SYSTEME HETEROLOGUE
B. Purification des protéines HMA1 et PAA
La purification de HMA1 et de PAA1 a été réalisée avec une matrice d'affinité (Strep-tactin) qui reconnaît l’étiquette Strep-tag II placée en C-terminal de ces protéines recombinantes. L'utilisation de la desthiobiotine (un analogue de la biotine) permet d'éluer les protéines fixées sur la matrice d'affinité. La purification de HMA1 et de PAA1 a nécessité une mise au point importante afin d’obtenir des fractions fortement enrichies pour l’une ou l’autre de ces protéines (Figure 51). Nous avons dû déterminer des conditions pour lesquelles l’interaction entre la protéine solubilisée et la matrice était efficace. Tout d’abord, nous avons fait passer trois fois successivement l’échantillon de protéines membranaires solubilisées au travers d'une colonne contenant la matrice d'affinité préalablement équilibrée dans un milieu contenant les mêmes concentrations de détergents que celles utilisées pour la solubilisation des protéines. Dans ces conditions, la majeure partie des protéines d’intérêt ne s’accrochait pas à la matrice. L’interaction entre les protéines solubilisées et la matrice d'affinité a été plus efficace lorsque nous les avons co-incubées pendant trois heures, cependant le rendement de purification n’était toujours pas satisfaisant. D’après les données du fournisseur, une concentration de détergent trop élevée dans la solution peut inhiber l’interaction entre la matrice et la protéine cible. Afin de diminuer la concentration de détergent présent dans la fraction de protéines solubilisées, nous avons dilué l’extrait de protéines membranaires solubilisées d’un facteur 10
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118 afin d'obtenir une concentration finale de DDM de 0,1 % (p/v). Cet extrait est ensuite déposée sur une colonne contenant la matrice d'affinité avec un système de circuit fermé (utilisant une pompe péristaltique) permettant une re-circularisation de l’extrait protéique sur la nuit. Ce protocole de purification a permis d'améliorer la fixation des protéines d'intérêt sur la matrice et ainsi augmenter le rendement de purification.
Figure 51: Purification de HMA1, PAA1 et HMA1 AKT.
Les purifications de HMA1, PAA1 et de HMA1- AKT (A, B et C respectivement) sont effectuées en utilisant une matrice de sépharose Strep- Tactin. Les milieux utilisés contiennent du TCEP 100 µM et du DDM 0,1 % (p/v). Les protéines solubilisées (L) sont incubées sur la nuit avec la matrice. Après une étape de rinçage de la matrice, les protéines fixées à la matrice sont éluées par ajout de desthiobiotine. F : fraction de protéines non retenues, W : lavage, E1 à E5 : fractions d’élutions. Les fractions (10 µL pour les fractions L, F et W, 20 µL pour les fractions d’élution E1 à E5) sont analysées par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie.
L’analyse par immunomarquage des différentes fractions obtenues lors de la purification des deux ATPases indique que les protéines d’intérêt sont majoritairement retenues sur la résine Strep-tactin et qu'elles ne sont pas éluées lors des étapes de lavage (non montré). L'analyse des profils protéiques des fractions L et F (Figure 51) montre en revanche que la majeure partie des protéines solubilisées n'est pas retenue sur la résine. Les protéines d’intérêt sont éluées après ajout de desthiobiotine. D’après la figure 51, le rendement de purification est de
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119 l’ordre de 30 % pour HMA1 (Figure 51, A) et de 10 % pour PAA1 et HMA1-AKT (Figure 51, B et C). Bien que ces protéines ne soient pas purifiées à homogénéité, leur facteur d’enrichissement dans les fractions d’élutions est très élevé (de l’ordre de 80 %). Les quantités obtenues ainsi que le niveau de pureté de HMA1 et de PAA1 sont compatibles avec une caractérisation biochimique. A partir d'un litre de culture, nous pouvons donc obtenir 90 à 300 µg de HMA1 et de 30 à 90 µg de protéine PAA1 et HMA1-AKT.
C. Conclusion
Nous avons réussi à déterminer des conditions de solubilisation et de purification de la protéine HMA1 (à partir de membranes de Lactococcus) qui permettent d'obtenir des quantités de protéine compatibles avec des analyses biochimiques. Nous avons montré que ces protocoles peuvent s’appliquer aussi aux protéines PAA1 et HMA1-AKT avec des rendements de solubilisation et de purification similaires. Lors de l'optimisation de ces protocoles, nous avons dû minimiser les étapes ou conditions qui pouvaient induire une dénaturation des protéines, comme par exemple des concentrations trop élevées de détergent ou encore l'étape de sonication des membranes utilisée à l’origine pour augmenter le rendement de solubilisation.
IV. CONCLUSION - DISCUSSION
Lactococcus lactis s'avère être un système d’expression efficace pour la production de protéines membranaires de plantes. D'après les données disponibles dans la littérature, c’est la première fois que des ATPases de type P1B de plantes sont produites, sous forme mature, dans
un système procaryote et avec un taux de production compatible avec des analyses biochimiques. A ce jour, seule la partie C-terminale de HMA2 a été produite en système procaryote (Eren & Arguello, 2004). L'expression de l'ATPase AtHMA4 permet de complémenter le mutant de E. coli zntA, mutant qui est affecté dans l'export de zinc (Mills et al., 2003). AtHMA4 est donc exprimée chez E. coli, cependant, aucune autre étude n'a ensuite été réalisée sur la protéine recombinante produite, suggérant que le rendement de production obtenu était probablement insuffisant pour réaliser des études biochimiques.
Les problèmes d'expression de ce type de protéines chez E. coli peuvent provenir de leur toxicité lorsqu'elles sont exprimées dans la bactérie. Cette toxicité peut résulter de la présence d’une quantité importante de protéines dans la membrane et/ou de l'impact de ces ATPases sur l'homéostasie des cations dans la cellule. Les rendements de production que nous avons obtenus (0,2 à 3 %) sont similaires à ceux obtenus par Kunji et collaborateurs (2003) pour l'expression de protéines membranaires eucaryotes. A partir d'un litre de culture, nous obtenons 30 mg de protéines membranaires contenant 300 à 900 µg de protéine recombinante. Les ATPases HMA1, HMA3 et HMA4 ont toutes les trois été exprimées dans le système eucaryote levure (Gravot et al., 2004; Verret et al., 2004 ; Seigneurin-Berny et al., 2006).
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120 Cependant, dans ce système, elles ne sont pas produites en quantité suffisante pour effectuer ensuite des analyses biochimique et structurales. Ainsi, Lactococcus est donc un système approprié pour l'expression de ce type de protéines.
D'après Mierau & Kleerebezem (2005), la probabilité d'exprimer une protéine recombinante en système hétérologue est d'autant plus importante que le contenu en GC du gène correspondant est proche de celui des gènes de l’hôte. Les rendements de production obtenus pour les protéines membranaires d'Arabidopsis résultent peut être de contenu similaire en GC entre les génomes d'A. thaliana (36 % ; The AGI, 2000) et de L. lactis (35 % Schleifer et al., 1985).
Les quantités de protéines recombinantes obtenues étaient compatibles avec leur purification. Nous avons donc dû optimiser les conditions de solubilisation de ces protéines afin de pourvoir les purifier. Ces ATPases appartiennent à la famille des ATPases de type P dont certaines ont été bien étudiées comme l'ATPase calcium SERCA, caractérisée biochimiquement et cristallisée après expression en système hétérologue levure (Marchand et al., 2008). Les détergents utilisés pour la solubilisation de cette ATPase sont le DDM et/ou le C12E8 qui n'altèrent pas l'intégrité et l'activité de cette protéine (Jidenko et al., 2005). La
combinaison de ces deux détergents nous a permis de solubiliser HMA1 et PAA1 avec un rendement de plus de 90 %. La purification par affinité de ces protéines a ensuite été réalisée grâce à la présence de l’étiquette Strep-tag II placée en C-terminal des protéines. A notre connaissance, c’est la première fois que des ATPases de type P1B issues de plante sont
purifiées sous forme mature. La littérature fait référence de la purification de HMA4 de T. caerulescens (Parameswaran et al., 2007). Cependant les auteurs ont purifié une ATPase composée de deux fragments suggérant que cette protéine subit un clivage post traductionnel in planta. Après optimisation des conditions de purification, nous arrivons à obtenir entre 90 à 300 µg de protéines HMA1. Bien que la protéine ne soit pure qu'à 80 %, ces fractions peuvent être utilisées pour des analyses biochimiques ainsi que pour des premiers essais de cristallisation. Les protocoles et les techniques mises au point pour l’expression de protéines membranaires chez L. lactis ont fait l’objet d’un chapitre d’ouvrage (Frelet-Barrand et al., 2009) et les résultats obtenus pour l’expression de diverses protéines membranaires chez L. lactis a fait l’objet d’un article scientifique (Frelet-Barrand / Boutigny et al., soumis). De plus, le savoir-faire acquis pour l’expression de protéines membranaires chez L. lactis, la lyse des bactéries, la purification des membranes, la solubilisation et la purification des ATPases de type P1B fait l’objet d’un transfert de compétence vers d’autres laboratoires impliqués dans le
programme CEA-PM, et en particulier le laboratoire d’Alain Vavasseur (iBEB/LEMS) du CEA de Cadarache.