aiguë). De plus, il est important d’aller plus loin et de déterminer quel type cellulaire est impliqué dans la mort cellulaire (neurones, astrocytes, ou cellules indifférenciées). En effet, une fois que les techniques IHC de détection de la PrP anormale seront optimisés, il serait pertinent de déterminer où cette dernière s’accumule (région exprimant des marqueurs particuliers) et dans quel type cellulaire.

Les cellules iPS offrent la possibilité de pouvoir travailler in vitro sur des modèles cellulaires humains à partir de cellules somatiques de patient. À ce jour, une seule équipe a généré des cellules iPS provenant d’un patient atteint de GSS (Matamoros-Angles et al., 2017). Aucune accumulation anormale de PrP n’a été retrouvée ni de PrPres _{néoformée suite à l’exposition de souches de prions} murines et humaines. Il est possible que ces cellules iPS humaines soient plus sensibles à une exposition prion sous forme d’organoïdes cérébraux dans nos conditions de culture.

Très récemment, une équipe a obtenu des résultats prometteurs grâce à la différenciation en astrocytes de cellules iPS humaines (Krejciova et al., 2017). Après différents passages, un maintien de la PrPres _{a été observé dans ces astrocytes humains exposé à l’agent de la vMCJ.}

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

177 Cette étude souligne le potentiel important que représente les cellules iPS dans la modélisation des maladies à prions et à plus large échelle des maladies neurodégénératives.

Pour la première fois, il a été mis au point un modèle cellulaire utilisant des astrocytes humains sensibles à une souche de prions humaines. L’implication des astrocytes dans les maladies à prions avaient déjà été soulignée dans les neurosphères (Iwamaru et al., 2013) et dans d’autres modèles in

vitro (Aguzzi et Liu, 2017). Dans des expériences futures, nous souhaiterions également déterminer de façon plus précise quel type cellulaire est responsable de la propagation de l’agent dans les organoïdes humains exposés à une souche sporadique de MCJ.