Exposition chronique des organoïdes cérébraux humains : validation des MBs comme modèle

Ces résultats ont été pour partie présentés sous forme de poster au congrès Young Researchers in Life Science, YRLS (Paris, mai 2017) et un article est en cours de préparation.

Exposition à une souche sporadique de la maladie de Creutzfeldt-Jakob

La première stratégie d’exposition a reposé sur une mise en contact chronique des MBs avec un échantillon infectieux afin de valider la pertinence de ce modèle dans l’étude des maladies à prions. Pour cela, un homogénat cérébral infectieux (souche sporadique de MCJ) a été mélangé dans le Matrigel servant de support à la culture en 3D des MBs. L’idée sous-jacente était de restreindre l’infectiosité au Matrigel qui est en contact permanent avec le MB dans les premiers stades de culture.

Dans la mesure où notre objectif a été de conserver cette organisation spatiale en 3D, proche du cerveau humain, nous avons été dans l’impossibilité technique de « passer » les cellules après exposition et donc d’éliminer la charge infectieuse résiduelle. Pour pallier à cela, une cinétique a été réalisée en récoltant les MBs à différents temps post-exposition (1, 30, 60 et 90 jpe).

Nous avons cherché à déterminer si l’infectiosité initialement ajoutée avait perdurée dans les MBs. Pour cela, un bioessai a été effectué en inoculant les MBs exposés à des souris transgéniques permissives aux souches sporadiques de MCJ. Les MBs humains récoltés différents temps post- exposition ont été injectés en IC à des souris transgéniques, Tg650, sur-exprimant la PrPC _humaine. Au total deux MBs exposés au même inoculum et récoltés aux mêmes temps post-exposition ont été dilués (au total trois dilutions successives dans une solution de glucose) afin de déterminer le titre infectieux. Nos résultats mettent en avant une diminution de la durée de survie des souris ayant été inoculées avec les MBs exposés pendant 60 jours par rapport à celles ayant reçu des MBs exposés pendant moins longtemps (Figure 54A).

Sur la base de la présence de PrPres _{dans le cerveau de ces souris, mise en évidence par technique} ELISA, les taux de transmission ont été calculés pour chaque groupe, permettant ainsi d’estimer le titre infectieux des MBs exposés. Nous observons une augmentation du titre infectieux des MBs récoltés 60 jours post-exposition par rapport à celui des MBs exposés pendant 1 jour (correspondant à la charge initiale) (Figure 54B). Ces résultats suggèrent ainsi une génération de novo de PrPres _suite à l’exposition chronique à un isolat de souche sporadique de MCJ et permettent de valider la pertinence du modèle MB comme modèle in vitro d’infection prion.

Cette étude in vivo a été confirmée in vitro en utilisant un modèle d’amplification, la RT-QuIC qui offre l’avantage d’amplifier efficacement les souches sporadiques de MCJ. Grâce à cette technique réalisée en collaboration avec le Docteur Etienne Levavasseur (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Paris), des phénomènes d’agrégation dans les MBs humains exposés ont été observés non retrouvés dans les MBs contrôles (Figure 55). De plus, une agrégation plus importante dans les MBs exposés pendant 60 jours est observée par rapport à celle décrite dans les MBs récoltés à 1 et 30 jpe (Figure 55).

Ainsi, cette large étude nous a permis de souligner une augmentation de la charge infectieuse dans les MBs exposés pendant 60 jours par rapport aux temps plus précoces.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

159 Figure 54 : Évolution de l’infectiosité contenue dans les MBs humains exposés de façon chronique à un isolat infectieux.

Les mini-brains (MB) ont été exposés à un homogénat cérébral de macaque infecté par une souche sporadique de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (sMCJ). A) Courbe de survie des souris humanisées Tg650 (surexprimant la PrPC _humaine)

inoculées avec des MBs dilués 100 fois (analyse en Kaplan Meier). B) Analyse des titres infectieux des MBs exposés (à un isolat de sMCJ) grâce à la méthode de Reed et Muench.

Figure 55 : Conversion de la protéine prion recombinante par les mini-brains en RT-QuIC.

Ces résultats ont été obtenus en collaboration avec le Dr Etienne Levavasseur (ICM, Paris). Une fois les MBs exposés à une souche sporadique (bleu), ils ont été récoltés 30 (MB30, jaune) et 60 (MB60, rouge) jours post exposition. Un mini-brain exposé pendant 60 jours à un homogénat sain (MB T60, en violet) a été analysé et ne présentait aucun phénomène anormal d’agrégation. UFR : unité de fluorescence relative.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

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Exposition à une souche de variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob

En parallèle des MBs humains exposés de façon chronique avec une souche sporadique de MCJ, 20 MBs humains ont été exposés avec une souche de vMCJ (Tableau 27). La moitié d’entre eux a été fixée en formol pour analyses IHC et l’autre moitié a été congelée pour analyses en WB. Aucun de ces MBs exposés à des souches vMCJ n’a été inoculé à des souris, afin de limiter le nombre d’animaux, avant d’avoir validé à l’aide d’autres techniques la présence de PrP anormale dans cette condition. Tableau 27 : Nombre de mini-brains humains exposés de façon chronique dans le Matrigel.

JPE Témoin négatif sMCJ vMCJ

1 4 3 3 3 2 1 1 7 2 1 1 20 4 4 4 30 4 4 4 60 4 4 4 90 4 3 3

sMCJ : maladie de Creutzfeldt-Jakob forme sporadique – vMCJ : variante de la MCJ. Détection de la PrP anormale en IHC et techniques biochimiques

En plus des analyses des MBs exposés à une souche sporadique (bioessai et RT-QuIC), des immunomarquages ont été réalisés sur les MBs humains exposés de façon chronique (sMCJ et vMCJ) (Figure 56). Cette technique réalisée, à l’aide de deux anticorps anti-PrP à savoir Sha 31 (PrPC _{145 -} 152) et Saf32 (59 - 89), n’a pas été concluante car nous n’avons pas trouvé de conditions expérimentales nous permettant d’obtenir un marquage différentiel entre la PrPC _{et la PrP anormale.} Des analyses biochimiques en WBs et en dot blot ont été effectuées en récoltant les MBs directement sous forme de culot cellulaire. Dans ces conditions, aucune PrPres _{néoformée n’a été} observée (Figure 57). La dose de PK nécessaire pour éliminer la présence de PrPC _{endogène des MBs} a été déterminée, mais celle-ci a également conduit à l’élimination de la PrP anormale. Ces résultats in vitro suggèrent ainsi que l’infectiosité néoformée dans ces MBs n’est pas associée à des formes agrégées de PrP anormale résistantes à la protéolyse.

Figure 56 : Absence de distinction entre la PrPC _{endogène des organoïdes humains et la PrP anormale initialement}

ajoutée ou potentiellement néoformée.

A) Mini brain non exposé (30 jours post-encapsulation en Matrigel ; barre d’échelle correspond à 250 µm). Mini-brains exposés chroniquement (encapsulation de l’infectiosité dans le Matrigel) à un homogénat sain pendant 1 jour (B ; 75 µm) et 30 jours (C ; 200 µm). Mini-brains exposés chroniquement à une souche de prion sporadique pendant 1 jour (D ; 100 µm) et 30 jours (E ; 25 µm) et pendant 30 jours à une souche vMCJ (F ; 25 µm). Immunomarquages avec l’anticorps anti-Sha31.

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

161 Figure 57 : Détection de la PrPres _{dans les organoïdes cérébraux humains exposés.}

A) Inocula issus d’un macaque sain et exposé à un isolat d’une souche sporadique de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (sMCJ, B) en fonction de différentes doses de protéinase K (PK). La valeur 1 correspond à 0,3 µg/ ml. B) Mini-brains (MBs) humains exposés à des inocula sains (B) et infectieux (C).

Étude préliminaire de la cytotoxicité

Nous avons également déterminé si le modèle MB pouvait permettre d’évaluer les effets cytotoxiques suite à l’exposition à des souches humaines de prions grâce à la technique TUNEL (Figure 58). Bien que quelques cellules en apoptose soient observées dans les MBs témoins (moins de 10%, Figure 58C), un nombre plus important est observé dans les MBs exposés (vMCJ et sMCJ de façon équivalente). Ce travail devra être étendu à d’autres MBs exposés pendant des durées plus longues (notamment pendant 60 jours) et d’autres techniques devront être réalisées (caspase 3 clivée, annexine V, dégradation de l’ADN en échelle…).

Figure 58 : Augmentation du pourcentage des cellules apoptotiques dans les mini-brains humains exposés à des souches de prions humaines.

Immunodétection par fluorescence des cellules apoptotiques (vert) et des noyaux (DAPI, bleu) grâce à la technique TUNEL dans un mini- brain témoin (non exposé, A) et exposé à une souche sporadique de maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ, B). C) Ratio de cellules apoptotiques dans les mini brains exposés pendant différents temps (n = 2 par condition).

Mise en place d’un modèle organoïde d’infection en 3D (étude B)

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