Passages secondaires : inoculations des homogénats des souris NSG exposées à des souris

Ainsi, il a été mis en évidence que les souris NSG sont sensibles aux souches myélopathiques et développent des phénotypes atypiques caractérisés par une absence de PrPres _{et la présence de} spongiose dans la moelle épinière (formes spinales). En effet, les données présentées dans l’article (Rontard et al., 2017 : en préparation) soulignent que les souches myélopathiques sont capables de transmettre un phénotype atypique indépendamment d’un système immunitaire fonctionnel.

Pour aller plus loin dans la compréhension des modes de transmission périphérique et la caractérisation de ces profils atypiques, des passages secondaires ont été réalisés. Différents homogénats (cérébraux, spinaux et spléniques) issus des souris NSG exposées ont été retransmis au même modèle immuno-déficient (souris NSG à souris NSG) et à des souris immunocompétentes (souris NSG à souris Swiss) (Figure 35).

Figure 35 : Mode opératoire schématique des (re) transmissions in vivo.

4.1

Matériels et méthodes

Le même protocole d’inoculation par voies IC et IV que celui présenté dans l’article (Rontard et al., 2017) a été utilisé. Les souris NSG et Swiss ont été inoculées avec différents homogénats issus de souris NSG préalablement exposées à des primates vMCJ et myélopathiques. Afin d’éviter toute confusion, les souris NSG exposées initialement (au cours du premier passage) seront qualifiées de « donneuses » dans la suite de cette étude.

Préparation des échantillons

L’ensemble des échantillons (cerveau, moelle épinière et rate) a été prélevé lors de l’autopsie des souris NSG (donneuses). Les cerveaux ont été homogénéisés à 20% poids/ volume (p/v) dans une solution de glucose 5% et dilués extemporanément lors de l’inoculation. La moelle épinière et la rate ont été homogénéisées à 10% p/v dans une solution de glucose 5% et diluées lors de l’inoculation.

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

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Inoculations intracérébrales et intraveineuses

Au total 60 souris NSG (élevage interne) âgées en moyenne de 6 à 10 semaines ont été inoculées par voie IC. Les souris Swiss (Janvier) âgées en moyenne de 12 semaines ont été exposées par voies IC (n = 125 souris) et IV (n = 65 souris). Afin de limiter le nombre d’animaux, les souris Swiss contrôles exposées à des homogénats sains ont été inoculées en IC et en IV de façon simultanée.

4.2 Résultats

Transmissions secondaires au modèle immunodéficient

Un total de sept homogénats (trois cerveaux et quatre moelles épinières) distincts provenant des souris NSG donneuses a été inoculé à des souris NSG par voie IC (Figure 36). L’objectif est de réaliser une adaptation de souche en mettant en évidence une éventuelle PrPres_.

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Figure 36 : Passages secondaires de souris immunodéficientes (NSG donneuses) à NSG.

A) Plan expérimental des inoculations à des souris NSG par voie intracérébrale à des homogénats cérébraux (cv : cerveau) et médullaires (me : moelle épinière). Ces derniers ont été prélevés à partir de souris NSG donneuses (vMCJ, atypiques ou saines). B) Nombre de condition inoculée aux souris NSG.

À titre de contrôle négatif, 10 souris ont été exposés à un homogénat cérébral (n=5) et spinal (n=5) provenant de souris donneuses initialement inoculées avec du cerveau de macaque sain (Figure 34). Lors de l’analyse post-mortem, ces dernières (dites donneuses) n’avaient aucune PrPres _{détectable en} ELISA. Elles ne présentaient pas de PrP anormale, ni de gliose en IHC ni même de spongiose lors du scoring sur la coloration des coupes cérébrales et spinales en HE.

En parallèle, cinq souris donneuses ont été sélectionnées suite au développement d’un phénotype atypique (spongiose dans la moelle épinière) après une exposition de souches myélopathiques. Le cerveau et/ ou la moelle épinière de ces dernières ont été ré-inoculées à 50 souris NSG (Figure 36).

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

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Transmissions secondaires au modèle immunocompétent

Concernant les retransmissions des souris NSG (donneuses) aux souris Swiss, un total de 190 souris a été exposé (Figure 37).

Figure 37 : Passages secondaires de souris immunodéficientes (NSG donneuses) à Swiss.

A) Schématisation expérimentale des souris Swiss exposées par voies intracérébrale (IC) et intraveineuse (IV) à des homogénats cérébraux (cv : cerveau), spinaux (me : moelle épinière) et spléniques (R : rate). Ces derniers ont été prélevés à partir de souris NSG, dites donneuses, présentant des atteintes de type vMCJ, atypiques ou saines. Les étoiles rouges (*) matérialisent les souris mortes et analysées à ce jour. B) Nombre de condition inoculée aux souris Swiss.

Les inoculations des souris NSG donneuses aux souris Swiss présentent deux différences majeures par rapport à celles réalisées aux souris NSG.

La première repose sur l’exposition d’une partie des souris par voie périphérique. L’objectif est de déterminer si les phénotypes atypiques observés chez les souris NSG donneuses sont transmissibles à un modèle murin conventionnel, comme cela a été décrit précédemment (Comoy et al., 2017). La seconde différence est l’inoculation d’homogénats spléniques. Lors du premier passage, ces rates ne présentaient aucun marquage de PrP anormale en IHC ni même de PrPres _{en ELISA. Nous} cherchons ainsi à confirmer ou infirmer si la rate, est le siège de la réplication périphérique pour les souches myélopathiques, comme cela est décrit dans les formes « classiques » de maladie à prion. En effet, une PrP anormale peut être présente en faible quantité dans la rate des souris immunodéficientes NSG, mais au vu de leur phénotype celle-ci n’ait pas pu conduire à une réplication périphérique détectable.

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

126 Deux autres hypothèses sont également envisageables : (i) implication d’un autre organe, non identifié à ce jour, comme support de la réplication périphérique ou encore (ii) une neuroinvasion directe et donc indépendante des organes périphériques.

Bilan de cette expérience à 300 jpe

A la date du 17/11/2017, les souris NSG et Swiss sont encore en cours d’incubation (moins de 300 jours post-exposition). Les résultats seront analysés ultérieurement et ne seront donc pas détaillés dans ce manuscrit. Notons que les souris mortes moins de 100 jpe ne sont pas prises en compte pour l’analyse finale des résultats car cette période d’incubation est trop courte pour le développement de ces phénotypes atypiques : ces animaux ne présentaient pas de signe clinique, ni de lésion notable à l’examen pathologique et la recherche en ELISA de PrPres _{s’est avérée négative.} À ce stade, la seule mortalité observée concerne les souris Swiss inoculées par voies IC ou IV avec un homogénat cérébral provenant d’une souris NSG donneuse vMCJ, elle-même inoculée avec une souche de vMCJ (homogénat cérébral par voie IC) (Figure 37 : étoiles rouges).

Les souris Swiss inoculées par voie IC, mortes à 190 jpe ± 10, présentent l’ensemble des caractéristiques des maladies à prions (signe clinique, gliose, spongiose et accumulation de PrPres₎ (Figure 38).

En ce qui concerne les souris Swiss inoculées par voie IV (270 jpe ± 20), elles présentent des périodes d’incubation attendues et correspondant à celles observées lors du phénomène d’adaptation de souche.

Figure 38 : Triade lésionnelle chez une souris Swiss inoculée par voie intraveineuse avec de l’homogénat cérébral de souris NSG exposée à un homogénat infectieux de macaque vMCJ.

A) Accumulation splénique anormale de PrP (Saf32). B) Spongiose cérébrale (Hématoxyline-éosine). C) Gliose cérébrale (GFAP). D) Accumulation cérébrale anormale de PrP (Sha31). Les barres d’échelle correspondent à 50 µm pour l’image (A) et 200 µm pour les images (B – D).

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

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