Exposition aiguë des organoïdes neuroectodermiques

Une fois les organoïdes humains, simiens et murins générés et caractérisés, nous avons mis en place une stratégie d’infection (Figure 65) différente de celle utilisée précédemment.

Cette nouvelle stratégie a été optimisée en utilisant des organoïdes présentant une différenciation plus tardive conduisant à l’élimination complète de la capsule de Matrigel. En effet, il a été mis en évidence qu’au fil de la culture, le Matrigel s’éliminait (en moyenne 30 jours post-encapsulation en Matrigel). L’objectif est de permettre à l’infectiosité ajoutée une meilleure pénétration dans les sphéroïdes et qu’elle ne soit pas « stoppée » ou « piégée » dans le Matrigel.

La seconde optimisation repose sur l’introduction des billes d’un diamètre de 300 nm (Ademtech Carboxyl-Adembeads, 0213). Notre hypothèse est que ces billes puissent accélérer le processus anormal de réplication de la PrP par phénomène de seeding (E. Sanfins).

Figure 65 : Protocole d’exposition aiguë des organoïdes humains, murins et simiens.

A) Exposition des mini-brains (MBs) directement dans le milieu de culture 30 jours après la mise en Matrigel. Les MBs exposés sont récoltés pour analyses 1/30/60 jours post-exposition (JPE). B) Les billes Ademtech (Ademtech Carboxyl- Adembeads) sont préalablement décoatées puis mise en contact avec l’agent infectieux. L’ensemble de cette solution (homogénat infectieux et billes) est exposé sur les MBs pendant 2h à 37°C.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

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Organoïdes cérébraux humains

La première étape a consisté à vérifier la capacité des billes à pénétrer dans les MBs (Figure 66). Ces optimisations réalisées sur les MBs humains, nous ont permis de déterminer la quantité de billes suffisante pour entrer dans les MBs sans ralentir la croissance de ces derniers (condition B).

Figure 66 : Coloration Perls sur les Mini-brains exposés à deux concentrations de billes Ademtech.

Avec la condition B, la quantité de billes initialement ajoutée est suffisante pour être détectée un jour post-exposition ainsi que quatre jours post-exposition (coloration bleue, matérialisée par un triangle noir). Les barres d’échelles représentent 50 µm.

Un total de 54 MBs humains a été inclus dans cette étude (Tableau 28). Contrairement à la première stratégie d’exposition (chronique), ces MBs n’ont pas été inoculés à l’animal de laboratoire et le titre infectieux n’a donc pas été calculé. Les données en RT-QuIC soulignent des phénomènes d’agrégations anormaux dans les MBs exposés non retrouvés dans les MBs exposés à des homogénats sains et non exposés (Figure 67).

Tableau 28 : Nombre total de Mini-brains humains exposés directement dans le milieu de culture (exposition aiguë) à différentes souches de prion.

JPE Témoin négatif sMCJ vMCJ

1 6 6 6

30 6 6 6

60 6 6 6

vMCJ : variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, sMCJ : forme sporadique de la MCJ

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

169 Figure 67 : Conversion de la protéine prion recombinante par les mini-brains humains exposés à une souche sporadique directement dans le milieu de culture en RT-QuIC.

Ces résultats ont été obtenus en collaboration avec le Docteur Etienne Levavasseur (ICM, Paris). Une fois les MBs humains exposés à une souche sporadique dans le milieu de culture, ils ont été récoltés 1 (correspondant à la charge initiale), 30 et 60 jours post exposition (jpe). Deux mini-brains par conditions ont été testés et des triplicats ont été réalisés par cycle d’amplification.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

170 Les données obtenues en RT-QuIC sur les MBs humains exposés directement dans le milieu de culture (aiguë) soulignent une amplification efficace de la souche sporadique de la MCJ dans les trois conditions testées (1, 30 et 60 jpe) (Figure 67). La comparaison de ces trois graphiques suggère des phénomènes d’agrégation plus important dans les MBs exposés pendant 1 jour (phase exponentielle à 16h) par rapport aux deux autres conditions. Cette diminution suggère une élimination de la PrP anormale initialement ajouté (1 jpe) au cours de la différentiation des MBs. Ainsi, cette stratégie ne semble pas être efficace mais une persistance de l’amplification de la souche sporadique MCJ est retrouvée 60 jpe.

Organoïdes murins

Comme décrit précédemment, le modèle d’infection des MBs humains est encore à optimiser afin de valider que l’augmentation du titre infectieux décrite dans les souris Tg650 inoculées avec les MBs humains (stratégie chronique) (Figure 54) est liée à une PrP de novo et non résiduelle. Pour déterminer à quel moment la PrP anormale initialement ajoutée s’élimine, notre perspective était de générer des MBs PrPKo. Toutefois, nous n’avons pas été en mesure de reprogrammer ces cellules (Figure 59).

Notre deuxième stratégie a consisté à utiliser des cellules murines connues pour répliquer plus facilement la PrP in vitro. Des organoïdes murins à partir de cellules souches embryonnaires issues de souris C57Bl/6 (notés MBC57) et de cellules iPS issues de souris Tg338 (notés MB338) ont été générés et exposés à deux souches de tremblante (Tableau 29). Ces deux modèles cellulaires murins ont été exposés à une souche de tremblante expérimentale (TAC), à laquelle les souris Tg338 sont sensibles mais pas les souris C57Bl/6 (Figure 68). Nous avons émis l’hypothèse que le même phénomène de susceptibilité puisse être retrouvé in vitro.

Tableau 29 : Nombre d’organoïdes murins exposés directement dans le milieu de culture (exposition aiguë) à différentes souches de prion adaptées à la souris.

À l’instar des expériences in vivo réalisées avec les MBs humains exposés, nous avons déterminé si les organoïdes murins étaient en mesure de répliquer l’infectiosité. Seuls les MB338 et MBC57 exposés à la souche de tremblante ont été inoculés par voie IC à des souris Tg338 (Figure 68).

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

171 Nos données suggèrent que l’infectiosité est maintenue dans le modèle MB338 et diminue dans les MBC57. Ainsi, ces résultats vont dans le sens de la validation du modèle MB comme modèle d’infection in vitro par des souches de prion (Figure 68). En parallèle, des optimisations sont en cours afin d’amplifier la PrP anormale directement dans les organoïdes murins exposés en RT-QuIC.

Figure 68 : Organoïdes murins exposés de façon aiguë à une souche de tremblante adaptée.

A) Image microscopique d’un organoïde murin issu des cellules souches iPS338 (MB338). B) Immunomarquage des cellules neurales (anticorps anti-Tuj1). C) Titre infectieux dans les souris Tg338 exposés soit aux organoïdes neuro-ectodermiques issus des cellules ESC57 (MB C57, rouge) iPS338 (MB338 en bleu). Les barres d’échelle correspondent à 100 µm (A) et 50 µm (B).

Organoïdes simiens

Les organoïdes simiens ont été exposés à deux isolats infectieux (sporadique et vMCJ) ainsi qu’à un homogénat provenant d’un macaque sain (Tableau 30). Pour l’heure, la recherche de la réplication anormale n’a pas été concluante en WB, IHC ni même en RT-QuIC.

Tableau 30 : Exposition des organoïdes issus des cellules souches pluripotentes simiennes.

Nombre d’organoïdes neuro-ectodermiques issus de cellules souches pluripotentes induites simiennes exposés avec la stratégie aiguë.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

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