Étude descriptive des structures spléniques de plusieurs espèces

Après une exposition par voie IV, les macaques vMCJ présentent une réplication dans les organes lymphoïdes périphériques centrée sur les follicules lymphoïdes. À l’inverse ces structures ne présentent aucune accumulation détectable chez les macaques myélopathiques avec les techniques classiques (Figure 39).

De façon simultanée aux inoculations in vivo présentées précédemment, des optimisations de nos protocoles IHC de détection des isoformes anormaux de la PrP ont été effectuées au sein du laboratoire. Ces derniers montrent chez les macaques transfusés vMCJ une accumulation ectopique de la PrP anormale dans le parenchyme splénique (plus précisément autour des vaisseaux, périvasculaires, PV Figure 39) en parallèle de celle classiquement retrouvée dans les structures immunitaires. Ce marquage est également observé chez les patients humains vMCJ. Concernant les macaques transfusés développant une myélopathie, seul le marquage ectopique est présent (Figure 39B).

Figure 39 : Accumulation anormale de PrP dans la rate des macaques transfusés.

Immunodétection de la protéine prion anormale grâce à l’anticorps anti-Sha31 chez A) un macaque atteint d’une forme classique de maladie à prion et B) un macaque atteint d’un syndrome myélopathique. C) Absence de marquage chez un macaque sain. Foll : follicule (structure immunitaire). PV : périvasculaire (structure non immunitaire). Les barres d’échelle représentent 200 µm.

Cette dernière partie a consisté en l’analyse de rates de plusieurs espèces (primates, ruminants et rongeurs) dont les principales structures anatomiques sont présentées dans la figure 40.

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

128 L’objectif est double : (i) caractériser les structures présentant un marquage ectopique de PrP anormale et (ii) mettre en évidence des différences anatomiques entre les espèces pouvant expliquer l’expression différentiel des souches en fonction des modèles.

Figure 40 : Principales structures anatomiques de la rate.

La rate est composée de deux structures distinctes : la pulpe blanche regroupant les manchons péri-artériolaires (vx) et les centres germinatifs (CG) et la pulpe rouge constituée de sang (larges vaisseaux, sinusoïdes veineux). La rate est délimitée aux extrémités par une capsule splénique d’où partent les trabécules (encore appelées travées) constituées de vaisseaux. Coloration Hématoxyline-éosine d’une coupe transversale de rate de souris conventionnelle, modèle Swiss.

5.1 Matériels et méthodes

Le même protocole présenté page 117 a été appliqué aux rates de différentes espèces. Les anticorps utilisés sont présentés dans le tableau 20. Les anticorps primaires sont incubés pendant 1 heure à température ambiante. En amont du démasquage antigénique, l’activité des péroxydases a été bloquée. Pour cela, les lames ont été incubées pendant 20 minutes en H202 (Merck, K45302609418), puis rincées trois fois en eau distillée avant incubation de l’anticorps primaire. L’ensemble des étapes suivantes est identique au protocole détaillé précédemment.

Tableau 20 : Liste des anticorps utilisés par la caractérisation des rates. Nom de l’anticorps

(espèce reconnue) Épitope reconnu

Fournisseur

(Référence) Concentration Bin-1 (lapin) Bridging Integrator 1 Abcam (ab27796) 1/500 CD271 (lapin) Récepteur anti-p75 (facteur

de croissance nerveuse) Abcam (AB52987) 1/200 Podoplanine

(souris) Cellules stromales

BioLegen

(127407) 1/200

Sha31 (souris) PrPC _{(145-152) Spibio (A03213) 1/5000}

Saf32 PrPC _{(59-89) Spibio (A03202) 1/5000}

SMA (souris) Actine des muscles lisses Dako (M0851) 1/1000

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

129

Coloration à l’orcéine modifiée

Cette technique de coloration permet de visualiser les fibres et les lames élastiques. De façon plus précise, l’orcéine est un colorant faible capable de se fixer avec une grande électivité (c’est-à-dire de manière non spécifique) sur les fibres élastiques. Après déparaffinage, les coupes histologiques sont incubées de 30 minutes à 24 heures dans la solution d’orcéine. Différents protocoles ont été utilisés (orcéine chlorhydrique, nitrique et modifiée) et des optimisations ont été réalisées sur les temps d’incubation (Tableau 21).

La solution d’orcéine est constituée d’orcéine (Merck, 10710000025), d’acide chlorhydrique (HCl, Normapur Prolabo) et d’éthanol à 70% (Tableau 21). Cette solution est portée à ébullition afin de dissoudre l’orcéine. Elle peut être conservée plusieurs mois à température ambiante. Concernant le protocole d’orcéine nitrique, l’HCl est remplacé par de l’acide nitrique (Normapur Prolabo). Les coupes sont ensuite rincées abondamment à l’eau courante avant d’être déshydratées et montées entre lames et lamelles. En microscopie, les fibres élastiques sont de couleur rouge violacé à brun noir.

Tableau 21 : Présentation des différents protocoles d’orcéine.

Nom du protocole Composition de la solution d’orcéine1

Temps d’incubation optimisé (heures)

Orcéine chlorhydrique 0.6 ml d’HCl concentré 4h

Orcéine nitrique 2 ml d’acide nitrique 1h

Orcéine modifiée 1ml d’HCl concentré/ pH ajusté à 1,2 2h30

1_{Les solutions d’orcéine présentées, quel que soit le protocole, sont présentées pour}

1 gramme d’orcéine, dans un volume final de 100 ml dans de l’éthanol à 70%.

Le protocole d’orcéine modifiée permet de mettre en évidence la présence d’inclusion cytoplasmique après oxydation par le permanganate de potassium en milieu acide. Les protéines soufrées oxydées en sulfonate réagissent avec l’orcéine. Les coupes sont incubées pendant cinq minutes en permanganate de potassium sulfurique (pour un volume final de 100 ml d’eau distillée, 1,5 g de permanganate de potassium et 1,5 ml d’acide sulfurique sont ajoutés). Les lames sont rincées abondamment à l’eau courante puis rapidement blanchies (moins d’une minute) dans une solution d’acide oxalique à 1% préalablement filtrée (10 g d’acide oxalique dans 1 L d’eau distillée). Les lames sont ensuite incubées dans la solution d’orcéine (dont le pH est ajusté à 1,2 grâce à l’ajout de soude) et rincées à l’eau courante avant d’être déshydratées. En microscopie, les fibres sont de couleur rouge violacées et le fond est brun clair.

5.2 Résultats

Caractérisation de la structure périvasculaire chez les macaques transfusés

Nos mises au point de la coloration à l’orcéine nous ont permis de déterminer des temps d’incubation optimaux selon le protocole à savoir quatre heures pour l’orcéine chlorhydrique (ou classique), une heure pour l’orcéine nitrique et deux heures et demie pour l’orcéine modifiée (Tableau 21). Ces trois protocoles permettent de visualiser les mêmes structures. Toutefois, le protocole de l’orcéine modifiée permet d’obtenir un meilleur contraste entre le fond et les fibres élastiques, et a donc été appliqué à l’ensemble des caractérisations spléniques (Figure 41). De la même façon, différentes optimisations ont été réalisées afin d’obtenir des marquages satisfaisants avec les anticorps anti-CD271 et podoplanine (résultats des optimisations non montrés).

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

130 Figure 41 : Caractérisation des structures spléniques périvasculaires par coloration à l’orcéine chez un macaque sain. L’analyse des rates de macaques vMCJ met en évidence une accumulation de PrP anormale en périvasculaire (Figure 39). Nos résultats soulignent que l’orcéine (Figure 42C) et le marqueur SMA (Figure 42B) marquent cette structure d’intérêt (Figure 42). En parallèle, il a été mis en évidence que cette structure n’était pas constituée de cellules immunitaires : absence de lymphocytes B et T (résultats non montrés). De même, cette structure n’est pas caractérisée par l’implication de cellules mésenchymateuses nouvellement décrites par l’équipe de Steiniger (CD271, Figure 42D) (Steiniger et

al., 2014) ni marquée par l’anticorps Bin-1 spécifiques des filaments d’actine (Figure 42E) ni spécifique des protéines du système lymphatique (Figure 42F).

Figure 42 : Immunomarquage de la région périvasculaire chez un macaque vMCJ.

A) Accumulation anormale de protéine prion autour des vaisseaux sanguins (Vx) en périvasculaire (PV) matérialisée par des flèches noires (marquage marron). B) Les muscles de l’actine lisses (anticorps anti-SMA) révèlent cette structure périvasculaire. C) La coloration à l’orcéine modifiée met en évidence les fibres élastiques dans cette structure d’intérêt. D) Absence de marquage de la zone d’intérêt par les anticorps anti-CD271 (cellules stromales), anti-Bin-1 (E) et anti- podoplanine (F). Les barres d’échelle représentent 200 µm.

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

131

Description de structures spléniques dans différentes espèces

Dans un second temps, nous avons comparé différentes espèces à l’aide de ces deux marqueurs (Figure 43 ; 44). Cette analyse a été initiée sur des rates provenant de :

- Primates : babouin, Homme, Macaque, microcèbe ; - Ruminants : brebis, bovin, chèvre ;

- Rongeur : hamster, souris.

Figure 43 : Caractérisation des structures spléniques périvasculaires grâce à la coloration à l’orcéine.

Colorations à l’orcéine modifiée chez A) l’Homme, B) le macaque cynomolgus C) la souris conventionnelle, C57Bl/6 D) le veau. Les barres d’échelle correspondent à 50 µm (A – C) et 100 µm pour l’image (D).

Figure 44: Immunodétection des muscles lisses de l’actine en périvasculaire.

Immunomarquages de la rate chez A) l’Homme, B) le macaque cynomolgus C) la souris et D) la chèvre (Anticorps anti-SMA). Les barres d’échelles représentent 100 µm.

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

132 Grâce à ces deux marqueurs et à l’analyse morphologique en HE une série de différences anatomiques a été mise en évidence. Concrètement, trois structures spléniques ont été observées : la capsule, la pulpe rouge (notamment les trabécules ou travées) et la pulpe blanche (particulièrement les follicules) (Figure 39).

En résumé, les souris tout comme le hamster et l’Homme présentent une capsule peu épaisse en comparaison des primates (babouin, macaque et microcèbe). Ils possèdent également peu de fibres élastiques.

Les souris ont beaucoup de follicules par rapport à la proportion de la pulpe rouge. Inversement les ruminants (chèvre, brebis et vache) ont peu de follicules (proportion de la pulpe blanche faible) et une capsule épaisse.

L’aspect anatomique de la rate du babouin est très différent de celui du macaque. Le babouin à peu de fibres élastiques et la pulpe rouge est très structurée. Le microcèbe, intermédiaire entre le babouin et le macaque, a une capsule épaisse et peu de fibres musculaires autour des vaisseaux. Les primates ont plus de structures lymphoïdes que les ruminants.

La structure anatomique de la rate humaine est proche de celle du macaque à l’exception des structures trabéculaires qui sont très importantes chez l’Homme par rapport aux autres espèces. Ces données reposent sur des analyses morphologiques préliminaires, mais elles soulignent toutefois des dissimilitudes anatomiques entre les espèces pouvant être à l’origine de fonctions physiologiques et de mécanismes de réplication périphérique de l’agent différents.

Évaluation descriptive de la réplication périphérique (étude A)

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